用于培养可分化细胞的组合物和方法与流程

用于培养可分化细胞的组合物和方法
1.本申请是申请日为2007年2月23日、申请号为200780010554.8、发明名称为“用于培养可分化细胞的组合物和方法”的发明专利申请的分案申请。
2.相关申请的交互参考
3.本申请要求享有于2006年2月23日提交的美国序号60/776,113的优先权，在此引入作为参考。
4.关于联邦政府资助研发的声明
5.在本发明进展期间完成的部分工作使用了国立卫生研究院基金第5 r24 rr021313
‑
05号的美国政府基金。美国政府在本发明中享有一定的权利。
6.发明背景
发明领域
7.本发明涉及细胞培养方法和组合物，其中基本不含血清，而含有基础盐养分溶液和erbb3配体。
8.发明背景
9.人类多能细胞为研究人类发育早期阶段以及某些疾病如糖尿病和帕金森病的治疗性干预提供了独特的机会。例如，使用来源于人类胚胎干细胞(hesc)的可生成胰岛素的β细胞比现有的利用供体胰腺细胞的细胞疗法具有很大的改进。如今治疗糖尿病的细胞疗法使用的是来自供体胰腺的细胞，此方法因缺乏移植所需的高质量胰岛细胞而受限。对一位i型糖尿病患者使用的细胞疗法就需要移植大约8
×
108个胰岛细胞(shapiro等人,2000,n engl j med 343:230
‑
238；shapiro等人,2001a,best pract res clin endocrinol metab 15:241
‑
264；shapiro等人,2001,british medical journal 322:861)。因此，为了获得成功移植所需的足够的胰岛细胞，至少需要两名健康供者的器官。
10.因此，胚胎干细胞(es细胞)代表着用于研究早期胚胎内多能细胞生物学及分化机理的有效的模型系统，以及为哺乳动物的遗传操作及其所带来的商业、医学和农业上的应用提供机会。另外，适当的es细胞增殖和分化也能够潜在地用于产生适合移植治疗因细胞损伤或功能障碍所致疾病的无限的细胞资源。其他多能细胞和细胞系，包括如国际专利申请wo 99/53021中所述的早期原始外胚层样(epl)细胞、体内或体外衍生的icm/上胚层、体内或体外衍生的原始外胚层、原生殖细胞(eg细胞)、畸胎癌细胞(ec细胞)、以及经去分化或核移植衍生的多能细胞，也共有着部分或全部的这些性质和应用性。国际专利申请wo 97/32033以及专利号为5,453,357的美国专利都介绍了多能细胞，包括来源于非啮齿类物种的细胞。国际专利申请wo 00/27995以及专利号为6,200,806的美国专利介绍了人类es细胞，国际专利申请wo 98/43679介绍了人类eg细胞。
11.调节es细胞多能性和分化的生物化学机制还不清楚。然而，可以获得的有限的经验数据(以及非常不确定的证据)提示，在体外培养条件下多能胚胎干细胞的持续维持依赖于胞外环境中细胞因子和生长因子的存在.
12.人类胚胎干细胞为获得大量用于人类细胞疗法的高质量分化细胞提供了原材料
的来源，但是这些细胞必须在那些与临床安全性和有效性管理规范相符合的条件中获得和/或培养。这些规范很可能会要求使用化学成分确定的培养基。开发此种化学成分确定的/gmp标准的条件，对于促进hesc和hesc衍生的细胞在人类治疗用途中的应用是必不可少的。
13.此外，基于hesc的细胞替代疗法的最终应用会要求开发那些能确保符合管理规范的大规模培养和分化条件的方法。尽管有些小组已经报告了简化的hesc生长条件，但这些研究还有着重大的限制。然而迄今为止。多能细胞的成功分离、长期克隆维持、遗传操作以及种系传递都普遍有难度。
14.大多数干细胞培养条件仍在培养基中包含血清替代物(ksr)(xu等人,2005stem cells,23:315
‑
323；xu等人,2005nature methods,2:185
‑
189；beattie等人.,2005stem cells,23:489
‑
495；amit等人.,2004biol.reprod.,70:837
‑
845；james等人.,2005development,132:1279
‑
1282)。ksr包含牛血清白蛋白(bsa)的粗组分而非高度纯化的来源。其他人都只进行了短期的研究，因此还不清楚他们的条件能否长时间保持多能性(sato等人.,(2004)nature med.,10:55
‑
63；美国专利公开nos.2006/0030042和2005/0233446)。还有人在含fgf2、激活蛋白a和胰岛素的化学成分确定培养基中显示出了多能性的长期保持，但其中细胞都是在人血清包被(在细胞平板接种前“洗掉”)的平板上生长(vallier等人.,2005j cell sci.,118(pt 19):4495
‑
509)。尽管fgf2是所有这些培养基的成分，但是还不清楚它是否绝对必要，特别是在某些必须高浓度使用的制剂中(高至100ng/ml,xu等人.,2005nature methods,2:185
‑
189)。
15.并且，所有的这些小组不是在他们的培养基中加入了μg/ml水平的胰岛素，就是因使用ksr而引入了胰岛素。胰岛素通常被认为在葡萄糖代谢和“细胞存活”信号传导中通过与胰岛素受体结合发挥作用。然而，当浓度高于生理浓度时，胰岛素也能与igf1受体低效结合，并通过pi
‑
3激酶/akt途径提供经典的生长因子活性。在ksr或其他这样的培养基条件中存在/需要如此高的胰岛素水平(μg/ml水平)提示主要活性是通过与hesc表达的igf1受体结合而引起的(sperger等人.,2003pnas,100(23):13350
‑
13355)。其他人已经注意到igf1r的完全互补物以及胞内信号途径成员在hesc中的表达，这可能预示着此途径的功能活性(miura等人,2004aging cell,3:333
‑
343)。胰岛素或igf1可以发出hesc自我更新所需的主要信号，正如以下事实所提示的，迄今为止开发的所有用于培养hesc的条件都或者含有胰岛素，或者含有ksr提供的胰岛素，或者含有血清提供的igf1。支持这一观点的证据显示，若pi
‑
3激酶在hesc培养物中被抑制，则细胞分化(d'amour等人.,2005nat.biotechnol.,23(12):1534
‑
41；mclean等人.,2007stem cells25:29
‑
38)。
16.最近发表的一篇文章描述了一种人源化的、成分确定的hesc培养基(ludwig等人.,nature biotechnology,2006年1月1日在线发表,doi:10.1038/nbtl 177)。然而这一最新的制剂包含几种被认为能够影响hesc增殖的因子，包括fgf2、tgfβ、licl、γ－氨基丁酸和六氢吡啶羧酸。值得注意的是，这一最近的成分确定的细胞培养基也含有胰岛素。
17.egf生长因子家族有至少14个成员，包括但不限于，egf、tgfβ、肝素结合的egf(hb
‑
egf)、神经调节蛋白
‑
β(又称调蛋白
‑
β(hrg
‑
β)、胶质生长因子等)、hrg
‑
α、双调蛋白、乙胞素(betacellulin)和表皮调节素(epiregulin)。所有这些生长因子都含有egf域并且通常首先表达为跨膜蛋白，该跨膜蛋白经金属蛋白酶(具体来说，adam)蛋白加工，从而产生可溶性
胞外域生长因子。egf家族成员与erbb1、2、3、4细胞表面受体的同型或异源二聚体以不同亲和力相互作用(jones等人.,febs lett,1999,447:227
‑
231)。egf、tgfα和hbegf以高亲和力结合erbb1/1(egfr)同型二聚体和erbb1/2异源二聚体(1
‑
100nm范围)，而hrg
‑
β以极高的亲和力结合erbb3和erbb4(<1nm范围)。激活的erbb受体通过pi3激酶/akt途径以及mapk途径发出信号。erbb2和erbb3是在hesc中最高度表达的生长因子受体(sperger等人.,2003pnas,100(23):13350
‑
13355)，并且以前已经证明hrg
‑
β支持小鼠原生殖细胞的扩增(toyoda
‑
ohno等人.,1999dev.biol,215(2):399
‑
406)。此外，erbb2的过量表达和随后的不当激活与肿瘤发生有关(neve等人.,2001ann.oncol,12suppl 1:s9
‑
13；zhou&hung,2003semin.oncol,30(5suppl 16):38
‑
48；yarden,2001oncology,61suppl 2:1
‑
13)。人erbb2(染色体17q)和erbb3(染色体12q)存在于染色体上，已经观察到在某些hesc中作为三体积累(draper等人,2004nat.biotechnol,22(1):53
‑
4；cowan等人,2004n engl.j.med.,350(13):1353
‑
6；brimble等人,2004stem cells dev.,13(6):585
‑
97；maitra等人,2005nat.genet.37(10):1099
‑
103；mitalipova等人.,2005nat.biotechnol.23(1):19
‑
20；draper等人.,2004stem cells dev.,13(4):325
‑
36；ludwig等人.,nature biotechnology,2006年1月1日在线发表,doi:10.1038/nbtl177)。
18.erbb2和erbb3(brown等人.,2004biol.reprod.,71:2003
‑
2011；salas
‑
vidal&lomeli,2004,dev biol,265:75
‑
89)在小鼠的胚泡中表达，尽管并非具体限于内细胞团(icm)，erbb1、egf和tgfβ在人胚泡中表达(chia等人.,1995development,1221(2):299
‑
307)。hb
‑
egf在人类ivf胚泡培养中具有增殖效果(martin等人.,1998hum.reprod.,13(6):1645
‑
52；sargent等人.,1998hum.reprod.13suppl 4:239
‑
48)，其对于生长于15％血清中的小鼠es细胞也有着适当的附加效应(heo等人.,2005,am.j.phy.cell physiol,印刷中)。植入前和植入后早期的发育在erbb2
‑
/
‑
、erbb3
‑
/
‑
、神经调节蛋白1
‑
/
‑
(britsch等人.,1998genes dev.,12:1825
‑
36)、adam17
‑
/
‑
(peschon等人.,1998science,282:1281
‑
1284)和adam19
‑
/
‑
(horiuchi,2005dev.biol,283(2):459
‑
71)的空胚胎中似乎并没有受到影响，因此，通过hesc中的erbb受体家族发出信号的重要性目前还不清楚。
19.神经调节蛋白1(nrg1)是表现为多种剪接和蛋白质加工变体的大基因。它能够生成大量的蛋白质同种型，这些同种型在此被统称为神经调节蛋白。神经调节蛋白主要表达为细胞表面跨膜蛋白。胞外区含有一个免疫球蛋白样结构域、一个碳水化合物修饰域和egf域。nrg1表达同种型在以前已有过综述(falls,2003exp.cell res.,284:14
‑
30)。已经表明细胞膜金属蛋白酶adam 17和adam 19能够将神经调节蛋白
‑
1的跨膜形式加工为可溶性的神经调节蛋白/调蛋白。hrg
‑
α和hrg
‑
β是神经调节蛋白的切割的胞外域，包含egf和其他结构域。由于egf域负责erbb受体的结合和活化，因此只含有此区域的重组分子就能够表现出该蛋白质的基本上所有的可溶性生长因子效果(jones等人.,1999febs lett.,447:227
‑
231)。而且，有些加工的神经调节蛋白的跨膜同种型还被认为能够通过egf域与erbb受体的相互作用而在邻近细胞中引发近分泌信号。
20.针对在培养中保持多能性的hesc研究进展中的重大发展将会阐明符合临床安全性和有效性的管理规范的培养基和细胞培养条件。尽管最佳的结果是可以获得用于hesc的化学成分确定的培养基，但是在化学上不确定的成分如果符合gmp标准，也是可以接受的。因此，需要确定能够用于治疗目的的多能干细胞群体的培养和稳定化的方法和组合物，其
中培养组合物是按照gmp标准确定和/或生产的。
21.发明概述
22.本发明涉及含有基础盐养分溶液和erbb3配体的组合物，该组合物基本不含血清。
23.本发明还涉及一种组合物，该组合物含有基础盐养分溶液和刺激可分化细胞中erbb2引导的酪氨酸激酶活性的成分。
24.本发明涉及培养可分化细胞的方法，该方法包括将可分化细胞平板接种于细胞培养表面上，为可分化细胞提供基础盐养分溶液以及提供特异结合erbb3的配体。
25.本发明涉及培养可分化细胞的方法，该方法包括将可分化细胞平板接种于细胞培养表面上，为可分化细胞提供基础盐养分溶液和刺激可分化细胞中erbb2引导的酪氨酸激酶活性的成分。
26.本发明还涉及培养可分化细胞的方法，该方法包括给在消化作用前包含于培养室中的可分化细胞层提供消化液，消化作用会将细胞层分离为单细胞。消化后，将单细胞置入含有可分化细胞培养液的新组织培养室中，其中可分化细胞培养液包含基础盐养分溶液和erbb3配体。一经培养，将单个可分化细胞置入允许单细胞生长和分裂的条件中。
附图说明
27.图1显示在成分确定条件(8ng/ml fgf2,100ng/ml lr
‑
igf1,1ng/ml激活蛋白a)中生长的bg01v中的adam19、神经调节蛋白1和erbb1
‑
3的实时rt
‑
pcr表达分析。示出了gapdh和oct4对照反应。
28.图2显示使用ag879对bg01v细胞的增殖的抑制。将bg01v细胞平板接种到6
‑
孔板中并且在接种后24小时接触dmso(a)、50nm
‑
20μmag1478(b)或100mm
‑
20μm ag879(c)。培养5天后，将培养物固定，并且针对碱性磷酸酶活性染色。ag1478看起来在这些浓度(b中显示的20μm)时不影响增殖，但是ag879在5μm时实质上延缓了细胞生长(c)。
29.图3显示在含有10ng/ml hrg
‑
β、10ng/ml激活蛋白a、200ng/ml lr
‑
igf1和8ng/ml fgf2的确定成分培养基dc
‑
haif中(a和b)和在含有10ng/ml hrg
‑
β、10ng/ml激活蛋白a和200ng/ml lr
‑
igf1的确定成分培养基中(c和d)培养的bg01v细胞的形态学。
30.图4显示通过rt
‑
pcr测定的adam19、神经调节蛋白1和erbb1
‑
4在小鼠es细胞(a)和mef(b)中的表达。
31.图5显示小鼠es细胞中erbb1和erbb2信号的抑制。将2
×
105小鼠r1 es细胞平板接种到含有1000u/ml小鼠lif(esgro)的10％fbs、10％ksr中的1:1000matrigel
tm
上。次日添加dmso(载体对照)、1
‑
50μm ag1478或1
‑
50μm ag879及新鲜培养基。在第8天固定培养物，并且针对碱性磷酸酶活性染色。dmso(a)和1
‑
50μm ag1478(b和c)没有明显抑制增殖。ag879在50μm时实质上抑制细胞生长(比较d和f)并且在20μm时可延缓增殖(e)。
32.图6显示在条件培养基(cm)中生长的bg02细胞增殖的抑制。(a)50μm ag825抑制在cm中生长的bg02 hesc的增殖。(b)ag825抑制hesc中的erbb2 y1248磷酸化。(c)cyt49 hesc在不同生长因子组合中的连续传代的集落计数。(d)使用bg02细胞进行的igf1和hrg在hesc增殖中的作用的细胞计数分析(左)。(e)双份重复实验的oct4/dapi免疫染色证实igf1和hrg与acta/fgf2条件相比明显增加了oct4
+
细胞的比例。(f)生长因子饥饿过夜的bg01 dc
‑
haif hesc的rtk印迹分析；示出了饥饿，然后用dc
‑
haif脉冲15分钟；或者稳态培养(左)。将
标准化的相对强度的平均值和范围作图(右)。
33.图7显示在具有不同生长因子组合的确定成分条件中生长的小鼠es细胞。(a)显示2
×
105细胞在不同生长因子组合中生长8天后的ap
+
集落的评分。(b
‑
g)显示在不同生长因子组合中生长的ap
+
集落的4倍放大图像。
34.图8显示在dc
‑
haif培养基中保持的人es细胞的表征。(a)来自bg02 dc
‑
haif p25细胞的畸胎瘤的分析证实了向外胚层、中胚层和内胚层多能分化的潜力。(b)在15％fcs/5％ksr中培养的已经分化的bg02细胞的免疫染色。(c)使用含有47,296个转录物探针的高密度illumina sentrix human
‑
6 expression beadchips检测在cm(64代)或dc
‑
haif(在确定成分培养基中10或32代)中保持的bg02细胞中转录物分布的venn图。(d)散点图分析，证实bg02 dc
‑
haif p32细胞的转录分布与在cm中保持的bg02细胞高度相似(上图)，并且在dc
‑
haif中的早期和晚期传代培养物中基本不变(下图)。(e)使用beadstudio软件产生的不同群体中相对基因表达的分级群聚树状图。
35.图9显示在dc
‑
haif培养基的存在下在人源化细胞外基质(ecms)上培养的细胞的形态学。(a)在生长因子减少的matrigel
tm
(1:200稀释)上生长的cyt49细胞(1:200稀释)。cyt49细胞也能够在(b)全人血清、(c)人纤连蛋白和(d)vitrogro
tm
包被的组织培养皿上生长。
36.图10显示人es细胞的单细胞传代。(a
‑
d)用accutase
tm
传代并且在60mm培养皿中以大约5
×
105细胞平板接种后bg02细胞的分阶段成像。(a)开始平板接种后1.5小时，显示活细胞附着到培养皿上。(b)在平板接种后20小时，大多数细胞聚集形成小的集落。到平板接种后第4天通过增殖扩增这些集落(c)，并且在5
‑
6天的过程中，形成覆盖整个培养皿的上皮样单层(d)。(e)在dc
‑
haif中用accutase
tm
传代19次的bg02培养物中证明有正常的男性核型。
37.图11显示使用(a)accutase
tm
、(b)0.25％胰蛋白酶/edta、(c)tryple或(d)versene对人es细胞进行单细胞传代后的细胞形态学。
38.图12显示在dc
‑
haif中培养的人es细胞的大规模生长。(a)扩增到>10
10
细胞后，bg02细胞的流式细胞分析。>85％的细胞表达oct4、cd9、ssea
‑
4、tra
‑1‑
81。(b)多能性标记物oct4、nanog、rex1、sox2、utf1、cripto、foxd3、tert和dppa5的表达的rt
‑
pcr分析。未检测到分化谱系的标记物甲胎蛋白(afp)、msx1和hand1。(c)使用人染色体特异性重复部分的荧光原位杂交(fish)证明hchr12、17、x和y保持正常的拷贝数。
39.图13显示在含有hrg
‑
β和igf1但是不含fgf2的确定成分培养基中生长7代或者长于2个月的hesc bg02细胞的形态学(a)和正常核型(b)。
40.图14显示来自在dc
‑
haif(32代)或dc
‑
hai(10代)中保持的hesc(bg02)的转录物的散点图分析。在两个样品中检测到大部分表达的转录物，在不存在外源fgf2的情况下培养hesc基本上不改变转录。使用表达水平>0的所有检测的转录物(所有点)获得相关系数(r2)，或者使用显示检测置信水平>0.99的转录物(r2选择，点用虚线椭圆形表示)。成角度的线绘出了2
‑
倍差异的平均值和限度。
41.图15显示在dc
‑
haif中保持的早期和晚期传代bg02细胞不同群体中相对基因表达的分级群聚树状图。细胞紧密群聚(约0.0075)并且与在条件培养基(cm)中保持的bg02和bg03细胞具有密切的相似性(约0.037)。在dc
‑
hai中保持的bg02细胞也与检查的其它hesc
群体紧密群聚。作为图15中的说明，cm为条件培养基；dc为确定成分培养基，dc
‑
haif如上所述定义；ap为accutase
tm
单细胞传代；dc
‑
hai除了不含fgf2以外与此处定义的dc
‑
haif相同。
42.图16显示在96孔和384孔板中的dc
‑
haif中培养的bg02细胞的形态学和碱性磷酸酶染色。在96孔板的一个孔中生长的bg02细胞(104细胞/孔)的(a)相差成像和(b)碱性磷酸酶染色。在384孔板的一个孔中生长的bg02细胞(103细胞/孔)的(c)相差成像和(d)碱性磷酸酶染色。
43.发明详述
44.除非另外指出，此处使用的术语按照相关领域普通技术人员的常规应用来理解。除了以下提供的术语的定义以外，分子生物学常用术语的定义也可以在rieger等人.,1991glossary of genetics:classical and molecular,5th ed.,berlin:springer
‑
verlag；和current protocols in molecular biology,f.m.ausubel等人.,eds.,current protocols,greene publishing associates,inc.和john wiley&sons,inc.的一家联合企业,(1998supplement)中找到。应当理解，在说明书和权利要求书中使用的“一种”根据其应用环境可以指一种或多种。因此，例如，“一种细胞”可以指至少使用一种细胞。
45.此处使用的术语“接触”(例如，使细胞例如可分化细胞接触化合物)包括将化合物和细胞一起在体外孵育(例如向培养的细胞中添加化合物)。术语“接触”并非意欲包括细胞与含有erbb3配体及任选的tgf
‑
β家族成员的确定成分细胞培养基的体内接触，这可以在受试者中自然发生(即，可能由于自然生理过程而发生的接触)。细胞与含有erbb3配体及任选的tgf
‑
β家族成员的确定成分细胞培养基的接触步骤可以以任何合适的方式进行。例如，细胞可以在贴壁培养中处理，或者在悬浮培养中处理。应当理解，与确定成分培养基接触的细胞可以进一步用细胞分化环境处理，以稳定化细胞，或者分化细胞。
46.此处使用的术语“分化”是指产生比其来源细胞型更加分化的细胞型。因此该术语包括部分和终末分化的细胞型。
47.在本发明的某些实施方案中，术语“富含”是指细胞培养物含有大约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％以上的所需细胞谱系。
48.此处使用的术语化合物的“有效量”是指在存在确定成分培养基的其余成分的情况下足以实现培养的可分化细胞在不存在饲养细胞和不存在血清或血清替代物的情况下稳定化一个月以上的化合物浓度。该浓度可以由本领域普通技术人员容易地确定。
49.此处使用的术语“表达”是指细胞中多核苷酸的转录或多肽的翻译，使得表达该分子的细胞中的分子水平可测量地高于不表达该分子的细胞中的水平。测定分子表达的方法是本领域普通技术人员公知的，包括但不限于northern印迹法、rt
‑
pcr、原位杂交、western印迹法、和免疫染色。
50.当在本文中用于细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群体时，术语“分离的”是指基本上与细胞的天然来源分离，使得该细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群体能够在体外培养。另外，术语“分离”用来指从两种或更多种细胞的组中物理选择一种或多种细胞，其中基于细胞形态学和/或各种标记物的表达选择细胞。
51.参照以下发明优选实施方案的详细描述和本文包括的实施例，可以更容易地理解本发明。但是，在公开和描述本发明的组合物和方法之前，应当理解本发明不限于特定的核酸、特定的多肽、特定的细胞型、特定的宿主细胞、特定的条件或者特定的方法，等等，因为
它们当然可以变化，并且大量的修改和变化对于本领域技术人员也是显然的。
52.用于涉及dna连接酶、dna聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶反应的克隆、dna分离、扩增和纯化标准技术，以及各种分离技术，是本领域技术人员公知的和经常使用的。sambrook等人.,1989molecular cloning,second edition,cold spring harbor laboratory,plainview,new york；maniatis等人.,1982molecular cloning,cold spring harbor laboratory,plainview,new york；wu(ed.)1993meth.enzymol.218,part i；wu(ed.)1979meth.enzymol.68；wu等人,(eds.)1983meth.enzymol.100和101；grossman和moldave(eds.)1980meth.enzymol.65；miller(ed.)1972experiments in molecular genetics,cold spring harbor laboratory,cold spring harbor,new york；old和primrose,1981principles of gene manipulation,university of california press,berkeley；schleif和wensink,1982practical methods in molecular biology；glover(ed.)1985dna cloning vol.i and ii,irl press,oxford,uk；hames和higgins(eds.)1985nucleic acid hybridization,irl press,oxford,uk；以及setlow和hollaender 1979genetic engineering:principles and methods,vols.1
‑
4,plenum press,new york中描述了大量的标准技术。使用的缩写和命名被认为是本领域中的标准和例如此处引用的专业杂志中常用的。
53.本发明涉及包含基础盐养分溶液和有效量的erbb3配体的组合物和方法，该组合物基本不含血清。本发明的组合物和方法可用于培养细胞，特别是可分化细胞。应当理解，在培养可分化细胞过程中的不同时间点，可以将各种成分添加到细胞培养物中，使得培养基可以含有此处所述成分以外的成分。然而，预期至少在培养物制备过程中的一个点，或者在可分化细胞培养过程中，确定成分培养基含有基础盐养分溶液和激活erbb2
‑
引导的酪氨酸激酶的成分。
54.此处使用的术语“可分化细胞”用于描述一种细胞或细胞群体，其可以分化为至少部分成熟的细胞，或者可以参与细胞分化，例如与其它可以分化为至少部分成熟的细胞的细胞融合。此处使用的“部分成熟的细胞”是表现出来自相同器官或组织的成熟细胞的至少一种表型特征例如形态学或蛋白质表达的细胞。例如，正常的成熟肝细胞一般表达尤其诸如白蛋白、纤维蛋白原、α
‑1‑
抗胰蛋白酶、凝血酶原凝固因子、转铁蛋白和解毒酶如细胞色素p
‑
450的蛋白质。因此，如本发明中定义的“部分成熟的肝细胞”可以表达白蛋白或另外一种或多种蛋白质，或者开始采用正常成熟肝细胞的外观或功能。另外，“部分成熟的胰β细胞”尤其可以产生或表达胰岛素原蛋白质。细胞分化为至少部分成熟的细胞的能力不依赖于重组工程技术，如转染，尽管细胞当然可以是遗传工程的。
55.本发明涉及可用于可分化细胞的组合物和方法，无论其来源或其可塑性如何。细胞的“可塑性”在此与本领域中使用的大致相同。即，细胞的可塑性是指细胞分化为在来自胚、胎或发育的机体的组织或器官中发现的特定细胞型的能力。细胞的“可塑性越强”，细胞能够分化的组织越多。“多能细胞”包括细胞及其后代，它们能够分化为或者产生多能性、寡能性(oligopotent)和单能性(unipotent)细胞，和/或在胚、胎或发育的机体中发现的几种(如果不是全部的话)成熟或部分成熟的细胞型。“多能细胞”包括细胞及其后代，它们能够分化为或者产生多能性、寡能性和单能性祖细胞，和/或一种或多种成熟的或部分成熟的细胞型，除了来源于多能细胞的成熟的或部分成熟的细胞型只限于特定组织、器官或器官系
统的细胞以外。例如，多能造血祖细胞和/或其后代具有分化为或者产生一种或多种寡能细胞型的能力，例如骨髓祖细胞和淋巴祖细胞，也产生其它的在血液中正常发现的成熟细胞成分。“寡能细胞”包括分化为成熟的或部分成熟的细胞的能力比多能细胞更受限制的细胞及其后代。然而，寡能细胞仍然可以具有分化为寡能和单能细胞和/或特定组织、器官或器官系统的一种或多种成熟的或部分成熟的细胞型的能力。寡能细胞的一个例子是骨髓祖细胞，它最终可以产生成熟的或部分成熟的红细胞、血小板、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性白细胞和单核细胞。“单能细胞”包括具有分化为或产生其它单能细胞和/或一种成熟的或部分成熟的细胞型的能力的细胞及其后代。
56.此处使用的可分化细胞可以是多能、寡能或甚至单能的。在本发明的某些实施方案中，可分化细胞是多能可分化细胞。在更特别的实施方案中，多能可分化细胞选自胚胎干细胞、icm/上胚层细胞、原始外胚层细胞、原生殖细胞和畸胎癌细胞。在一个特定实施方案中，可分化细胞是哺乳动物胚胎干细胞。在一个更特别的实施方案中，可分化细胞是人胚胎干细胞。
57.本发明还涉及来自动物内任何来源的可分化细胞，条件是该细胞是如此处定义的可分化细胞。例如，可分化细胞可以收获自胚胎或其中的任何原生殖层，收获自胎盘或绒毛膜组织，或者收获自更成熟的组织，如成人干细胞，包括但不限于脂肪、骨髓、神经组织、乳房组织、肝组织、胰、上皮、呼吸系统、性腺和肌肉组织。在特定实施方案中，可分化细胞是胚胎干细胞。在另外的特定实施方案中，可分化细胞是成人干细胞。在另外的特定实施方案中，干细胞是胎盘或绒毛膜来源的干细胞。
58.当然，本发明涉及使用来自任何能够产生可分化细胞的动物的可分化细胞。从中收获可分化细胞的动物可以是脊椎动物或无脊椎动物、哺乳动物或非哺乳动物、人类或非人类。动物来源的例子包括但不限于灵长类动物、啮齿类动物、犬、猫、马、牛和猪。
59.本发明的可分化细胞可以利用任何本领域技术人员公知的方法产生。例如，人多能细胞可以利用去分化和核移植方法产生。另外，本发明中使用的人icm/上胚层细胞或原始外胚层细胞可以在体内或在体外产生。原始外胚层细胞可以在贴壁培养中产生，或者在悬浮培养中作为细胞聚集物产生，如wo 99/53021中所述。此外，人多能细胞可以利用本领域技术人员公知的任何方法传代，包括手工传代方法和大量传代方法，如酶或非酶传代。
60.在某些实施方案中，当使用es细胞时，胚胎干细胞具有正常核型，而在另外一些实施方案中，胚胎干细胞具有异常核型。在一个实施方案中，大多数胚胎干细胞具有正常核型。预期在检查的中期中有多于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％以上显示正常核型。
61.在另外一个实施方案中，大多数胚胎干细胞具有异常核型。预期在检查的中期中有多于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％以上显示异常核型。在某些实施方案中，在细胞培养超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20代后，异常核型变得明显。在一个特定实施方案中，异常核型包括至少一个常染色体的三体，其中该常染色体选自染色体1、7、8、12、14和17。在另外一个实施方案中，异常核型包括一个以上常染色体的三体，其中一个以上常染色体中的至少一个选自染色体1、7、8、12、14和17。在一个实施方案中，所述常染色体是染色体12或17。在另外一个实施方案中，异常核型包括额外的性染色体。在一个实施方案中，核型包括两个x染色体和一个y染色体。也预期可能发生染色体的易
位，这种易位包括在术语“异常核型”中。本发明也包括上述染色体异常和其它染色体异常的组合。
62.该组合物和方法包含基础盐养分溶液。此处使用的基础盐养分溶液是指盐的混合物，它给细胞提供水和某些正常细胞代谢必需的大无机离子、维持细胞内和细胞外的渗透平衡、提供作为能源的碳水化合物、以及提供缓冲系统来维持培养基在生理ph范围内。基础盐养分溶液的例子包括但不限于dulbecco改良的eagle培养基(dmem)、基本必需培养基(mem)、基本培养基eagle(bme)、rpm1 1640、ham's f
‑
10、ham's f
‑
12、α
‑
基本必需培养基(αmem)、glasgow基本必需培养基(g
‑
mem)和iscove改良的dulbecco培养基，以及它们的混合物。在一个特定实施方案中，基础盐养分溶液是dmem和ham's f12的大约50:50的混合物。.
63.预期该组合物还可以包含痕量元素。痕量元素可以购自例如mediatech。痕量元素的非限制性例子包括但不限于包含铝、氯、硫酸盐、铁、镉、钴、铬、锗、钠、钾、钙、磷酸盐和镁的化合物。含有痕量元素的化合物的具体例子包括但不限于a1c13、agno3、ba(c2h3o2)2、cdcl2、cdso4、cocl2、crcl3、cr2(so4)3、cuso4、柠檬酸铁、geo2、ki、kbr、li、钼酸、mnso4、mncl2、naf、na2sio3、navo3、nh4vo3、(nh4)6mo7o
24
、niso4、rbcl、硒、na2seo3、h2seo3、亚硒酸
·
2na、硒代甲硫氨酸(selenomethionone)、sncl2、znso4、zrocl2和它们的混合物和盐。如果存在硒、亚硒酸盐或硒代甲硫氨酸，其浓度大约为0.002至大约0.02mg/l。另外，也可以存在羟基磷灰石。
64.预期可以向确定成分培养基中添加氨基酸。该氨基酸的非限制性例子有甘氨酸、l
‑
丙氨酸、l
‑
丙氨酰
‑
l
‑
谷氨酰胺、l
‑
谷氨酰胺/glutamax、l
‑
精氨酸盐酸盐、l
‑
天冬酰胺
‑
h2o、l
‑
天冬氨酸、l
‑
半胱氨酸盐酸盐
‑
h2o、l
‑
胱氨酸2hc1、l
‑
谷氨酸、l
‑
组氨酸盐酸盐
‑
h2o、l
‑
异亮氨酸、l
‑
亮氨酸、l
‑
赖氨酸盐酸盐、l
‑
甲硫氨酸、l
‑
苯丙氨酸、l
‑
脯氨酸、l
‑
羟脯氨酸、l
‑
丝氨酸、l
‑
苏氨酸、l
‑
色氨酸、l
‑
酪氨酸二钠盐二水合物和l
‑
缬氨酸。在某些实施方案中，该氨基酸是l
‑
异亮氨酸、l
‑
苯丙氨酸、l
‑
脯氨酸、l
‑
羟脯氨酸、l
‑
缬氨酸和它们的混合物。
65.还预期确定成分培养基可以含有抗坏血酸。优选地，抗坏血酸的初始浓度为大约1mg/l至大约1000mg/l，或者大约2mg/l至大约500mg/l，或者大约5mg/l至大约100mg/l，或者大约10mg/l至大约100mg/l，或者大约50mg/l。
66.另外，组合物和方法还可以包含其它成分，例如可以含有血清白蛋白、转铁蛋白、l
‑
谷氨酰胺、脂质、抗生素、β
‑
巯基乙醇、维生素、矿物质、atp和类似的成分。可以含有的维生素的例子包括但不限于维生素a、b1、b2、b3、b5、b6、b7、b9、b
12
、c、d1、d2、d3、d4、d5、e、生育三烯酚类、k1和k2。本领域技术人员可以确定在给定培养中使用的矿物质、维生素、atp、脂质、必需脂肪酸等的最适浓度。补充物的浓度可以是，例如，大约0.001μm至大约1mm或者更高。可以提供补充物的浓度的具体例子包括但不限于大约0.005μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1.0μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、4.0μm、5.0μm、10μm、20μm、100μm等。在一个特定实施方案中，组合物和方法包含维生素b6和谷氨酰胺。在另外一个特定实施方案中组合物和方法包含维生素c和铁添加剂。在另外一个特定实施方案中，组合物和方法包含维生素k1和维生素a。在另外一个特定实施方案中，组合物和方法包含维生素d3和atp。在另外一个特定实施方案中，组合物和方法包含维生素b
12
和转铁蛋白。在另外一个特定实施方案中，组合物和方法包含生育三烯酚类和β
‑
巯基乙醇。在另外一个特定实施方案中，组合物和方法包含谷氨酰胺和atp。在另外一个特定实施方案中，组合物和方法包含ω
‑
3脂肪酸和谷氨酰胺。在另外一
个特定实施方案中，组合物和方法包含ω
‑
6脂肪酸和维生素b1。在另外一个特定实施方案中，组合物和方法包含α
‑
亚麻酸和b2。
67.本发明的组合物基本不含血清。此处所用的“基本不含血清”是指在本发明的溶液中不存在血清。血清不是本发明的组合物和方法的必需成分。因此，任何组合物中血清的存在应当只是归因于杂质，例如，来自原材料或是来自原代细胞培养物的残留血清。例如，基本不含血清的培养基或环境可以含有少于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的血清，其中仍然观察到培养基或环境的提高的生物活性保持能力。在本发明的一个特定实施方案中，基本不含血清的组合物不含血清或血清替代物，或者只含有从添加到确定成分培养基中的血清或血清替代物成分分离的痕量血清或血清替代物。
68.本发明的组合物和方法也包含刺激可分化细胞内的erbb2酪氨酸激酶活性的成分。在一个特定实施方案中，本发明的组合物和方法包含至少一种erbb3配体。典型地，erbb3配体将与erbb3受体结合并且与erbb2受体二聚化。erbb2受体通常负责可分化细胞内的细胞内酪氨酸激酶活性。
69.此处使用的“erbb3配体”是指与erbb3结合的配体，erbb3与erbb2二聚化，从而激活erbb2/erbb3杂二聚受体的erbb2部分的酪氨酸激酶活性。erbb3配体的非限制性例子包括神经调节蛋白
‑
1；神经调节蛋白
‑
1的剪接变体和同种型，包括但不限于hrg
‑
β、hrg
‑
α、neu分化因子(ndf)、乙酰胆碱受体诱导活性(aria)、胶质生长因子2(ggf2)和感觉和运动神经元衍生的因子(smdf)；神经调节蛋白
‑
2；神经调节蛋白
‑
2的剪接变体和同种型，包括但不限于nrg2
‑
β、表皮调节素(epiregulin)和biregulin。
70.在一个实施方案中，刺激erbb2
‑
引导的酪氨酸激酶活性的成分包括至少一种erbb3配体，该erbb3配体选自神经调节蛋白
‑
1、调蛋白
‑
β(hrg
‑
β)、调蛋白
‑
α(hrg
‑
α)、neu分化因子(ndf)、乙酰胆碱受体诱导活性(aria)、胶质生长因子2(ggf2)和运动神经元衍生的因子(smdf)、神经调节蛋白
‑
2、神经调节蛋白
‑
2β(nrg2
‑
β)、表皮调节素、biregulin和它们的变体和功能片段。在另外一个特定实施方案中，本发明的组合物和方法包含一种以上的刺激erbb2
‑
引导的酪氨酸激酶活性的成分，例如但不限于使用一种以上的erbb3配体。
71.在本发明的组合物和方法的一个更特别的实施方案中，erbb3配体是hrg
‑
β或其变体或功能片段。在一个实施方案中，衍生出培养添加物蛋白质、多肽或其变体或功能片段的种类与培养的细胞的种类相同。例如，如果培养小鼠es细胞，具有与小鼠(mus musculus)hrg
‑
β序列相同的氨基酸序列的hrg
‑
β可以用作培养添加物，并且被认为是“相同种类的”。在另外一些实施方案中，衍生出生物添加物的种类与培养的细胞不同。例如，如果培养小鼠es细胞，具有与人hrg
‑
β序列相同的氨基酸序列的hrg
‑
β可以用作培养添加物，并且被认为是“不同种类的”。
72.此处使用的“功能片段”是发挥与全长多肽相似的生理或细胞效应的全长多肽的片段或剪接变体。功能片段的生物效应不需要在范围或长度上与全长多肽相同，只要见到相似的生理或细胞效应即可。例如，hrg
‑
β的功能片段能够可检测地刺激erbb2
‑
引导的酪氨酸激酶。
73.此处使用的术语“变体”包括嵌合或融合多肽、同源物、类似物、直向同源物(orthologs)和旁系同源物(paralogs)。另外，参照蛋白质或多肽的变体是其氨基酸序列与参照蛋白质或多肽至少约80％相同的蛋白质或多肽。在特定实施方案中，变体与参照蛋白
质或多肽至少大约85％、90％、95％、95％、97％、98％、99％或者甚至100％相同。此处使用的术语“对应于”当涉及序列比对时，是指参照蛋白质或多肽例如野生型人或小鼠神经调节蛋白
‑
1内列举的位点，以及与参照蛋白质或多肽上的位点比对的修饰蛋白质或多肽中的位点。因此，当目标蛋白质或多肽的氨基酸序列与参照蛋白质或多肽的氨基酸序列比对时，“对应于”参照蛋白质或多肽序列的某些列举位点的序列是与参照序列的这些位点比对的序列，但是不一定在参照序列的这些确切数字的位点中。以下描述了确定序列之间对应的氨基酸的序列比对方法。
74.具有与编码(例如)tgf
‑
β的参照氨基酸序列(例如)至少大约95％“相同”的氨基酸序列的多肽可理解为是指除了编码参照tgf
‑
β的参照氨基酸序列的每100个氨基酸可能包含可达大约5个的修饰以外，多肽的氨基酸序列与参照序列相同。换句话说，为了获得具有与参照氨基酸序列至少大约95％相同的氨基酸序列的肽，参照序列的最多大约5％的氨基酸残基可以缺失或者置换为另外一种氨基酸，或者占参照序列中氨基酸总数最多大约5％的多个氨基酸可以插入到参照序列内。参照序列的这些修饰可以在参照氨基酸序列的n
‑
末端或c末端位点处发生，也可以在这些末端位点之间的任何位置处发生，分别散布在参照序列的氨基酸之间或者参照序列内的一个或多个相邻基团中。
75.此处使用的“同一性”是核苷酸序列或氨基酸序列与参照核苷酸或氨基酸序列相比的相同性的指标。通常，将这些序列进行比对，从而获得最高级的匹配。“同一性”本身具有本领域公认的含义，并且可以使用发表的技术进行计算。(参见，例如，computational molecular biology,lesk,a.m.,ed.,oxford university press,new york(1988)；biocomputing:informatics and genome projects,smith,d.w.,ed.,academic press,new york(1993)；computer analysis of sequence data,part i,griffin,a.m.,and griffin,h.g.,eds.,humana press,new jersey(1994)；von heinje,g.,sequence analysis in molecular biology,academic press(1987)；以及sequence analysis primer,gribskov,m.and devereux,j.,eds.,m stockton press,new york(1991))。尽管存在几种测定两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性的方法，术语“同一性”是本领域技术人员公知的(carillo,h.&lipton,d.,siam j applied math 48:1073(1988))。常用来测定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括但不限于guide to huge computers,martin j.bishop,ed.,academic press,san diego(1994)和carillo,h.&lipton,d.,siam japplied math 48:1073(1988)中公开的那些方法。计算机程序也可以包括计算同一性和相似性的方法和算法。测定两个序列之间的同一性和相似性的计算机程序方法的例子包括但不限于gcg程序包(devereux,j.,等人,nucleic acids research 12(1):387(1984))、blastp、expasy、blastn、fasta(atschul,s.f.,等人.,j molec biol 215:403(1990))和fastdb。michaels,g.和garian,r.,current protocols in protein science,vol 1,john wiley&sons,inc.(2000)中讨论了测定同一性和相似性的方法的例子，其引入本文作为参考。在本发明的一个实施方案中，用来测定两个或多个多肽之间的同一性的算法是blastp。
76.在本发明的另外一个实施方案中，用来测定两个或多个多肽之间的同一性的算法是fastdb，fastdb是基于brutlag等人的算法(comp.app.biosci.6:237
‑
245(1990),引入本文作为参考)。在fastdb序列比对中，查询和目标序列是氨基酸序列。序列比对的结果为百分同一性。可以在氨基酸序列的fastdb比对中用于计算百分同一性的参数包括但不限于：
矩阵＝pam,k
‑
元组＝2,错配罚分＝l,连接罚分＝20,随机化组长度＝0,截断评分＝1,空位罚分＝5,空位大小罚分为0.05,窗口大小＝500或者目标氨基酸序列的长度，取较短的那一个。
77.如果由于n
‑
末端或c
‑
末端添加或缺失，而不是由于内部添加或缺失，目标序列短于或长于查询序列，则可以进行手工校正，因为fastdb程序当计算百分同一性时不能解释目标序列的n
‑
末端和c
‑
末端截短或添加。对于相比查询序列在5'或3'末端截短的目标序列，通过计算不匹配/对准的为参照序列n
‑
和c
‑
末端的查询序列的碱基数校正百分同一性，作为查询序列碱基总数的百分比。fastdb序列比对的结果确定匹配/对准。然后从百分同一性中减去比对百分数，使用指定参数通过上述fastdb程序计算，获得最终的百分同一性评分。这一校正的评分可以用于确定比对如何彼此“对应”。分别通过参照或目标序列n
‑
或c
‑
末端延长的查询(目标)序列或参照序列的残基可以考虑用于手工调整百分同一性评分。即，当手工调整百分同一性评分或比对编号时，可以计数与比较序列的n
‑
或c
‑
末端不匹配/对准的残基。
78.例如，90个氨基酸残基的目标序列与100个残基的参照序列进行比对，以确定百分同一性。缺失发生在目标序列的n
‑
末端，因此，fastdb比对不显示n末端前10个残基的匹配/比对。10个未配对的残基代表序列的10％(不匹配的n
‑
和c
‑
末端残基数/查询序列中的残基总数)，因此从通过fastdb程序计算的百分同一性评分中减去10％。如果剩余的90个残基完美匹配，则最终的百分同一性为90％。在另一个实例中，90个残基的目标序列与100参照序列进行比较。这次缺失为内部缺失，因此在目标序列的n
‑
或c
‑
末端没有不与查询序列匹配/对准的残基。在这种情况下，通过fastdb计算的百分同一性不用手工校正。
79.本发明还提供了嵌合或融合多肽。此处使用的“嵌合多肽”或“融合多肽”包括与第二种不同的多肽可操作连接的参照多肽成员的至少一部分。该第二种多肽具有的氨基酸序列对应于与参照多肽基本上不相同并且来源于相同或不同的生物的多肽。对于融合多肽，术语“可操作连接”表示参照多肽和第二种多肽彼此融合，因此两个序列实现了所使用的序列的预期功能。第二种多肽可以与参照多肽的n
‑
末端或c
‑
末端融合。例如，在一个实施方案中，融合多肽是gst
‑
igf
‑
1融合多肽，其中igf
‑
1序列与gst序列的c
‑
末端融合。这样的融合多肽可以促进重组多肽的纯化。在另外一个实施方案中，融合多肽可以在其n
‑
末端含有异源信号序列。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，利用异源信号序列可以提高多肽的表达和/或分泌。
80.除了片段和融合多肽以外，本发明还包括天然存在的多肽的同源物和类似物。“同源物”在此被定义为分别具有相似的或“相同的”核苷酸或氨基酸序列的两种核酸或多肽。同源物包括下面定义的等位基因变体、直向同源物、旁系同源物、激动剂和拮抗剂。术语“同源物”还包括由于遗传密码的简并性而与参照核苷酸序列不同，从而编码与参照核苷酸序列所编码的相同的多肽的核酸分子。此处使用的“天然存在的”是指在自然中存在的核酸或氨基酸序列。
81.多肽的激动剂可以保留多肽的基本上相同的生物活性或者其部分。多肽的拮抗剂可以抑制多肽的天然存在形式的一种或多种活性。
82.在本发明的组合物和方法的另外一个更特别的实施方案中，erbb3配体是hrg
‑
β或其变体或功能片段。erbb3配体的另外的非限制性例子在美国专利6,136,558、6,387,638和
7,063,961中公开，在此引入作为参考。
83.调蛋白通常根据在c
‑
末端部分不同的两种变异egf样结构域而被分类为两个主要类型，α和β。然而，这些egf样结构域在其中所含的六个半胱氨酸残基的间距上相同。基于氨基酸序列的比较，holmes等人发现在egf样结构域的第一个和第六个半胱氨酸之间，hrg与肝素结合的egf样生长因子(hb
‑
egf)有45％相似，与双调蛋白(ar)有35％相同，与tgf
‑
α有32％相同，与egf有27％相同。
84.44kda的neu分化因子(ndf)是人hrg的大鼠等同物。如同hrg多肽一样，ndf具有一个免疫球蛋白(ig)同源域，随后是一个egf样结构域，并且缺乏n
‑
末端信号肽。目前，至少存在六种不同的成纤维细胞原
‑
ndf，基于egf样结构域的序列分类为α或β多肽。基于egf样结构域和跨膜域之间的可变区段对同种型1至4进行表征。因此，似乎不同的ndf同种型是通过选择性剪接产生的，并且可以行使不同的组织特异性功能。参见ep 505 148；wo 93/22424；和wo 94/28133，在此引入作为参考。
85.在本发明的一个实施方案中，组合物和方法不含外源胰岛素和胰岛素替代物。短语“外源胰岛素或胰岛素替代物”在此用来指不是有意添加到本发明的组合物或方法中的胰岛素或胰岛素替代物。因此，在本发明的某些实施方案中，方法和组合物不含有意添加的胰岛素或胰岛素替代物。然而，组合物或方法不是必须不含内源胰岛素。此处使用的“内源胰岛素”是指培养的细胞在按照本发明的方法培养时可能自身产生胰岛素。内源胰岛素也可以用来表示原代细胞培养物残余的杂质或者来自原材料的杂质。在特定实施方案中，本发明的组合物和方法含有少于50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1μg/ml的胰岛素。
86.此处使用的术语“胰岛素”是指在正常生理浓度下与胰岛素受体结合并且可以诱导通过胰岛素受体的信号传导的蛋白质或其变体或片段。术语“胰岛素”包括具有天然人胰岛素或者其它哺乳动物胰岛素的多肽序列或者这些序列的任何同源物或变体的蛋白质。另外，术语胰岛素包括能够结合胰岛素受体从而诱导通过胰岛素受体的信号传导的多肽片段。术语“胰岛素替代物”是指任何可以用来代替胰岛素从而产生与胰岛素基本类似的结果的含锌化合物。胰岛素替代物的例子包括但不限于氯化锌、硝酸锌、溴化锌和硫酸锌。
87.清楚地，本发明预期，胰岛素样生长因子不是胰岛素替代物或者胰岛素的同源物。因此，在另外一个特定实施方案中，本发明的组合物和方法包括使用至少一种胰岛素样生长因子(igf)或其变体或功能片段。在另外一个实施方案中，本发明的组合物和方法不含任何外源胰岛素样生长因子(igfs)。在特定实施方案中，本发明的组合物和方法含有不到200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ng/ml的igf
‑
1。
88.此处使用的术语“igf
‑
1r的激活物”是指在调节细胞增殖、分化和凋亡中起关键作用的有丝分裂原。igf
‑
1r的激活物的作用一般通过igf
‑
1r介导，尽管它们也可以通过其它受体介导。igf
‑
1r也参与肿瘤病毒蛋白和癌基因产物诱导的细胞转化，并且由一组特异性结合蛋白(igfbps)调节相互作用。另外，一大组igfbp蛋白酶水解igfbp，导致结合的igf释放，然后恢复它们与igf
‑
ir相互作用的能力。对于本发明，配体、受体、结合蛋白和蛋白酶全都被认为是igf
‑
1r的激活物。在一个实施方案中，igf
‑
1r的激活物是igf
‑
1或igf
‑
2。在另外一个实施方案中，igf
‑
1r的激活物是igf
‑
1类似物。igf
‑
1类似物的非限制性例子包括longr3
‑
igf1、des(1
‑
3)igf
‑
1、[arg3]igf
‑
l、[ala
31
]ifg
‑
1、des(2,3)[ala
31
]igf
‑
1、[leu
24
]
igf1、des(2,3)[leu
24
]igf
‑
1、[leu
60
]igf
‑
1、[ala
31
][leu
60
]igf
‑
1、[leu
24
][ala
31
]igf
‑
1和它们的组合。在另外一个实施方案中，ifg
‑
1类似物是longr3
‑
igf1，它是人胰岛素生长因子
‑
1的重组类似物。预期longr3
‑
igf1最初以大约1ng/ml至大约1000ng/ml，更优选大约5ng/ml至大约500ng/ml，更优选大约50ng/ml至大约500ng/ml，更优选大约100ng/ml至大约300ng/ml或大约100ng/ml的的浓度存在。
[0089]
在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包含转化生长因子β(tgf
‑
β)或tgf
‑
β家族成员或其变体或功能片段。此处使用的术语“tgf
‑
β家族成员”或类似术语是指由于与tgf
‑
β家族的已知成员的同源性或者由于与tgf
‑
β家族的已知成员的功能相似性而被本领域技术人员通常表征为属于tgf
‑
β家族的生长因子。在本发明的特定实施方案中，如果存在tgf
‑
β家族的成员，tgf
‑
β家族成员或其变体或功能片段激活smad 2或3。在某些实施方案中，tgf
‑
β家族成员选自nodal、激活蛋白a、激活蛋白b、tgf
‑
β、骨形态发生蛋白
‑
2(bmp2)和骨形态发生蛋白
‑
4(bmp4)。在一个实施方案中，tgf
‑
β家族成员是激活蛋白a。
[0090]
预期如果存在nodal，它最初以大约0.1ng/ml至大约2000ng/ml，更优选大约1ng/ml至大约1000ng/ml，更优选大约10ng/ml至大约750ng/ml或者更优选大约25ng/ml至大约500ng/ml的浓度存在。预期如果使用的话，激活蛋白a最初以大约0.01ng/ml至大约1000ng/ml，更优选大约0.1ng/ml至大约100ng/ml，更优选大约0.1ng/ml至大约25ng/ml或者最优选大约10ng/ml的浓度存在。预期如果存在的话，tgf
‑
β最初以大约0.01ng/ml至大约100ng/ml，更优选大约0.1ng/ml至大约50ng/ml或者更优选大约0.1ng/ml至大约20ng/ml的浓度存在。
[0091]
在本发明的其它实施方案中，本发明的组合物和方法不含fgf受体的激活物。目前成纤维细胞生长因子家族至少有22个已知成员，这些因子与四种fgf受体中的至少一种结合。此处使用的术语“fgf受体的激活物”是指由于与fgf家族的已知成员的同源性或者由于与fgf家族的已知成员的功能相似性而被本领域技术人员通常表征为属于fgf家族的生长因子。在某些实施方案中，fgf受体激活物是fgf，例如但不限于α
‑
fgf和fgf2。在特定实施方案中，组合物和方法不含外源fgf2。短语“外源fgf2”在此处用来表示不是有意添加到本发明的组合物或方法中的成纤维细胞生长因子2，即碱性fgf。因此，在本发明的某些实施方案中，方法和组合物不含有意添加的fgf2。然而，组合物或方法不是必须不含内源fgf2。此处使用的“内源fgf2”表示培养的细胞在按照本发明的方法培养时可以自身产生fgf2。“内源fgf2”也可以用来表示原代细胞培养物中残余的杂质或者来自原材料的杂质。在特定实施方案中，本发明的组合物和方法含有不到10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ng/ml的fgf2。
[0092]
然而，预期本发明的组合物和方法可以包含至少一种fgf受体的激活物，包括fgf多肽、其功能片段或其变体中的任何一种。预期如果存在fgf2，则其最初以大约0.1ng/ml至大约100ng/ml，更优选大约0.5ng/ml至大约50ng/ml，更优选大约1ng/ml至大约25ng/ml，更优选大约1ng/ml至大约12ng/ml，或者最优选大约8ng/ml的浓度存在。在另外一个特定实施方案中，本发明的组合物和方法可以包括至少一种fgf2以外的fgf受体激活物。例如，本发明的组合物和方法可以包含fgf
‑
7、fgf
‑
10或fgf
‑
22或其变体或功能片段中的至少一种。在特定实施方案中，存在fgf
‑
7、fgf
‑
10和fgf
‑
22或其变体或功能片段中的至少两种的组合。在另外一个实施方案中，存在fgf
‑
7、fgf
‑
10和fgf
‑
22的全部三种或其变体或功能片段。预期如果存在任何fgf
‑
7、fgf
‑
10或fgf
‑
22或变体或功能片段，则每种最初以大约0.1ng/ml至
大约100ng/ml，更优选大约0.5ng/ml至大约50ng/ml，更优选大约1ng/ml至大约25ng/ml，更优选大约1ng/ml至大约12ng/ml，或者最优选大约8ng/ml的浓度存在。
[0093]
在其它某些实施方案中，本发明的组合物和方法包含血清白蛋白(sa)。在特定实施方案中，所述sa是牛sa(bsa)或人sa(has)。在更特别的实施方案中，sa的浓度高于大约0.2％体积比(v/v)，但是低于大约10％v/v。在甚至更特别的实施方案中，sa的浓度大于大约0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3.0％、3.2％、3.4％、3.6％、3.8％、4.0％、4.2％、4.4％、4.6％、4.8％、5.0％、5.2％、5.4％、5.6％、5.8％、6.0％、6.2％、6.4％、6.6％、6.8％、7.0％、7.2％、7.4％、7.6％、7.8％、8.0％、8.2％、8.4％、8.6％、8.8％、9.0％、9.2％、9.4％、9.6％和9.8％(v/v)。
[0094]
在另外的实施方案中，组合物和方法包括至少一种不溶性基质。例如，可分化细胞可以置于细胞培养表面上，该表面包含诸如但不限于聚苯乙烯、聚丙烯的化合物。该表面可以用不溶性基质包被。在特定实施方案中，不溶性基质选自胶原、纤连蛋白及其片段或变体。不溶性基质的其它例子包括但不限于纤维蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和巢蛋白。
[0095]
因此，本发明的细胞培养环境和方法包括将细胞平板接种到贴壁培养物中。此处使用的术语“平板接种”是指任何使细胞在贴壁培养中生长的过程。此处使用的术语“贴壁培养”是指使细胞在固体表面上培养的细胞培养系统，该固体表面可以用不溶性基质包被，不溶性基质可以用如以下所列的另外一种基质表面包衣包被，或者用任何允许细胞在培养中增殖或稳定化的其它化学或生物材料包被。细胞可以紧密附着到固体表面上或者基质上，也可以不紧密附着。用于贴壁培养的基质可以包括聚鸟氨酸、层粘连蛋白、聚赖氨酸、纯化的胶原、明胶、纤连蛋白、腱糖蛋白、玻连蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖类、聚乙醇酸(pga)、聚乳酸(pla)和聚乳酸
‑
乙醇酸(plga)中的任一种或组合。此外，用于贴壁培养的基质可以包括铺有饲养细胞层或者铺有多能人细胞或细胞培养物的基质。此处使用的术语“细胞外基质”包括例如但不限于以上所述的固体基质，以及铺有饲养细胞层或者多能人细胞或细胞培养物的基质。在一个实施方案中，将细胞接种到matrigel
tm
包被的板上。在另外一个实施方案中，将细胞接种到纤连蛋白包被的板上。在某些实施方案中，如果将细胞接种到纤连蛋白上，则通过用在组织级水中稀释的10μg/ml人血浆纤连蛋白(invitrogen,#33016
‑
015)室温包被2
‑
3小时制备板。在另外一个实施方案中，血清可以置于培养基中高达24小时，以允许将细胞接种到塑料上。如果使用血清促进细胞的附着，则除去培养基，并且将基本不含血清的组合物添加到接种的细胞中。
[0096]
本发明的组合物和方法涉及在基本不含饲养细胞或饲养层的条件中培养可分化细胞。此处使用的“饲养细胞”是在体外生长的细胞，它与靶细胞共培养并且将靶细胞稳定化为当前的分化状态。此处使用的“饲养细胞层”可以与术语“饲养细胞”互换使用。此处使用的术语“基本不含饲养细胞”是指不含饲养细胞或者含有最少(de minimus)数目的饲养细胞的组织培养条件。“最少”的意思是从以前的在饲养细胞上培养可分化细胞的培养条件转至本培养条件的饲养细胞的数目。在上述方法的一个实施方案中，由将靶细胞稳定化为当前的分化状态的饲养细胞获得条件培养基。在另外一个实施方案中，确定成分培养基是非条件培养基，它是并非从饲养细胞获得的培养基。
[0097]
此处使用的术语“稳定化”当用于细胞或细胞培养物的分化状态时，表示该细胞将在多代培养中持续增殖，并且优选地在培养中无限期地增殖，大多数(如果不是全部的话)培养的细胞为相同的分化状态。另外，当稳定化的细胞分裂时，分裂一般产生相同细胞型的细胞或者产生相同分化状态的细胞。如果细胞培养条件不变，稳定化的细胞或细胞群体通常不会进一步分化或者去分化，并且细胞继续传代并且不会过度生长。在一个实施方案中，稳定化的细胞能够以稳定的状态无限期地增殖，或者至少持续2代以上。在更特别的实施方案中，细胞稳定超过3代、4代、5代、6代、7代、8代、9代、10代以上、15代以上、20代以上、25代以上或者30代以上。在一个实施方案中，细胞稳定超过大约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月或11个月的连续传代。在另外一个实施方案中，细胞稳定超过大约1年的连续传代。在一个实施方案中，干细胞通过在确定成分培养基中常规传代在培养中保持多能状态，直到希望它们分化。此处使用的术语“增殖”是指细胞培养中细胞数目的增加。
[0098]
在某些实施方案中，组合物和方法包含bmp信号灭活剂。此处使用的“bmp信号灭活剂”是指拮抗一种或多种bmp蛋白或其通过任何可能的信号途径的任何上游或下游信号成分的活性的试剂。用来灭活bmp信号的化合物可以是任何本领域所知的或者以后发现的化合物。bmp信号灭活剂的非限制性例子包括显性阴性、截短的bmp受体、可溶性bmp受体、bmp受体
‑
fc嵌合体、头蛋白(noggin)、滤泡抑素、脊索发生素(chordin)、gremlin、cerberus/dan家族蛋白质、ventropin、高剂量激活蛋白和amnionless。
[0099]
在某些实施方案中，组合物和方法可以包括至少一种激素、细胞因子、脂肪素(adipokine)、生长激素或其变体或功能片段。目前预期在某些实施方案中，在确定成分培养基中存在的生长激素与使用确定成分培养基培养的可分化细胞为相同种类。因此，例如，如果培养人细胞，则生长激素是人生长激素。也考虑使用来自不同于培养细胞的种类的生长激素。优选地，激素、细胞因子、脂肪素和/或生长激素以大约0.001ng/ml至大约1000ng/ml，更优选大约0.001ng/ml至大约250ng/ml或者更优选大约0.01ng/ml至大约150ng/ml的初始浓度存在。
[0100]
可以包括在本发明的组合物和方法中的细胞因子和脂肪素的例子包括但不限于细胞因子的四α螺旋束家族、细胞因子的白介素
‑
1(il
‑
1)家族、细胞因子的il
‑
17家族和细胞因子的趋化因子家族。当然，本发明涉及这些细胞因子家族中的每一个的成员和亚类，例如但不限于cc趋化因子、cxc趋化因子、c趋化因子、和cx3c趋化因子、干扰素、白介素、淋巴毒素、c
‑
kit配体、粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、单核细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(m
‑
csf)、粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf)、瘦素、脂连蛋白(adiponectin)、抵抗素、纤溶酶原激活物抑制剂
‑
1(pai
‑
1)、肿瘤坏死因子
‑
α(tnfα)、肿瘤坏死因子
‑
β(tnfβ)、白血病抑制因子、内脏脂肪素(visfatin)、视黄醇结合蛋白4(rbp4)、促红细胞生成素(epo)、血小板生成素(thpo)。当然，本领域技术人员应当理解本发明涉及上述因子的变体或功能片段。
[0101]
本发明涉及培养可分化细胞的方法，该方法包括将可分化细胞平板接种到细胞培养表面上，为细胞提供基础盐养分溶液，并且提供刺激细胞中erbb2
‑
引导的酪氨酸激酶活性的成分。
[0102]
在一个实施方案中，在不存在血清或血清替代物的情况下，以及在不存在饲养细胞层的情况下，可分化细胞接触至少一种本发明的组合物，使得细胞保持未分化状态至少
一个月。多能性可以通过表征细胞的表面标记、转录标记、核型和分化为三个胚层的细胞的能力来确定。这些特征是本领域技术人员公知的。
[0103]
预期可以在与本发明的确定成分培养接触之前和/或之后使用酶、非酶或手工分离方法传代可分化细胞。酶分离方法的非限制性例子包括使用蛋白酶如胰蛋白酶、胶原酶、分散酶(dispase)、和accutase
tm
。在一个实施方案中，利用accutase
tm
将接触的细胞传代。当采用酶传代方法时，获得的培养物根据使用的酶可以包含大小不同的单、二、三细胞和细胞团的混合物。非酶分离方法的一个非限制性例子是细胞分散缓冲液。手工传代技术在本领域中已有详细描述，例如见schulz等人,2004stem cell,22(7):1218
‑
38。传代方法的选择受到细胞外基质的选择的影响，并且由本领域技术人员容易地确定。
[0104]
在一个特定实施方案中，培养可分化细胞的方法包括在分离之前向包含在培养室中的干细胞层上提供分离溶液，其中该分离将细胞层分裂为单细胞。分离后，将单细胞置于新的具有干细胞培养溶液的组织培养室中，其中干细胞培养溶液含有基础盐养分溶液和erbb3配体。一旦培养，即将单干细胞置于允许单细胞生长和分裂的条件下。
[0105]
在本发明方法中使用的解聚溶液可以是任何能够将细胞分裂或解聚为单细胞而不导致对细胞的广泛毒性的解聚溶液。解聚溶液的例子包括但不限于胰蛋白酶、accutase
tm
、0.25％胰蛋白酶/edta、tryple或versene
tm
(edta)和胰蛋白酶。本发明的方法不需要使汇合层的每个细胞解聚为单细胞，只要至少少数单细胞解聚并且能够再培养即可。
[0106]
可分化细胞也可以用来筛选影响其可塑性或其它特征的分子或因子。例如，可分化细胞可以用来鉴定在可分化细胞产生的分化谱系中诱导细胞凋亡、分化或增殖以及类似作用的试剂。
[0107]
因为本发明的组合物和方法允许单细胞传代，可分化细胞已经成功地在高通量设置例如但不限于96孔板和384孔板中培养。图16显示使用此处所述的方法在96孔和384孔板的dc
‑
haif中培养的bg02细胞的形态学和碱性磷酸酶染色。简而言之，使用accutase
tm
分离并且接种到96孔和384孔板中培养的hesc细胞显示与使用其它培养皿所观察到的类似的平板接种率。另外，细胞形成集落，并且在较小的环境中在5天里成功扩增。这些较小的培养物在形态学上保持未分化，并且碱性磷酸酶(未分化细胞的标记)染色为均匀的阳性。此外，hesc也可以在提供实时阻抗测量的96孔培养装置(未显示)中生长，可以利用acea biosciences,inc.(www.aceabio.com)的rt
‑
ces
tm
法用阻抗测定细胞增殖和存活率。这种方法能够不使用标记物实时地鉴定和定量对可分化细胞的细微或直接的作用，以及测定增殖、凋亡和形态学变化。
[0108]
本发明的组合物和方法实际上可以含有以上所述或本文其它部分所述的成分的任意组合，条件是该组合物和方法含有基础盐养分溶液和刺激erbb2引导的酪氨酸激酶活性的成分。本领域技术人员应当认识到，本发明的组合物和方法的成分随方案设计的不同而不同。因此，本发明的一个实施方案涉及在96孔板和/或384孔板中培养可分化细胞。实际上，使用本发明的方法和组合物，细胞培养室，即培养皿，不再限于特定尺寸。因此，本发明的方法不限于特定培养室尺寸。
[0109]
此处所述的组合物和方法具有几个有用的特征。例如，此处所述的组合物和方法可用于模拟人体发育的早期阶段。此外，此处所述的组合物和方法还可用于治疗性干预疾
病状态，如神经变性疾病、糖尿病或肾衰竭，例如通过纯组织或细胞型的发育。
[0110]
由可分化细胞分化的细胞型在各个研究和发展领域中具有几种用途，包括但不限于药物发现、药物开发和检测、毒物学、治疗目的的细胞的生产以及基础科学研究。这些细胞型表达在广泛的研究领域中具有意义的分子。其中包括已知如标准参考文献中所述的各种细胞型作用所需的分子。这些分子包括但不限于细胞因子、生长因子、细胞因子受体、胞外基质、转录因子、分泌的多肽和其它分子、和生长因子受体。
[0111]
预期本发明的可分化细胞可以通过与细胞分化环境接触而分化。此处所用的术语“细胞分化环境”是指细胞培养条件，其中诱导可分化细胞分化，或者诱导其成为富含分化细胞的人细胞培养物。优选地，生长因子诱导的分化的细胞谱系在性质上是均匀的。术语“均匀的”是指群体包含大约50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的所需细胞谱系。
[0112]
细胞分化培养基或环境可以用来部分地、终末地或者可逆地分化本发明的可分化细胞。根据本发明，细胞分化环境培养基可以含有多种成分，包括，例如，kodmem培养基(敲除dulbecco改良的eagle培养基)、dmem、ham's f12培养基、fbs(胎牛血清)、fgf2(成纤维细胞生长因子2)、ksr或hlif(人白血病抑制因子)。细胞分化环境也可以含有补充物如l
‑
谷氨酰胺、neaa(非必需氨基酸)、p/s(青霉素/链霉素)、n2、b27和β
‑
巯基乙醇(β
‑
me)。预期可以向细胞分化环境中加入其它因子，包括但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、肝素、硫酸肝素、视黄酸、表皮生长因子家族成员(egfs)、成纤维细胞生长因子家族成员(fgfs)，包括fgf2和/或fgf8、血小板衍生生长因子家族成员(pdgfs)、转化生长因子(tgf)/骨形态发生蛋白(bmp)/生长和分化因子(gdf)家族拮抗剂，包括但不限于头蛋白、滤泡抑素、脊索发生素、gremlin、cerberus/dan家族蛋白质、ventropin、高剂量激活蛋白和amnionless或其变体或功能片段。tgf/bmp/gdf拮抗剂也可以以tgf/bmp/gdf受体
‑
fc嵌合体的形式加入。可以添加的其它因子包括可以激活或灭活通过notch受体家族信号传导的分子，包括但不限于δ
‑
样蛋白质和jagged家族的蛋白质以及notch加工或切割的抑制剂，或其变体或功能片段。其它生长因子可以包括胰岛素样生长因子家族成员(igf)、胰岛素、wingless相关(wnt)因子家族和刺猬(hedgehog)因子家族或其变体或功能片段。可以添加其它因子来促进中内胚层干/祖细胞、内胚层干/祖细胞、中胚层干/祖细胞、或定形内胚层干/祖细胞的增殖和存活以及这些祖细胞的衍生物的存活和分化。
[0113]
此处所述的组合物可用于筛选测试化合物，以确定测试化合物是否调节可分化细胞的多能性、增殖和/或分化。本领域技术人员可以容易地确定可分化细胞的多能性、增殖和/或分化。非限制性方法包括检查细胞形态学、各种标记物的表达、畸胎瘤形成、细胞计数和测量阻抗。
[0114]
可分化细胞向所需细胞谱系的进展或者其未分化状态的保持可以通过定量所需细胞谱系特有的标记基因的表达以及可分化细胞类型特有的标记基因表达的缺乏来监测。一种定量这样的标记基因表达的方法是使用定量pcr(q
‑
pcr)。进行q
‑
pcr的方法是本领域公知的。本领域公知的其它方法也可以用来定量标记基因的表达。标记基因的表达可以利用目标标记基因特异性抗体进行检测。
[0115]
在某些实施方案中，筛选方法包括鉴定能够调节可分化细胞的多能性、增殖和/或分化的化合物的方法，包括：(a)提供可分化细胞；(b)在含有基础盐养分溶液和erbb3配体
的组合物中培养细胞，其中该组合物基本不含血清；(c)使细胞接触测试化合物；以及确定在与该化合物接触的细胞中是发生多能性、增殖和/或分化的增加还是降低，所述增加表示该化合物调节多能性、增殖和/或分化。在某些实施方案中，erbb3配体是hrg
‑
β。在另外一些实施方案中，erbb3配体可以用测试化合物代替，以测定测试化合物的作用。例如，测试化合物对多能性、增殖和/或分化的影响可以与erbb3配体对多能性、增殖和/或分化的影响进行比较，以确定测试化合物对可分化细胞的作用。预期此处所述的任一种组合物可以用于本发明的筛选方法中。
[0116]
在另外一个实施方案中，细胞可以在不存在erbb3配体(erbb2
‑
引导的酪氨酸激酶活性)的情况下培养，以确定不存在erbb3配体(erbb2
‑
引导的酪氨酸激酶活性)对细胞的影响。
[0117]
利用此处所述的方法，可以产生含有所需细胞谱系而基本上不含其它细胞型的组合物。可选择地，也可以产生含有可分化细胞和所需细胞谱系的混合物的组合物。
[0118]
在本发明的一些实施方案中，所需细胞谱系的细胞可以利用这些细胞特异性的亲和标签来分离。靶细胞特异性的亲和标签的一个例子是存在于靶细胞表面上但是基本不存在于其它细胞型上的标记多肽的特异性抗体，该标记多肽将在通过此处所述的方法产生的细胞培养物中发现。
[0119]
本发明还涉及试剂盒，其中该试剂盒包括基础盐养分溶液和至少一种能够刺激erbb2
‑
引导的酪氨酸激酶活性的化合物。在一个实施方案中，该试剂盒包含至少一种如此处所述的erbb3配体。在另外一个实施方案中，该试剂盒包含一种以上的erbb3配体。在另外一个实施方案中，该试剂盒包含如此处所述的tgf
‑
β或tgf
‑
β家族成员或其变体或功能片段中的至少一种。在另外一个实施方案中，试剂盒包含tgf
‑
β或tgf
‑
β家族成员或其变体或功能片段中的一种以上。在另外一个实施方案中，试剂盒包含至少一种成纤维细胞生长因子或其变体或功能片段。在另外一个实施方案中，试剂盒包含一种以上的成纤维细胞生长因子或其变体或功能片段。在一个特定实施方案中，试剂盒包含fgf
‑
7、fgf
‑
10、fgf
‑
22或其变体或功能片段中的至少一种。在另外一个实施方案中，试剂盒包含血清白蛋白。在另外一个实施方案中，试剂盒包含血清和/或至少一种本文所述的不溶性基质和/或至少一种解聚溶液。
[0120]
本发明的试剂盒实际上可以包括以上所述或本文其它部分所述的成分的任意组合。本领域技术人员应当认识到，本发明的试剂盒提供的成分将随试剂盒的预期用途而不同。因此，试剂盒可以设计为行使本申请中所述的各种功能，并且该试剂盒的成分相应地改变。
[0121]
在整个本申请中，参考了许多出版物。所有这些出版物和这些出版物中引用的参考文献的公开内容全部引入到本申请中作为参考，以便更全面地描述本发明所属领域的状态。
实施例
[0122]
在此处所述的一些实验中使用人胚胎干细胞系bg01v(bresagen、inc.,athens,ga)。bg01v hesc细胞系是核型变异的细胞系，它表现出稳定的含有特定三体的核型(核型:49,xxy,+12,+17)。亲代培养物如前所述保持(schulz等人,2003,bmc neurosci.,4:27；
schulz等人,2004,stem cells,22(7):1218
‑
38；rosler等人,2004,dev.dynamics,229:259
‑
274；brimble等人,2004stem cells dev.,13:585
‑
596)。简而言之，细胞在matrigel
tm
或纤连蛋白包被的培养皿中在来自小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)的条件培养基(mef
‑
cm)中生长，该培养基含有dmem:f12，其中含有20％ksr、8ng/ml fgf2、2mm l
‑
谷氨酰胺、1
×
非必需氨基酸、0.5u/ml青霉素、0.5u/ml链霉素、0.1mmβ
‑
巯基乙醇(sigma,st.louis,missouri,usa)，用胶原酶传代。
[0123]
此处测试的确定成分培养基(dc)含有dmem/f12、2mm glutamax、1
×
非必需氨基酸、0.5u/ml青霉素、0.5u/ml链霉素、10μg/ml转铁蛋白(均来自invitrogen,carlsbad,california,usa)、0.1mmβ
‑
巯基乙醇(sigma)、0.2％不含脂肪酸的cohn's组分v bsa(serologicals),1
×
痕量元素混合物a、b和c(cellgro)和50μg/ml抗坏血酸(sigma)。使用可变水平的重组生长因子，包括fgf2(sigma)、longr3
‑
igf1(jrh biosciences)、调蛋白
‑
βegf域(hrgβ,peprotech)、tgfβ(r&d systems)、nodal(r&d systems)、lif(r&d systems)、egf(r&d systems)、tgfα(r&d systems)、hrgα(r&d systems)、bmp4(r&d systems)和激活蛋白a(r&d systems)。longr3
‑
igf1是igf1的修饰形式，其具有降低的igf1结合蛋白亲和力，其中一些在hesc中表达。dc
‑
haif是如上所述的确定成分培养基，含有10ng/ml hrg
‑
β、10ng/ml激活蛋白a、200ng/ml lr
‑
igf1和8ng/ml fgf2。dc
‑
hai是如上所述的确定成分培养基，含有10ng/ml hrg
‑
β、10ng/ml激活蛋白a和200ng/ml lr
‑
igf1。在dc
‑
haif和dc
‑
hai中，lr
‑
igf1成分当然可以用ifg1代替。
[0124]
matrigel
tm
包被的培养皿通过将生长因子减少的bd matrigel
tm
基质(bd biosciences,franklin lakes,new jersey,usa)在冷dmem/f
‑
12中稀释至大约1:30至大约1:1000的终浓度范围而制备。在一个实施方案中，matrigel
tm
的浓度大约为1:200。每35mm培养皿用1ml在室温下包被培养皿1
‑
2小时或者在4℃下至少过夜。培养板在4℃保存可达1周。使用前立即除去matrigel
tm
溶液。
[0125]
对于测试条件，将亲代培养物平板接种到6
‑
孔培养皿上，用于多种条件的比较。培养物一般直接平板接种到测试条件中。每天评价培养物，并且在平板接种后4
‑
5天基于形态学标准进行分级。分级标准1
‑
5涉及检测整个培养物和评价未分化集落的总比例，它们的相对大小，以及表现出明显分化的集落比例或集落份数。级别5表示“理想的”培养物，具有大的未分化集落和可以忽略的分化。级别4表示非常好的培养物，但是具有一定的明显分化。级别3表示可以接受的培养物，但是有大约一半的集落表现明显的分化。级别2的培养物大部分分化，偶尔有推断的未分化细胞。级别1的培养物含有分化的集落或者该培养物不贴壁或者不存活。将表现出良好的未分化细胞扩增的培养物传代，以评价在这些条件中的长期培养。
[0126]
实施例1
–
erbb1
‑
3、nrg1和adam 19在bg01v细胞中的表达
[0127]
利用实时rt
‑
pcr证明erbb1
‑
3、神经调节蛋白和adam
‑
19在bg01v细胞中的表达(图1)。收获在如上所述的含有100ng/ml longr3
‑
igf1(lr
‑
igf1)、8ng/ml fgf2和1ng/ml激活蛋白a的dc培养基中培养的bg01v细胞，并且利用rneasy微型试剂盒(qiagen)按照使用说明制备rna。用iscript试剂盒(biorad)制备第一链cdna，使用mj research opticon热循环仪进行实时pcr。
[0128]
用于adam19(hs00224960_m1)、egfr(hs00193306_m1)、erbb2(hs00170433_m1)、
erbb3(hs00176538_m1)、nrg1(hs00247620_m1)、oct4(hs00742896_s1)和对照gapdh的请求taqman测定(applied biosystems)使用taqman通用pcr(applied biosystems)。实时扩增图显示在图1中，证明这些转录物在未分化的bg01v细胞中表达。
[0129]
实施例2
‑
erbb2的抑制延缓了bg01v细胞的增殖
[0130]
配体的egf域家族与受体酪氨酸激酶的erbb家族结合。为了检查erbb酪氨酸激酶的已知抑制剂在hesc中的作用，将bg01v细胞平板接种到6孔板中的1:1000稀释的matrigel
tm
上，在含有100ng/ml longr3
‑
igf1、8ng/ml fgf2和1ng/ml激活蛋白a的确定成分培养基(dc)中。次日加入dmso(载体对照)、50nm
‑
20μm ag1478(一种erbb1抑制剂)或100nm
‑
20μm ag879(一种erbb2抑制剂)以及新鲜培养基。将细胞再培养5天，每日更换培养基。然后将培养物固定，并且针对碱性磷酸酶活性染色。
[0131]
在对照和ag1478培养的细胞中观察到ap+bg01v细胞的亚汇合集落(图2a和b)，表明dmso和ag1478(50nm
‑
20μm)对细胞增殖都没有明显的影响。然而，ag879在5μm时实际上抑制细胞生长(图2c)并且在20μm时导致细胞死亡(未显示)。在ag879中生长的培养物看起来不分化，并且保持多能形态学和碱性磷酸酶活性，表示ag879似乎抑制增殖而不诱导分化，提示bg01v细胞的细胞存活依赖于erbb2信号。相反，在与上述相似的条件中生长的bg01v细胞的增殖似乎不依赖于erbb1信号。
[0132]
实施例3
–
bg01v细胞保持在含有调蛋白的确定成分培养基中
[0133]
erbb2和erbb3的表达和使用ag879的增殖的抑制提示bg01v细胞具有活跃的内源erbb信号并且它们也可以对外源hrg
‑
β产生响应。bg01v细胞在含有10ng/ml hrg
‑
β、200ng/ml longr3
‑
igf1、8ng/ml fgf2和10ng/ml激活蛋白a的dc培养基中在1:1000稀释的matrigel
tm
上生长(图3a和b)。这些细胞生长4代，或者>20天，表现出未分化的形态学，并且不显示升高的自发分化。
[0134]
此外，bg01v细胞也在含有10ng/ml hrgβ、200ng/ml longr3
‑
igf1和10ng/ml激活蛋白a的dc培养基中保持2代，或者>13天。这些培养物正常增殖，并且表现出极低的自发分化，证明bg01v细胞能够保持在含有hrgβ而不存在fgf2的确定成分条件中。
[0135]
实施例4
‑
erbb2
‑
引导的酪氨酸激酶在es细胞中的作用
[0136]
rt
‑
pcr证实mesc表达adam19、神经调节蛋白1(nrg1)和erbb1
‑
4(图4a)。在mesc中，erbb2和3看来以高于erbb1的水平表达，检测到低水平的erbb4。这些数据提示内源hrg
‑
β可能参与引导mesc的自我更新。
[0137]
也检测到erbb受体转录物在小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)中的表达(图4b)。mef是来源于在历史上用于保持小鼠和人ec细胞和es细胞的e12.5
‑
13.5viscera(内脏)的非均一的细胞群体。该群体中nrg1和adam19的表达提示hrg
‑
β胞外域也存在于mef条件培养基中，并且可以对多能性发挥显著作用。
[0138]
ag1478和ag879用于检测hrg/erbb信号在小鼠es细胞中的作用。r1小鼠es细胞保持在dmem、10％fbs、10％ksr、0.5u/ml青霉素、0.5u/ml链霉素、1
×
neaa、1mm丙酮酸钠、1000u/ml lif(esgro)、0.1mmβ
‑
me的标准条件中，并且用0.5％胰蛋白酶/edta传代。将2
×
105细胞/孔平板接种到6孔板中1:1000稀释的matrigel
tm
上。接种后第二天，加入dmso(载体对照)、1
‑
50μm ag1478或1
‑
50μm ag879及新鲜培养基。细胞再培养8天，每天更换培养基。然后固定培养物并且针对碱性磷酸酶活性染色。
[0139]
dmso和1
‑
50μm ag1478对细胞增殖没有明显影响，观察到亚汇合的碱性磷酸酶阳性mesc集落(图5a
‑
c)。然而，ag879在50μm时实际上抑制细胞生长(比较图5d和5f)，并且在20μm时可延缓增殖(图5e)。在ag879中生长的mesc似乎不分化，并且保持多能形态学和碱性磷酸酶活性。
[0140]
结果表明ag879抑制mesc的增殖，而不诱导其分化，提示mesc的增殖需要erbb2信号。相反，mesc的增殖似乎不依赖于erbb1信号。对于mesc，抑制增殖所需的ag879浓度比在确定成分条件中生长的bg01v细胞高大约10倍，表示mesc条件中使用的血清可能干扰药物活性，ag879对小鼠erbb2酪氨酸激酶比对人erbb2酪氨酸激酶具有较低的亲和力，或者erbb2对不同种类的es细胞可能起略微不同的作用。
[0141]
另外一种高度选择性的erbb2酪氨酸激酶抑制剂，酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)ag825(murillo,等人.2001cancer res 61,7408
‑
7412)，用来研究erbb2在人esc中的作用。ag825显著抑制在条件培养基(cm)中生长的hesc的增殖(图6a)。ag825抑制增殖但没有广泛的细胞死亡，活hesc可以保持>5天(未显示)。western印迹法显示，在dc
‑
haif中生长的饥饿的/调蛋白(hrg)脉冲的hesc中，ag825抑制erbb2在酪氨酸
‑
1248处的自磷酸化(图6b)。因此，erbb2信号途径的中断严重抑制了hesc的增殖。为了在确定的生长条件中建立hesc，培养物可以直接从cm条件传代到dc
‑
haif中，并且表现出最低的自发分化(图6c)。在本发明的一个实施方案中，集落和细胞计数测定证实longr3
‑
igf1和hrg在自我更新和增殖中起主要作用(图6d,6e)。在稳态dc
‑
haif培养物和用dc
‑
haif脉冲的饥饿培养物中也观察到igf1r、ir、fgf2α、erbb2和erbb3的磷酸化(图6f)。
[0142]
实施例5
‑
小鼠es细胞在确定成分条件中的培养
[0143]
为了进一步检测hrg/erbb2信号在小鼠es细胞中的作用，在使用生长因子组合的dc培养基中检测了r1 es细胞的增殖。将1
×
105细胞/孔平板接种到0.2％明胶包被的6孔板中，在含有10ng/ml hrg
‑
β、100ng/ml longr3
‑
igf1、1ng/ml激活蛋白a、1000u/ml小鼠lif或10ng/ml bmp4组合的dc中(下面的表1)。在8天中观察到增殖。
[0144]
活集落只在至少含有lif/hrg
‑
β或lif/bmp4的条件中生长(表1)。当向这些组合中添加longr3
‑
igf1或激活蛋白时没有观察到其它明显的益处。在对照亲代培养物中观察到正常增殖，在不含任何生长因子的确定成分培养基中没有观察到活集落。
[0145]
表1
[0146][0147]
通过将2
×
105细胞/孔接种到6孔板中的1:1000matrigel
tm
上在选择的10或50ng/ml hrg
‑
β、10ng/ml egf、1000u/ml lif或10ng/ml bmp4组合中进行定量测定。培养物生长8天，固定，计数碱性磷酸酶集落数(图7a)。在不含生长因子的确定成分条件中没有观察到集落，使用hrg
‑
β、hrg
‑
β/egf和hrg
‑
β/bmp组合观察到<45个集落。在单独的lif中观察到1358个集落，在10ng/ml hrg
‑
β/lif和50ng/ml hrg
‑
β/lif组合中分别观察到4114和3734个集落。这表明在确定的条件中，单独的lif提供实质的多能信号，hrg
‑
β表现出与lif的高协同效应，在该测定中使mesc集落的增殖数超过两倍。该测定的低放大倍数图像也表明了这种协同增殖作用(图7b
‑
g)。
[0148]
实施例6
‑
在dc
‑
haif中保持的人胚胎干细胞(hescs)的多能性的表征
[0149]
利用多种方法证实hesc在dc
‑
haif中保持可塑性。在dc
‑
haif中培养6个月(25代)的bg02细胞保持在体外形成复杂的畸胎瘤(图8a)和三个胚层的代表(图8b)的潜力。转录分析用来比较在cm和dc
‑
haif中保持的hesc细胞中的总体表达(liu等人2006,bmc dev biol 6,20)。在dc
‑
haif中生长10和32代的bg02细胞中和在cm中生长64代的bg02细胞中检测到超过11,600种转录物。所有群体具有大约10364种共同的转录物(图8c)，包括已知的hesc标记，如cd9、dnmt3、nanog、oct4、tert和utf1(未显示)。在cm和dc
‑
haif培养的比较中(r2选择＝0.928)以及在早期和晚期传代细胞的比较中(r2选择＝0.959)观察到高相关系数(图8d)。分级群聚分析证实在dc
‑
haif中保持的bg02细胞紧密群聚，并且与在cm中保持的bg02和bg03细胞保持密切相似性(图8e)。这些数据与以前显示未分化的hesc与胚状体或成纤维细胞相比紧密群聚的分析(liu等人2006,bmc dev biol 6:20)一致。因此，在本发明的组合物中保持的细胞能够保持关键的多能性标记。因此，本发明的组合物可以用作支持可分化细胞自我更新的简单培养基。
[0150]
实施例7
‑
人胚胎干细胞(hesc)在dc
‑
haif中的人源化细胞外基质(ecm)上的保持
[0151]
为了研究erbb2信号的作用和开发用于hesc的确定成分培养基，dc
‑
haif培养物最初在用生长因子减少的matrigel
tm
1:30包被的培养皿中扩增，但是也可以成功地长期保持在以1:200(图9a)或1:1000稀释的该基质上。bg02和cyt49 hesc也可以在人血清(图9b)、人
纤连蛋白(图9c)或vitrogro
tm
(图9d)(这是一种专利人源化ecm)包被的组织培养皿上保持>5代。
[0152]
实施例8
‑
人胚胎干细胞(hesc)的单细胞传代
[0153]
多个研究小组证明了某些三倍体，特别是hchr12和17的三倍体，在特定亚最佳培养条件下在hesc中积累(baker等人,2007nat.biotech.25(2):207
‑
215)。当在传代时将培养物分离为单细胞时，三倍体的出现似乎与较差的细胞存活最直接相关，为携带这些非整倍体的细胞提供了推断的强选择性生长优点。相反，在本发明的一个实施方案(dc
‑
haif)中生长的hesc在分离为单细胞后的平板接种时保持高存活力(图10a
‑
d)。bg01和bg02细胞在分别用accutase
tm
传代>18和19代后保持正常核型(图10e)。细胞中正常核型的保持证明hesc培养物解聚为单细胞不会固有地导致这些三体在dc
‑
haif中保持的hesc中积累。bg01和bg02培养物也通过用多种传代试剂解聚为单细胞进行传代(图11)。用accutase
tm
、0.25％胰蛋白酶/edta、tryple或versene
tm
(edta)将培养物分离5代并且进行核型定型。数据证明，使用多种细胞解聚试剂在本发明的组合物中培养和传代hesc至少在两个人胚胎细胞系中保持正常核型。
[0154]
使用本发明的组合物大规模扩增未分化的hesc也是可能的。bg02细胞在60mm平板中的起始汇合培养物在dc
‑
haif中扩增4代，在单一实验中在20天内产生>1.12
×
10
10
细胞。当通过流式细胞术检查时，该批中的>85％的细胞保持多能性标记如oct4、cd9、ssea
‑
4、tra
‑1‑
81的表达，这证明了培养物保持未分化(图12a)。通过rt
‑
pcr分析也观察到其它多能性标记的表达，而未检测到分化谱系的标记甲胎蛋白、msx1和hand1(图12b)。荧光原位杂交分析证明，对于hchr12(98％2
‑
拷贝)、hchr17(98％2
‑
拷贝)、hchrx(95％1
‑
拷贝)和hchry(98％1
‑
拷贝)，在dc
‑
haif中培养和传代的细胞保持预期的拷贝数(图12c)。核型分析也证明这些细胞中保持正常整倍体染色体含量和带型分布。
[0155]
实施例9
‑
胰岛素和igf1在以生理浓度应用时对hesc具有不同的影响
[0156]
迄今为止报道的基本上所有hesc培养条件都包括超过生理水平的胰岛素，它可以刺激ir和igf1r。为了区别胰岛素和胰岛素替代物的活性与igf1进行比较，hesc在确定成分培养基条件下在生理水平的这些生长因子中培养。胰岛素和igf1的浓度从大约0.2ng/ml滴定至大约200ng/ml，并且在5天后通过计数细胞监测细胞增殖。将成功扩增的培养物连续传代5次。生理水平的igf1支持hesc培养物的扩增，而生理水平的胰岛素不支持，表明胰岛素或胰岛素替代物的活性不能代替igf1，并且igf1和胰岛素(或胰岛素替代物)在对hesc的作用方面代表了不同的生物活性类别。
[0157]
实施例10
–
筛查补充物的作用的方法
[0158]
为了在开始时检查维生素b
12
和维生素b6对以中间密度生长的hesc的生长或分化的影响，利用accutase
tm
分离bg02细胞，并将1
×
105细胞/孔平板接种到6孔板的确定成分培养基(dc)中。dc培养基含有10ng/ml hrg
‑
β、200ng/ml longr3
‑
igf1和10ng/ml fgf10。向实验孔中添加维生素b6(0.5μm)和/或维生素b
12
(0.5μm)。7天后计数每种条件下的细胞数。实验孔和对照孔的细胞计数和集落计数将提供关于维生素b
12
和维生素b6对细胞生长的影响的认识。
[0159]
另外，分化标记，如oct4，可以在实验孔中测定，以确定添加物和补充物对可分化细胞的分化状态的影响。
[0160]
实施例11
–
在不存在fgf2的情况下hesc的培养
[0161]
bg02细胞在dc
‑
hai中长期保存20代(图13a)，bg01细胞也在dc
‑
hai中连续传代，两者均不含有fgf2。培养物没有变差或表现明显的分化，并且在整个培养期间表现未分化集落的正常扩增。bg02培养物中正常男性核型的保持在dc
‑
hai中传代6次后得到证实(图13b,20/20正常中期涂布(spreads))。
[0162]
利用转录分析比较在dc
‑
haif和dc
‑
hai中保持的hesc细胞的总体表达。利用trizol(invitrogen)从hesc中分离总细胞rna，并且用dnase i(invitrogen)按照厂商建议的方案处理。样品扩增采用illumina rna扩增试剂盒用100ng总rna进行，通过以1:1的比例掺入生物素
‑
16
‑
utp(perkin elmer life and analytical sciences)和未标记的utp实现标记。按照使用说明(illumina,inc.)将标记的扩增材料(每个阵列700ng)与含有47,296个转录物探针的illumina sentrix human
‑
6 expression beadchips杂交。阵列用illumina bead array reader共焦扫描仪扫描，并且使用illumina beadstudio软件按照厂商说明进行原始数据处理、本底扣除和数据分析。利用0.99的最小检测置信评分(表示目标序列信号可与阴性对照区别的计算的截断值)鉴别转录物表达的存在或不存在。使用对其它hesc样品所述的平行方法(liu等人2006,bmc dev biol 6:20)进行数据分析。分级群聚如以前所述进行(liu等人2005,bmc dev biol 6:20)，它是基于作为相似性度量的平均连接和欧几里德距离，利用通过anova确定的差别表达的基因(p<0.05)。在阵列生产中使用的灵敏度和质量控制检测和在bead studio软件中使用的算法的详细说明可从illumina,inc(san diego,ca)获得。检测的大多数转录物在dc
‑
haif和dc
‑
hai bg02培养物中均表达，包括已知的hesc标记，如cd9、dnmt3、nanog、oct4、tert和utf1(未显示)。在dc
‑
haif和dc
‑
hai培养物的比较中观察到高相关系数(r2选择＝0.961)(图14)。分级群聚分析证实在dc
‑
hai中保持的bg02细胞紧密群聚，并且与在dc
‑
haif中保持的细胞以及多种培养形式的bg02和其它hesc细胞系保持密切相似性(图15)。这些数据与以前显示未分化的hesc与胚状体或成纤维细胞相比紧密群聚的分析(liu等人2006,bmc dev biol 6:20)一致。
[0163]
此外，在dc
‑
ha i中保持的bg02细胞在scid
‑
beige小鼠中形成的复杂畸胎瘤中分化为中胚层、内胚层和外胚层的代表(未显示)，正式证实了在不存在外源fgf2的情况下生长的培养物中保持多能性。
[0164]
为了检查在单细胞传代中是否需要外源fgf2，将bg01细胞用accutase
tm
传代并且在只含有10ng/ml hrg
‑
β和200ng/ml longr3
‑
igf1的确定成分条件(dc
‑
hi)中生长。这些dc
‑
hi培养物保持10代，不显示明显的分化或者增殖延缓。
[0165]
这些研究清楚地证实，当在最少地含有调蛋白和igf1的确定成分培养基中保持hesc时不需要提供外源fgf2。而且，不含fgf2的培养物保持关键的多能性，包括转录谱和在体内向中胚层、内胚层和外胚层的分化。