一个根结线虫抗性基因Mg1及其紧密连锁分子标记的应用

一个根结线虫抗性基因mg1及其紧密连锁分子标记的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一个根结线虫抗性基因mg1及其紧密连锁分子标记及应用。


背景技术：

2.根结线虫是一类重要的植物寄生性线虫，其病害属土传病害，具有传播性强，传播范围广的特点。每年全世界因根结线虫疾病造成的经济损失超过700亿美元(nicol et al.,2011)，而来自于水稻的损失占其中的20％(sasser and freckman,1987)。拟禾本科根结线虫(meloi dogyne graminicola，简称mg)又称水稻根结线虫，是水稻生态系统中最普遍的寄生性线虫之一。其分布范围广泛，遍及亚洲、南美洲、北美洲、欧洲、非洲等地，但主要分布在亚种水稻种植区。由于mg在水稻的根内完成产卵过程，可较好的适应淹水环境，在环境适宜的条件下又可孵化为j2进行二次侵染，且能与其他类型的生物和非生物胁迫如干旱协同作用，因此对水稻高产和稳产造成巨大威胁。并且伴随全球气候变暖、水资源短缺等一系列气候环境问题，水稻的栽培模式必将由传统的水稻淹水灌溉模式趋向于旱稻栽培模式发展，将进一步加重由mg侵染造成的水稻减产。目前，采用淹水、轮作、施用杀线虫剂等措施能在一定程度上减少mg对水稻的危害，但这些防治措施同时存在水土资源浪费、效果差、污染环境等不容忽视的缺点。
3.目前，已发现的水稻抗mg品种主要包括非洲栽培稻(o.glaberrima)、长雄野生稻(o.l ongistaminata)(plowright et al.,1999；soriano et al.,1999；cabasan et al.,2012)，展颖野生稻(o.glumaepatula)(mattos et al.,2019)以及籼稻品种ld24(dimkpa et al.,2016)、 shenliangyou 1、cliangyou 4418(zhan et al.,2018)等。另外，近期研究发现粳稻品种中花11也对mg表现出较强抗性(zhan et al.,2018)。对mg表现出较强抗性的野生稻品种由于存在低产、杂交不育、后代抗性不稳定等问题一直未被很好的应用，因此常规籼稻和粳稻品种中抗性位点的发掘工作至关重要。shrestha等(2007)使用bala和azucena两个水稻品种构建了遗传作图群体，发现在1、2、6、7、9和11号染色体上存在mg的抗性qtl s；jena等(2013)利用mg敏感品种annapurna和高抗品种ramakrishna的重组自交系在水稻3和11号染色体上鉴定到与根结数目和线虫产卵块数目相关的qtls；dimkpa等(2016) 通过对全球范围内收集的五个亚洲稻水稻亚群进行mg接种实验，发现与水稻根结数目相关的qtls存在染色体1、3、4、5、11和12上；mhatre等(2017)对印度的mg抗性品种a bhishek和敏感品种bangla patni杂交后代f2群体进行bsa分析，推测在水稻第10号染色体上的标记(hvssr10-21)与abhishek中抗性基因座相关；phan等(2018)报道了亚洲水稻品种中花11对mg表现出超敏反应，认为其中的mg抗性基因为主效、显性抗性基因。la hari等(2019)利用qtl-seq技术对mg抗性品种ld24和khao pahk maw与敏感品种va llone nano的两个杂交f2群体进行抗性位点分析，发现水稻11号染色体底部23mbp附近存在一个线虫抗性位点，表明两个品种的抗性归结于同一基因座的渗入。
4.到目前为止，有关mg抗性位点的发掘工作未有明确结论，其抗性基因的克隆工作
还未见报道。因此水稻mg抗性基因的分离和获得对水稻的抗性育种具有重要的理论和应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是提供一种拟禾本科根结线虫抗性基因mg1，所述基因的cds序列为seqidno.1所示，编码的氨基酸序列为seqidno.2所示。
6.本发明的另一个目的在于提供了编码seqidno.2所示氨基酸序列的基因在控制水稻拟禾本科根结线虫抗性敏感性中的应用。
7.本发明的还有一个目的在于提供了与水稻拟禾本科根结线虫抗性性状相关联的分子标记引物，所述的分子标记引物为：wxm1-f:gaggagtggtcctttgttgaag和wxm1-r:atagctgctccaaaccacccaac；和/或cr24-f:tcgtcatgtggtttctggc和cr24-r：tgttgcagttgcttctgc。
8.本发明的最后一个目的在于提供了与水稻拟禾本科根结线虫抗性性状相关联的分子标记引物的应用。
9.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
10.申请人对来自美国农业部及常规栽培稻和野生稻品种共209个进行了mg接种抗性品种筛选实验，以其中一个抗线虫粳稻品种zh11做为研究对象，与线虫敏感籼稻品种乐辉188和明辉63(mh63)分别构建f2作图群体，采用传统的图位克隆的方法，将zh11中的mg抗性基因定位至mh15和mh20两个maker之间，最终获得拟禾本科根结线虫抗性基因mg1基因的cdna序列，所述的cdna序列为seqidno.1所示，编码的蛋白质为seqidno.2所示
11.本发明的保护范围包括：
12.编码seqidno.2所示氨基酸序列的基因在控制水稻拟禾本科根结线虫抗性敏感性中的应用，即使用现有技术，例如敲除，沉默或过表达等方式来控制mg1基因的表达，从而实现对水稻抗性敏感性的控制。
13.具体的，将抗病品种mg1基因利用基因编辑进行突变后会导致抗性丧失；过表达该基因则使水稻对mg所引起的病害产生特异性的抗病反应。
14.针对本发明的克隆的新基因，申请人设计了两个分子标记引物，分别为：wxm1-f:gaggagtggtcctttgttgaag和wxm1-r:atagctgctccaaaccacccaac；和/或cr24-f:tcgtcatgtggtttctggc和cr24-r：tgttgcagttgcttctgc。
15.利用上述引物之一或者二者联用，都可用于抗性水稻品种的筛选。
16.含有本发明编码seqidno.2所示氨基酸序列的基因的水稻还可用于抗拟禾本科根结线虫水稻的育种。
17.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
18.将克隆的拟禾本科根结线虫抗性基因mg1转入感病植物体中，有助于获得新的抗病植物。将具有抗性基因mg1的水稻与其它感病水稻杂交产生具有抗性的子代植物。克隆的抗病基因能在不同的物种间转移并利用，从而能够克服传统抗病育种中远缘杂交的困难。可以借助转基因技术在植物中累加多个抗病基因。此外，利用分子标记辅助育种，可缩短育种周期，提高品种选育效率。
附图说明
19.图1为拟禾本科根结线虫抗性水稻品种的抗性鉴定示意图；
20.其中：a中nip为mg敏感品种，mc162，mc174和zh11为mg抗性品种；b为接种mg 15天后，mg抗感水稻品种单株平均根结数和根内不同发育阶段的mg平均数。j2：二龄幼虫；j3：三龄幼虫；j4/females：四龄或成熟的雌虫。
21.图2为拟禾本科根结线虫抗性基因mg1基因敲除突变体植株的mg抗性鉴定图。
22.其中：a为扩增出的抗性基因mg1的cdna示意图；b为根结数目统计；c为接种m g 15天后敏感品种nip、抗性品种zh11以及mg1纯合敲除突变体根部表型；d为根部酸性品红染色后的表型，mg1敲除突变体表现出明显的敏感表型。
23.图3为将mg1通过遗传转化导入敏感品种nip的抗性鉴定图。
24.其中：a为转入过表达载体pcambia1300中的mg1片段；b-d图为接种mg 15天后敏感品种nip、抗性品种zh11以及mg1过表达突变体mg1-7和mg1-9的根部表型、根结数目以及rt-pcr结果；mg1过表达突变体表现出明显的抗性表型。
25.图4为zh11与华占杂交后回交获得了具有mg抗性的bc3f4。
26.图5为分别使用两对分子标记对不同水稻品种的分子鉴定结果。
具体实施方式
27.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特备说明，均来源于商业渠道。
28.在本发明实施例中mg抗性实验的过程参考(nahar et al.,2011；dimkpa et al.,2015；
29.yimer et al.,2018；)
30.实施例1：
31.拟禾本科根结线虫抗性基因mg1基因的获得：
32.申请人对来自美国农业部及常规栽培稻和野生稻品种共209个进行了mg接种抗性品种筛选实验，共筛选到4个高抗品种zh11、mc79、mc162、mc174(图1)，以其中一个抗线虫粳稻品种zh11做为研究对象，与线虫敏感籼稻品种乐辉188和明辉63(mh63)分别构建f2作图群体，采用传统的图位克隆的方法，将zh11中的mg抗性基因定位至mh15 和mh20两个maker之间，以zh11根尖总rna反转录产物为模板，根据基因预测结果设计5’和3’race引物，获得候选基因5’末端及3’末端序列，确定了mg1的转录起始位点及终止位点，并拼接出全长cdna序列(图2中a)，所述的cdna序列为seq id no.1 所示，编码的蛋白质为seq id no.2所示。
33.实施例2：
34.抗性基因mg1在控制水稻对根结线虫的敏感性中的应用：
35.利用crispr/cas9系统构建水稻拟禾本科根结线虫抗性候选mg1基因敲除株系。在m g1的cds区挑选两个靶位点，grna序列分别为：ctcaaccgcagacatcataa和ag gtgttttacaaacttctc。根据golden gate的连接方法(engler et al 2008)将两个个tr na-grna串联起来，构建出ptg片段(xie et al 2015)。将组装好的ptg片段通过pcr扩增和fokⅰ酶切后，通过t4 dna连接酶连入prgeb32载体中的bsaⅰ克隆位点，从而得到 mg1敲除表达载体。
258bp，而长度为190bp和285bp的条带可在3％琼脂糖凝胶中被区分，而敏感品种由于此区间不存在mboⅰ切割位点，片段长度为487bp。针对标记wxm1设计的引物为：wxm1-f: gaggagtggtcctttgttgaag和wxm1-r:atagctgctccaaaccacccaac。
52.另外，在mg1基因附近存在cr24标记，mg抗性品种扩增后的片段长度为423bp，而敏感品种为541bp。针对标记cr24设计的引物为：cr24-f:tcgtcatgtggtttctggc和cr24-r：t gttgcagttgcttctgc。
53.1.材料和方法
54.1.1材料：包含前人研究中的核心种质资源(wang et al.,2016)和已公开的水稻常规栽培稻品种野生稻品种(dimkpa et al.,2015)。mg抗性品种zh11、ld24、174、162、kpm(含水稻抗根结线虫基因mg1)、mc79(不含水稻抗根结线虫基因mg1)；mg敏感水稻品种华占、tp309、nip、mc111、mc112、ta mao tsao、koshihikari、r498、kasalath、mh63。
55.1.2方法
56.ctab抽提法提取水稻样品基因组dna。分别用引物wxm1和cr24扩增样品dna。 10μl反应体系包括：taq dna polymerase(5u/ul)0.1μl；10
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taq buffer 1μl；dntp(10mm)； 10μm f/r引物各0.4μl；50ngdna模板；ddh2o补至10μl。扩增反应在pcr仪上进行： 94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，39个循环；72℃5min。wxm1的扩增产物经mboⅰ酶切3h后，经3％的琼脂糖凝胶分离，电泳后分析；cr24的扩增产物用3％的琼脂糖胶分离，电泳后可以直接分析。
57.2.结果：用上述方法，分别对16个水稻品种进行扩增。结果如图5所示，表明，利用wx m1和cr24两个分子标记均能够区分出含有mg1的抗性品种zh11、ld24、174、162、k pm和不含mg1的抗性品种mc79以及其它敏感品种。由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有mg1的抗性水稻品种，从而大大提高育种效率。