制剂、纳米药物、纳米颗粒及其制备方法、应用与流程

制剂、纳米药物、纳米颗粒及其制备方法、应用
1.本申请主张于2020年05月08日提交的中国专利申请(申请号：2020103847922)的优先权，该专利申请以全文被引入的方式整体并入本申请。
技术领域
2.本申请涉及医药领域，具体而言，涉及一种制剂、纳米药物、纳米颗粒及其制备方法、应用。


背景技术：

3.纳米药物一般通过载体装载小分子药物构建。其中的载体例如是微囊、微球、纳米粒、脂质体。载体性质稳定，有利于递送、缓释药物等。然而，载体通常都是不具有药物活性的物质，且其还可能存在有害的代谢产物，因此存在远期的安全性问题。
4.有鉴于此，提供一种不含载体的纳米药物具有重要的意义。


技术实现要素：

5.基于上述的不足，本申请提供了一种制剂、纳米药物、纳米颗粒及其制备方法、应用，以实现非载体形态用药且具有利于使用的优点。
6.本申请是这样实现的：
7.在第一方面，本申请示例提供了一种纳米颗粒，其是配位结合有金属离子的双硫仑和/或其衍生物。
8.纳米颗粒可以获得相对较好的水溶性。当其应用于药物时可以改善其药代动力学特性和控制释放速度。同时，由于其纳米尺度特点，可以借助于病灶的高通透性和滞留效应，而能够在病灶内聚集和滞留，从而提高病灶内药物的浓度，改善治疗效果。
9.本申请示例中纳米颗粒至少具有下述提及的特点。
10.(1)双硫仑或其衍生物和金属离子通过自组装形成具有强抗肿瘤作用的纳米颗粒。其不需要额外的有机或无机载体材料，避免了使用药物载体材料所带来的生物安全性问题，有利于纳米颗粒用于临床肿瘤治疗。
11.(2)双硫仑在水溶液中的溶解性差。相比于双硫仑或其衍生物，双硫仑或其衍生物和金属离子形成的纳米颗粒在水中的分散性更高。
12.(3)由于是通过配位键结合形成的纳米颗粒形式，其内部的双硫仑及其衍生物更不易与生理溶液接触，从而表现为在生理条件下，双硫仑或其衍生物和金属离子形成的纳米颗粒的稳定性优于双硫仑或其衍生物。具体而言，口服双硫仑主要在胃肠道吸收，随后很快被红细胞中谷胱甘肽还原成其单体二乙二硫氨甲酯，肝脏中也同时进行此反应。其单体在肝中代谢成为葡糖苷酯或甲酯、二硫化碳、二乙胺及硫酸根离子，大多数代谢产物从尿中排出，而二硫化碳由呼吸系统排出。双硫仑或其衍生物与金属离子形成纳米颗粒后，减少内部双硫仑或其衍生物与生理溶液的接触，可以提高双硫仑或其衍生物在生理条件下的化学稳定性。
13.在第二方面，本申请示例提供了一种纳米药物，其包括以无载体形式存在的上述纳米颗粒。
14.在第三方面，本申请示例提供了一种纳米药物。该纳米药物是组合物，且包括纳米颗粒；以及选自由肿瘤靶向分子、肿瘤成像分子和具有肿瘤治疗活性的化合物组成的组中的任意一种或多种。
15.在第四方面，本申请示例提供了一种药物制剂。其包括纳米颗粒；以及药用载体和辅料中任意一种或两种。
16.在第五方面，本申请示例提供了一种双硫仑在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的应用。其中，双硫仑以上述纳米颗粒或纳米药物的形式存在。
17.在第六方面，本申请示例提供了一种双硫仑在用于成像或在用于制备成像材料中的应用。其中，双硫仑以上述纳米颗粒的形式存在，且纳米颗粒修饰有磁共振成像分子、光学成像分子、ct成像分子或核素成像分子。
18.在第七方面，本申请示例提供了一种纳米颗粒的制备方法。其中该纳米颗粒是配位结合有金属离子的双硫仑或其衍生物的集合体。制备方法包括：以金属离子作为诱导剂，使双硫仑及其衍生物通过与所述金属离子的配位反应而发生自组装。
附图说明
19.为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
20.图1是本申请实施例1中第1组实验双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒的透射电子显微镜图片；
21.图2是本申请实施例1中第1组实验双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒分散于水溶液中的光学照片；
22.图3是本申请实施例1中第6组实验双硫仑和钯离子组成的纳米颗粒的透射电子显微镜图片；
23.图4是本申请实施例2中第3组实验双硫仑衍生物二甲基二硫代氨基甲酸钠水合物和铜离子组成的纳米颗粒的透射电子显微镜图片；
24.图5是本申请实施例2中第5组实验双硫仑衍生物吡咯烷二硫代氨基甲酸铵和铜离子组成的纳米颗粒的透射电子显微镜图片；
25.图6是本申请实施例4中双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒、双硫仑乙醇溶液和cu
2+
水溶液的紫外
‑
可见吸收光谱；
26.图7是本申请实施例7中双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒的x射线衍射图谱；
27.图8是本申请实施例9中表面修饰修饰二氢卟吩e6的纳米颗粒的荧光照片；
28.图9是本申请实施例10中双硫仑、双硫仑衍生物吡咯烷二硫代氨基甲酸铵和铜离子组成的纳米颗粒的透射电子显微镜图片；
29.图10示出了对荷瘤裸鼠进行不同处理的情况下肿瘤相对体积随时间的变化情况图；
30.图11示出了各荷瘤裸鼠同一时间(天)的肿瘤组织图。
具体实施方式
31.肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病。在肿瘤的治疗过程中，通常会选择使用化疗。并且，还会结合使用小分子化合物作为化疗药物。然而，这类药物大多存在血液半衰期短的缺陷，且不具备肿瘤靶向能力，还对健康组织有较大的副作用。
32.作为一种代替或减轻上述小分子药物的缺点的方案，纳米药物在肿瘤治疗领域展现出广阔的发展前景。纳米尺度的特性赋予了纳米药物特殊的性能，例如：
33.一方面，纳米药物可以有效提高小分子药物的水溶性、改善小分子药物的药代动力学参数、控制药物释放速度、减少药物毒副作用。
34.另一方面，纳米药物可以通过肿瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention，epr)而聚集并滞留在病灶内，从而有效提高病灶中的药物浓度，进而提高治疗疗效。
35.就发明人所知，目前在临床中广泛使用且表现突出的纳米药物无一不是利用不具有药物活性作用的材料(如脂质体、白蛋白)为载体，通过装载活性抗肿瘤药物分子制备而成。通过引入载体，延长纳米药物中的活性成分的血液循环时间、减少副作用。例如，用于肿瘤治疗的脂质体阿霉素、脂质体正定霉素、脂质体阿糖胞苷、脂质体长春新碱和白蛋白紫衫醇等纳米药物。
36.然而，现实是上述的纳米载体材料通常不具有抗肿瘤作用，并且还存在潜在的人体代谢风险和长期安全性问题，从而严重阻碍了纳米药物的临床转化应用。换言之，研究者试图通过使用载体担载活性成分，使其生物利用度增加、减少其副作用。然而，载体的使用也同时带来了如活性成分含量低、远期的载体风险等问题。
37.因此，尽量降低甚至不用载体材料构筑纳米药物具有十分重要的意义。目前，缺少相关研究内容。发明人创造性地采取将抗肿瘤药物自发组装成为纳米颗粒的技术方法。该方法不需借助载体，因此药物中的活性成分的含量更高，也可以避免载体带来的长期毒性或潜在风险。
38.基于此，发明人经过研究提出了一种可以不使用载体而进行给药的纳米药物。该纳米药物可以直接使用由活性药物分子制作的纳米颗粒。这样一种纳米药物主要以双硫仑作为活性成分。
39.双硫仑(disulfiram，dsf)，又名双(二乙基硫代氨基甲酰)二硫化物、戒酒硫，被广泛用以治疗酗酒症。近年来的研究表明，双硫仑还对乳腺癌、鼻咽癌、直肠癌、宫颈癌、脑胶质瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、前列腺癌等肿瘤具有显著的抗肿瘤活性。双硫仑可以通过产生活性氧物种引起肿瘤细胞凋亡，通过抑制蛋白酶体活性抑制肿瘤生长，通过抑制p
‑
糖蛋白(p
‑
gp)活性逆转肿瘤耐药性。此外，双硫仑还能通过抑制肿瘤干细胞的更新、增殖和侵袭，诱导肿瘤细胞周期阻滞，抑制aldh、nf
‑
kb活性，抑制肿瘤血管生成等发挥抗癌作用。
40.然而，双硫仑难溶于水，并且在血液中的半衰期短、体内稳定性差、肿瘤组织富集量低等难题限制了双硫仑充分发挥抗肿瘤作用。由于双硫仑的上述问题，其生物利用度低且难以被递送至病灶。
41.为了应对上述问题，一些尝试方案被实施，例如，使用特殊的递送系统进行给药。目前，利用脂质体、嵌段聚合物、金属有机框架、介孔氧化硅、金属氧化物等纳米材料为载体，制备了负载双硫仑的纳米药物。但是，以上方法都需要引入非药物成分的材料作为纳米载体，在实际的临床应用存在很大障碍。
42.如上述，有别于目前的常规手段，本申请中，选择对双硫仑进行改造，使其在不使用载体的情况下，仍然可以提供可观的稳定性、溶解度和病灶聚集量(如肿瘤组织富集量高)的特点。其中，溶解度主要是指改造后的双硫仑在水(温度可以控制在37摄氏度左右)中的溶解度，实践中，其在水溶液中的浓度可以达到2％(w/w)以上，如2％、3％、5％、7％、10％、15％等等。
43.此外，经过实验验证，经过改造的双硫仑(经金属离子诱导的双硫仑自组装形成的纳米颗粒)其血液循环时间相比于纯双硫仑或其衍生物明显改善(循环时间延长)。这可能是由于经过改造的双硫仑的稳定性高，不容易被代谢。即本申请中记载的双硫仑或其衍生物和金属离子组成的纳米颗粒具有高于双硫仑在生理环境中的稳定性。作为对比，口服双硫仑主要在胃肠道吸收，随后很快被红细胞中谷胱甘肽还原成其单体二乙二硫氨甲酯，肝脏中也同时进行此反应。其单体在肝中代谢成为葡糖苷酯或甲酯、二硫化碳、二乙胺及硫酸根离子，大多数代谢产物从尿中排出，而二硫化碳由呼吸系统排出。
44.示例中通过选择使用金属离子对双硫仑进行改造。即通过引入金属离子，使其与双硫仑发生配位反应。其中，金属离子提供配位反应的中心原子；双硫仑及其衍生物提供配位反应的配位。其中，双硫仑及其衍生物中分子结构中的氮原子和硫原子为主要的配位原子，因此其也是一种多齿配体。
45.由于配位反应的作用，双硫仑分子被金属离子所诱导而进行自组装，形成纳米尺度的颗粒，因此也被称之为纳米颗粒。上述这种自组装结构可以是随机的，即一个金属离子配位的双硫仑(包括其衍生物)分子数目以及与双硫仑结合的原子位置，以及一个双硫仑分子配合的金属离子的数量及其配位的原子位置都是任选的。对于dsf
‑
cu而言，配位分子数目和位置是比较确定的，而对其它金属离子而言，配位分子数目和位置可以存在一定的波动。自组装结构也可以是固定的，即配位分子数目和位置是确定的。配位方式根据双硫仑及其衍生物的具体结构和金属离子的种类而有所区别。控制自组装过程的条件(如温度)，从而可以经该自组装过程可以获得有序的结构的纳米颗粒，并且该有序结构还可能赋予其在溶液如血液中的稳定性。换言之，通过上述自组装过程可以获得具有晶体结构的纳米颗粒。
46.一般地，将纳米颗粒的粒度限制在1000nm以内。纳米颗粒是指至少一个维度小于1000nm的任何颗粒，例如约1nm至500nm。当纳米颗粒为球体时，上述的维度就是其直径。当纳米颗粒为圆柱状结构时，且上述的维度包括其高度和底面直径。当纳米颗粒为块体结构时，且上述的维度包括其长度、高度、宽度和对角线长度。
47.示例性地，纳米颗粒至少一个维度小于约800纳米，或纳米颗粒至少一个维度小于约600纳米，或纳米颗粒至少一个维度小于约500纳米，或纳米颗粒至少一个维度小于约400纳米，或纳米颗粒至少一个维度小于约300纳米，或纳米颗粒至少一个维度小于约200纳米，或纳米颗粒至少一个维度小于约150纳米，或纳米颗粒至少一个维度小于约100纳米，或纳米颗粒至少一个维度小于约30纳米，或纳米颗粒至少一个维度小于约10纳米，或纳米颗粒至少一个维度小于约5纳米，或纳米颗粒至少一个维度小于约3纳米，或纳米颗粒至少一个
维度小于约2纳米。
48.当纳米颗粒为球体时，其尺寸可以限制为直径达到约300nm至约750nm，或约8nm至约80nm。当纳米颗粒为圆柱体时，其尺寸可以限制为直径约130nm至约380nm且长度约300nm至约2000nm，或者直径约50nm至约190nm且长度约100nm至约1800nm。
49.双硫仑分子自组装的内在原因在于：双硫仑分子结构中含有硫元素和氮元素，而硫元素和氮元素具有孤对电子，可以与过渡金属离子发生配位作用。配位作用使各独立存在的双硫仑分子相互聚集、靠近，从而组装为大尺度的颗粒物。
50.通过上述方式，小分子化合物双硫仑进行组装至纳米尺度，并因此具有纳米材料的特性，例如双硫仑不快速分解，代谢速度减慢，从而可以延期其血液循环时间，进而可以增加肿瘤摄取。同时，由于金属离子的引入，可以达到协同增效的作用，从而提高双硫仑的抗肿瘤效果。
51.其中，双硫仑还可以是以衍生物或者是药学上可接受的盐的形式存在。示例性地，双硫仑衍生物具有如式i的结构，式i。其中，r选自烷基、环烷基、哌啶基或吡咯烷基。
52.或者，双硫仑衍生物具有如式ii的结构；式ii。其中，r2选自烷基、环烷基、哌啶基或吡咯烷基，r1选自异丙基(i
‑
pr)、正丁基(n
‑
bu)、异丁基(i
‑
bu)、正己基(n
‑
hex)、环己基(cyclohexyl)、羟乙基(ch2ch2oh)、4
‑
苯甲酸基(4
‑
c6h4co2h)、氢、烷基、钠、钾或铵(nh4)；
53.或者，双硫仑衍生物具有如式iii的结构式iii。其中，r4选自氢、烷基、环烷基、哌啶基或吡咯烷基，r3选自氢、烷基、钠、铵、氰甲基或甲基。
54.或者，双硫仑衍生物是双硫仑的代谢产物或二乙基二硫代氨基甲酸或二乙基二硫代碳酸酯(ddc)或其代谢物。
55.作为一些可替代的具体示例，双硫仑衍生物包括但不限于二乙基二硫代氨基甲酸钠、甲基二硫代氨基甲酸钠、二甲基二硫代氨基甲酸钠、二硫代氨基甲酸铵、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵、双(二哌啶基硫代氨基甲酰)二硫化物、双(二吡咯烷基硫代氨基甲酰)二硫化物、二硫代氨基甲酸硫醇、二乙基二硫代氨基甲酸、二乙基二硫代氨基甲酸酯中的一种或多种。
56.其中的金属离子主要是指过渡金属(transition metals)的离子。过渡金属包括指元素周期表中d区与ds区(d区元素包括周期系第iiib～viib、viii族的元素。ds区包括周
期表第ib～iib族元素。)示例性地，过渡金属离子包括但不限于铜离子、铁离子、锌离子、金离子、铂离子、钯离子、铑离子中的一种或多种。或者，还可以根据需要选择稀土金属离子。简言之，纳米颗粒中的金属离子也可以是指稀土金属(rare
‑
earth metals)的离子。示例性地，稀土金属离子包括但不限于铈离子。
57.如前述的纳米颗粒具有水溶性(在水中的溶解度高)、在人体内循环周期长、能够在肿瘤细胞和组织中高度富集，并且鉴于双硫仑的生物活性，纳米颗粒可以在多种领域表现应用价值，且其可以独立地或与其他物质组合(如用于治疗肿瘤的其它治疗活性化合物、肿瘤靶向分子、肿瘤成像分子)而被应用。不同实例中，双硫仑或其衍生物和金属离子组成的纳米颗粒表面可以通过共价键、配位作用、静电作用修饰多肽、蛋白、核酸、糖类、抗体和其它肿瘤靶向分子。
58.纳米颗粒可以表现出抗肿瘤特性，因此其可以被应用于制作抗肿瘤药物。前述的“抗肿瘤特性”例如是治疗、减轻、改善、缓解肿瘤、延缓肿瘤的发病、抑制肿瘤进展、降低肿瘤的严重程度和/或减少肿瘤的一种或多种症状。
59.其潜在适用的肿瘤疾病包括恶性肿瘤和恶性肿瘤干细胞增殖。其中的恶性肿瘤例如包括但不限于乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、直肠癌、宫颈癌、脑胶质瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、肾脏癌、骨癌、中枢神经系统癌症、甲状腺癌、膀胱癌和子宫内膜癌。
60.因此，可以基于由纳米颗粒制备的无载体纳米药物或者与药用载体或其他物质制作的相应制剂进行肿瘤疾病的治疗。相应地，对患者施用有效剂量的纳米药物或制剂。计划地：针对复发性或转移性乳腺癌患者，治疗方法：剂量50mg/m3，静脉输注30
‑
40min，每28天重复给药，针对胃癌患者，治疗方法：5mg/m3，每隔一日一次口服给药，21天为一个周期。
61.其中“有效剂量”是指所应用的纳米药物的剂量，在治疗受试者的肿瘤时是有效的。或者也可以认为是：相关化合物(纳米药物)或制剂的剂量足够，从而可使受试者被施用后减轻、改善、缓解一种或多种疾病症状或生理状况或病因或刻意地改变其他生理系统。
62.进一步地，由双硫仑和金属离子配位而组装形成的纳米颗粒还表现出在抗菌和病毒防治方面的应用潜力。例如，一些试验中，该纳米颗粒对于冠状病毒具有一定的杀灭效果。一些试验中，该纳米颗粒对于细菌具有一定的杀灭效果。
63.此外，该纳米颗粒表现出在医学成像领域的潜在应用价值。例如，通过在纳米颗粒表面修饰成像分子。其中成像分子可以通过例如原子交换、共价键作用、配位键作用或静电作用而结合在纳米颗粒上。其中的成像分子可以包括核素、磁共振成像分子、光声成像分子和光学成像分子，如：cu
64
、f
18
‑
fdg、gd
‑
dtpa、gd、吲哚菁绿(icg)、异硫氰酸荧光素(fitc)、二氢卟吩e6。
64.由于双硫仑的靶向作用，其能够在肿瘤细胞、组织中富集，从而将成像分子也富集在病灶，因此可以通过相应的成像技术进行成像，以观察病灶。其中的成像分子例如可以为磁共振成像分子、光学成像分子、ct成像分子或核素成像分子。
65.相应地，本申请中提出了双硫仑在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的应用和在用于成像或在用于制备成像材料中的应用。应当理解的是，其中的“双硫仑”表示的是前述的双硫仑及其衍生物通过与金属离子配合形成的纳米颗粒。另外，这样的纳米颗粒既可以作为纯净物被使用，也可与各种被适当选择的物质形成组合物而使用。换言之，作为一种产
品，纳米颗粒既可以是一种具有单一成分的物质，也可以与其他物质组成的组合物。因此，所述的产品可以是纳米颗粒、纳米颗粒组合物、纳米药物或纳米药物组合物等等。
66.虽然本申请中的纳米颗粒可以在不使用载体(无生物活性)的情况下被应用，即作为具有一种或多种鉴于生物活性的物质(如对相同疾病状态具有活性的治疗剂)使用，但是这并非意在限制其只能在无载体的情况下使用。例如，在纳米颗粒组合物和纳米药物组合物中，除了包括无生物活性的物质之外，还可以使用其他物质，例如，药学上可接受的药用载体、辅料。或者，除此之外，还可以使用缓冲体系、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。
67.其中术语“生物活性”是指这样的一种物质，当其被施用给受试者时，其向所述患者提供有益效果或受试者表现出有益的反馈。这样一类物质例如可以是大分子物质如蛋白、抗体、肽、核苷酸，或小分子药物，等等。其既可以是通过人工合成制得的，也可以是天然源的(人工提取)或重组产生。生物活性物质可为生物活性物质的类似物、衍生物、激动剂、拮抗剂、对映异构体或配药学上可接收的盐。
68.作为实例，治疗肿瘤的其它治疗活性化合物包括但不限于阿霉素、紫杉醇、喜树碱、培美曲塞、多西他赛、吉西他滨、顺铂、卡铂、奈达铂、伊立替康、依托泊苷、奥沙利铂、博来霉素、氟尿嘧啶、雷替曲塞、卡培他滨、替吉奥、二氢卟吩e6。
69.作为示例，药用载体包括但不限于固体稀释剂、无菌水溶液和各种有机溶剂。液体载体包括但不限于水、碘油、糖浆、麻油、豆油、橄榄油、花生油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、磷脂、脂肪酸和脂肪酸胺。固体载体包括但不限于淀粉、糊精、糖粉、预胶化淀粉、乳糖、蔗糖、壳聚糖、右旋糖酐、甘露醇、纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、轻质氧化镁、碳酸钙、胆固醇、硬脂酸、聚维酮和聚丙烯酸树脂。相应地，根据药用载体的不同，纳米颗粒组合物和纳米药物组合物也可以通过不同的剂型被制作为相应的制剂和使用。例如液体剂型、固体剂型、气体剂型。其中的液体剂型可以是饮料、糖浆、悬浮液、乳液、酊剂、酏剂等等，如用糖浆制备的液体剂型，每瓶100ml，每瓶中含有有效活性纳米药物50mg。其中的固体剂型可以是锭剂、胶囊、囊剂、粉末等，如用碳酸钙制备的固体剂型，每瓶20片，每个药片重125mg，其中有效的活性纳米药物为10mg，碳酸钙115mg。其中的气体剂型例如是气雾剂、喷雾剂等等。
70.此外，所述的药物组合物可以通过本领域已知的任何方式向受试者给药，例如包括口服、静脉内注射或经导管动脉给药等。术语“受试者”包括人类和非人类。非人类包括例如小鼠、大鼠、兔子、狗、猪、猴子。
71.为了使本领域技术人员更易于实施本申请，以下就示例中的纳米颗粒进行说明。
72.纳米颗粒的制备方法包括：以金属离子作为诱导剂，使双硫仑及其衍生物通过与金属离子的配位反应而发生自组装。其中的纳米颗粒是指配位结合有金属离子的双硫仑和/或其衍生物的集合体。即，纳米颗粒可以是配位结合有金属离子的双硫仑的集合体；或者，纳米颗粒是指配位结合有金属离子的双硫仑衍生物的集合体；或者，纳米颗粒是指配位结合有金属离子的双硫仑和配位结合有金属离子的双硫仑衍生物的集合体。
73.一种可选方案中，诱导双硫仑及其衍生物的方法可以是：使金属离子、双硫仑或其衍生物在液体中相互接触，通过配位作用反应以获得液体反应物。然后，从液体反应物中分离固体。再对固体进行纯化或干燥。所获得固体颗粒物(粉末)可以通过适当的其他处理手段而被使用以制作各种不同形式的药物剂型和其他的功能物质(如前述的成像材料)。
74.其中，使金属离子、双硫仑或其衍生物在液体中相互接触的方法例如可以是分别含金属离子的化合物的第一分散液和含双硫仑或其衍生物的第二分散液；然后将两者进行混合。
75.根据不同的双硫仑及其衍生物的结构以及金属离子种类和分散剂的不同，两分散液的混合和反应温度、时间有不同的选择。在本申请实例中，第一分散液和第二分散液在0～200℃(或10～170摄氏度、或30～150摄氏度、或50～110摄氏度、或70～90摄氏度)的温度下混合且反应1至24小时(或3～20小时、或5～18小时、或9～12小时)。
76.与之相应地，用以配制第一分散液中的分散剂被选择为极性溶剂，例如包括水、乙醇、丙酮中的一种或多种。用以配制第二分散液中的分散剂被选择为水溶性的有机溶剂，例如包括醇、酮或酰胺。其中的醇如乙醇，酮如丙酮，酰胺如二甲基甲酰胺。
77.纳米颗粒中，双硫仑(包括其衍生物)与金属离子的相对含量可以通过对第一分散液和第二分散液的浓度控制而实现。例如，在第一分散液中，金属离子的浓度为0.2～50mm。第二分散液中，双硫仑及其衍生物的浓度为1～34mm。
78.以下结合具体实施例对本申请中的纳米颗粒进行说明。
79.实施例1
80.双硫仑与不同金属离子组成的纳米颗粒的制备。
81.步骤一、将双硫仑溶解于乙醇，制得含有双硫仑的乙醇溶液。双硫仑溶液浓度和溶剂体积见表1。
82.步骤二、分别将二水合氯化铜、六水合氯化铁、氯化锌、四水合氯金酸、六水合氯铂酸、四氯钯酸钠或六氯铑酸钠溶于去离子水各自形成含金属离子的水溶液。双硫仑溶液浓度、金属离子浓度和溶剂体积见表1。
83.步骤三、将双硫仑溶液和金属离子水溶液混合，在50℃水浴中恒温静置24h。
84.步骤四、将步骤三中的反应产物在10000rpm的转速下离心10min，固体用乙醇洗涤3次，真空干燥得到最终产物。
85.其中第1组实验双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒的透射电子显微镜图片由图1公开；第1组实验双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒分散于水溶液中的光学照片由图2公开；第6组实验双硫仑和钯离子组成的纳米颗粒的透射电子显微镜图片由图3公开。
86.表1原料配比
[0087][0088]
实施例2
[0089]
双硫仑衍生物和铜离子组成的纳米颗粒的制备。
[0090]
步骤一、将双硫仑衍生物溶解于1.8ml乙醇，制得含有双硫仑衍生物的乙醇溶液。双硫仑衍生物的种类和浓度见表2。
[0091]
步骤二、将1mg二水合氯化铜溶于9.6ml去离子水，形成含铜离子的水溶液。
[0092]
步骤三、将双硫仑衍生物溶液和铜离子水溶液混合，在50℃水浴中恒温静置24h。
[0093]
步骤四、将步骤三中的反应产物，在10000rpm的转速下离心10min，固体用乙醇洗涤3次，真空干燥得到最终产物。
[0094]
其中，第3组实验双硫仑衍生物二甲基二硫代氨基甲酸钠水合物和铜离子组成的纳米颗粒的透射电子显微镜图片由图4公开。第5组实验双硫仑衍生物吡咯烷二硫代氨基甲酸铵和铜离子组成的纳米颗粒的透射电子显微镜图片由图5公开。
[0095]
表2.不同双硫仑衍生物与铜离子组装形成纳米颗粒
[0096]
[0097][0098]
实施例3
[0099]
改变双硫仑衍生物和铜离子溶液浓度制备双硫仑衍生物和铜离子组成的纳米颗粒。
[0100]
步骤一、将双硫仑衍生物(二乙基二硫代氨基甲酸钠、二甲基二硫代氨基甲酸钠水合物、甲基二硫代氨基甲酸钠或吡咯烷二硫代氨基甲酸铵)溶解于3.6ml乙醇，制得含有双硫仑衍生物的乙醇溶液。
[0101]
步骤二、将二水合氯化铜溶于18.6ml去离子水，形成含铜离子的水溶液。双硫仑衍生物和铜离子浓度见表3。
[0102]
步骤三、将双硫仑衍生物溶液和铜离子水溶液混合，在50℃水浴中恒温静置24h。
[0103]
步骤四、10000rpm离心10min，乙醇洗涤3次，真空干燥得到最终产物。
[0104]
表3双硫仑衍生物和铜离子浓度
[0105][0106]
实施例4
[0107]
不同双硫仑和铜离子摩尔比制备双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒及紫外
‑
可见光谱测试。
[0108]
步骤一、将双硫仑溶解于乙醇，制得含有双硫仑的乙醇溶液。双硫仑溶液浓度和溶剂体积见表1。
[0109]
步骤二、分别将二水合氯化铜溶于去离子水形成含铜离子的水溶液。双硫仑溶液浓度、金属离子浓度和溶剂体积见表1。
[0110]
步骤三、将双硫仑溶液和金属离子水溶液混合，在50℃水浴中恒温静置24h。
[0111]
步骤四、将步骤三中的反应产物在10000rpm的转速下离心10min，固体用乙醇洗涤3次，真空干燥得到最终产物。
[0112]
测试dsf乙醇溶液、cu
2+
溶液和产物的紫外
‑
可见吸收光谱(图6)。结果显示，1
‑
3号实验组的产物在约400
‑
500nm处出现新的吸收峰，说明dsf和铜离子发生配位。
[0113]
双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒、双硫仑乙醇溶液和cu
2+
水溶液的紫外
‑
可见吸收光谱由图6公开。
[0114]
表4.原料配比
[0115][0116][0117]
实施例5
[0118]
双硫仑溶于不同溶剂，制备双硫仑或其衍射物和铜离子组成的纳米颗粒。
[0119]
步骤一、9mg双硫仑溶于1.8ml乙醇、丙酮或二甲基甲酰胺。
[0120]
步骤二、20mg二水合氯化铜溶于20ml去离子水。
[0121]
步骤三、将配置的双硫仑溶液和氯化铜水溶液混合均匀后，在50℃水浴中恒温静置8h。
[0122]
步骤四、3000rpm离心10min，乙醇洗涤3次，真空干燥得到最终产物。
[0123]
实施例6
[0124]
在不同反应温度和不同反应时间条件下制备双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒。
[0125]
步骤一、9mg双硫仑溶于1.8ml乙醇、丙酮或二甲基甲酰胺。
[0126]
步骤二、20mg二水合氯化铜溶于20ml去离子水。
[0127]
步骤三、将配置的双硫仑溶液和氯化铜水溶液混合均匀后，利用不同的反应条件(如表4所示)，制备纳米颗粒。
[0128]
步骤四、3000rpm离心10min，乙醇洗涤3次，真空干燥得到最终产物。
[0129]
表4.不同反应条件制备双硫仑和铜离子形成的纳米颗粒
[0130][0131][0132]
实施例7
[0133]
测试双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒的晶体结构和纳米颗粒中cu离子含量。
[0134]
步骤一、将100mg双硫仑溶解于20ml乙醇，制得含有双硫仑的乙醇溶液。
[0135]
步骤二、将400mg二水合氯化铜溶于400ml去离子水形成含金属离子的水溶液。
[0136]
步骤三、将双硫仑溶液和金属离子水溶液混合，在30℃水浴中恒温静置24h。
[0137]
步骤四、将步骤三中的反应产物在10000rpm的转速下离心10min，固体用乙醇洗涤3次，真空干燥得到双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒。
[0138]
步骤五、使用x射线衍射仪测试双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒的晶体结构。x射线衍射图谱显示双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒具有多个强衍射峰(图7)，表明双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒具有晶体结构。
[0139]
步骤六、称0.7mg双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒，用0.5毫升浓硝酸溶解，用1％的硝酸溶液稀释定容到50毫升。
[0140]
步骤七、使用原子吸收分光度计测试溶液中铜离子浓度，计算双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒中的cu离子含量。测试结果表明双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒中的cu离子的质量百分比约15.3
‑
18.4％。
[0141]
实施例8
[0142]
双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒表面修饰巯基聚乙二醇。
[0143]
将10mg双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒分散于10ml乙醇中，加入10μl浓度为1mg/ml的巯基聚乙二醇(分子量为2000)，室温静置10h，离心，水洗3次，获得表面修饰巯基聚乙二醇的纳米颗粒。
[0144]
实施例9
[0145]
双硫仑和铑离子组成的纳米颗粒修饰具有光学成像和光动力治疗功能的分子二氢卟吩e6。
[0146]
将400μl浓度为0.36mg/ml的双硫仑和铑离子组成的纳米颗粒与200μl浓度为10mg/ml的二氢卟吩e6混合，室温摇晃过夜，离心，水洗3次，获得表面修饰具有光学成像和光动力治疗功能的分子二氢卟吩e6的纳米颗粒。表面修饰修饰二氢卟吩e6的纳米颗粒的荧光照片由图8公开。
[0147]
实施例10
[0148]
双硫仑、双硫仑衍生物和铜离子形成纳米颗粒。
[0149]
步骤一、将2.5mg双硫仑和0.5ml双硫仑衍生物(二乙基二硫代氨基甲酸钠、二硫代氨基甲酸铵、二甲基二硫代氨基甲酸钠、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵、甲基二硫代氨基甲酸钠或二甲氨基硫代甲酰氯)溶解于0.6乙醇，制得含有双硫仑的乙醇溶液。
[0150]
步骤二、将10mg氯化铜溶于10ml去离子水形成含铜离子的水溶液。
[0151]
步骤三、将含有双硫仑和双硫仑衍生物的乙醇溶液和铜离子水溶液混合，室温静置24h。
[0152]
步骤四、将步骤三中的反应产物在10000rpm的转速下离心5min，固体用乙醇洗涤3次，真空干燥得到最终产物。
[0153]
双硫仑、双硫仑衍生物吡咯烷二硫代氨基甲酸铵和铜离子组成的纳米颗粒的透射电子显微镜图片由图9公开。
[0154]
实施例11
[0155]
双硫仑和稀土金属离子(金属铈离子)形成纳米颗粒。
[0156]
步骤一、将2.5mg双硫仑溶解于0.5乙醇，制得含有双硫仑的乙醇溶液。
[0157]
步骤二、将10mg氯化铈溶于10ml去离子水形成含铈离子的水溶液。
[0158]
步骤三、将双硫仑溶液和铈离子水溶液混合，室温静置24h。
[0159]
步骤四、将步骤三中的反应产物在10000rpm的转速下离心5min，固体用水洗涤1次，真空干燥得到最终产物。
[0160]
试验例1
[0161]
测试双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒对mda
‑
mb
‑
231肿瘤细胞的毒性。
[0162]
mda
‑
mb
‑
231为人乳腺癌细胞，选其做药物的细胞毒性实验，具体的操作如下：
[0163]
1、取对数生长期人乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231，消化转移到96孔板中，细胞的密度在5000个/孔，孵育过夜后用pbs清洗一遍。
[0164]
2、将浓度为40μg/ml的不同药物分别加入到96孔板中，作用24或48h后去除含药的培养基。
[0165]
3、将10％的mtt加入到每个孔中，继续培养4h后加入100μl二甲基亚砜(dmso)，摇床上快速摇晃20min，利用酶标仪测定在570nm和630nm处的吸光度，然后计算细胞的存活率。表5列出了双硫仑和铜离子形成的纳米颗粒与细胞作用不同时间后的细胞存活率。
[0166]
表5.双硫仑和铜离子形成的纳米颗粒与mda
‑
mb
‑
231乳腺癌细胞作用不同时间后的细胞存活率。
[0167][0168]
缩写dsf
‑
cu是指双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒。
[0169]
试验例2
[0170]
测试不同浓度的双硫仑、铜离子及双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒对mcf
‑
7肿瘤细胞的毒性。
[0171]
mcf
‑
7为人乳腺癌细胞，选其做药物的细胞毒性实验，具体的操作如下：
[0172]
1、取对数生长期人乳腺癌细胞mcf
‑
7，消化转移到96孔板中，细胞的密度在5000个/孔，孵育过夜后用pbs清洗一遍。
[0173]
2、将不同浓度的双硫仑、氯化铜及双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒分别加入到96孔板中，作用24后去除含药的培养基双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒的浓度为0、2.5、5、10μg/ml。双硫仑加入量为纳米颗粒中所含双硫仑质量。铜离子加入量为纳米颗粒中所含铜离子质量。
[0174]
3、将10％的mtt加入到每个孔中，继续培养4h后加入100μl二甲基亚砜(dmso)，摇床上快速摇晃20min，利用酶标仪测定在570nm和630nm处的吸光度，然后计算细胞的存活率。表6列出了双硫仑、氯化铜、双硫仑和铜离子形成的纳米颗粒与细胞作用不同时间后的细胞存活率。从表6可以看出，在2.5
‑
10μg/ml的浓度条件下，dsf
‑
cu对肿瘤细胞就表现出显著的抑制效果。而对应的dsf或铜离子对肿瘤细胞生长没有明显抑制。
[0175]
表6.双硫仑、铜离子及双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒与mcf
‑
7乳腺癌细胞孵育24小时后的细胞存活率。
[0176][0177]
缩写dsf
‑
cu是指双硫仑和铜离子组成的纳米颗粒。
[0178]
试验例3
[0179]
测试双硫仑和铂离子组成的纳米颗粒对小鼠三阴性乳腺癌细胞4t1和b.end3小鼠微血管内皮细胞(小鼠正常细胞)的毒性。
[0180]
1、取对数生长期小鼠三阴性乳腺癌细胞4t1和b.end3小鼠微血管内皮细胞，消化转移到96孔板中，细胞的密度在10000个/孔，培养24h。两种细胞培养基都是dmem+10％血清+双抗。
[0181]
2、将浓度为65或130μg/ml的双硫仑和铂离子组成的纳米颗粒加入到96孔板中，作用36h后用pbs清洗1次，去除含药的培养基。
[0182]
3、将10μl mtt(5mg/ml)加入到每个孔中，继续培养4h后，倒掉培养基，加入100μl二甲基亚砜(dmso)，摇晃5min，利用酶标仪测定在570nm和630nm(背景)处的吸光度，然后计算细胞的存活率。表7列出了双硫仑和铂离子形成的纳米颗粒与细胞作用后的细胞存活率。结果表明双硫仑和铂离子形成的纳米颗粒对小鼠三阴性乳腺癌细胞4t1具有高的杀灭效果。
[0183]
表7.双硫仑和铂离子形成的纳米颗粒与小鼠三阴性乳腺癌细胞4t1或b.end3小鼠微血管内皮细胞(小鼠正常细胞)作用36h后的细胞存活率。
[0184][0185]
缩写dsf
‑
pt是指双硫仑和铂离子组成的纳米颗粒。
[0186]
试验例4
[0187]
对药物进行动物实验以验证其效果。
[0188]
实验对象：4～6周龄雌性裸鼠
[0189]
动物模型：在老鼠的右前肢皮下接种乳腺癌mcf
‑
7细胞，且肿瘤体积长到70mm3左右，获得荷瘤裸鼠。
[0190]
试验方法：
[0191]
将荷瘤裸鼠随机分为4组，每组5只鼠。
[0192]
其中，第一组为空白对照组，通过尾静脉注射pbs溶液(磷酸缓冲盐溶液)。
[0193]
第二组为cucl2组，通过尾静脉注射cucl
2 pbs溶液，即磷酸缓冲盐溶液作为溶剂溶解cucl2形成的溶液。
[0194]
第三组为dsf组，通过尾静脉注射dsf pbs溶液，即磷酸缓冲盐溶液作为溶剂溶解dsf形成的溶液。
[0195]
第四组为dsf
‑
cu药物组，通过尾静脉注射药物(dsf
‑
cu)pbs溶液，即磷酸缓冲盐溶液作为溶剂溶解dsf
‑
cu形成的溶液。
[0196]
第二组至第四组的给药浓度分别为14.4mg/kg、65.6mg/kg、80mg/kg；每组小鼠均每周给药2次，给药后观察肿瘤体积变化，结果如图10和图11所示。
[0197]
其中，图10表示了不同时间的相对肿瘤积。图11是同一时间的各组中的各个荷瘤裸鼠的肿瘤的组织图。根据上述图示公开内容可知，通过使用本申请示例中提出的dsf
‑
cu药物可以有效地抑制肿瘤体积，且效果明显地由于单独使用cucl2、单独使用dsf。
[0198]
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。