党参属物种cpSSR分子标记及其应用

党参属物种cpssr分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及一种党参属物种cpssr分子标记及其应有。


背景技术：

2.党参属(codonopsis wall.)为被子植物门桔梗科党参属多年生草本植物，我国有39种且多数种类的根部具有药用价值。在目前临床应用中，各种党参、珠子参、鸡蛋参等均具有不同程度补脾、生津、催乳、祛痰、止咳、止血、益气、固脱等功效，还具有增加血色素、红血球、白血球，收缩子宫、抑制心动过速等作用。本属中目前利用最为广泛的是党参，现已普遍应用并已形成大宗药材商品的包括川党参、管花党参、灰毛党参、球花党参及新疆党参，由于需要量逐渐增多，本属中可利用的种类不断增多。
3.尽管党参属物种在医药行业的应用越来越多，但是不同种之间在药用成分及功效上仍有较大差异，又由于党参属物种均具有乳汁，茎直立或缠绕，叶互生、对生、簇生或假轮生，花单生于主茎与侧枝顶端，与叶柄相对，花冠上位，阔钟状、钟状、漏斗状、管状钟形或管状，果为蒴果，带有种子多数，椭圆状、长圆状或卵状，根肥大呈纺锤状或纺锤状圆柱形等相似的表型特征。因此，建立党参属物种准确、有效的鉴定方法是保证党参属药材临床用药的关键。
4.叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，具有广泛分布着微卫星序列(chloroplast simple sequence repeats，cpssr)的独立基因组。与核基因组相比，cpssr具有进化速度慢、分子量小、相对保守、结构简单和单亲遗传等特点。当前，党参属物种分子标记开发方面主要涉及转录组序列和est序列基础上开发的ssr标记，有关cpssr分子标记开发方面仍属于空白状态，因此，进行基于党参cpssr序列分析、标记开发和标记的有效利用对党参属物种的鉴定、遗传多样性分析等工作可起到重要的推动作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有党参属物种细胞质标记的缺乏，提供一种党参属物种cpssr分子标记及其应用。
6.为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：党参属物种cpssr分子标记，特异性扩增所述cpssr分子标记的pcr引物包括以下五对引物序列：
7.dsy4
‑
f：5'
‑
catcccttcaattagcct
‑
3'
8.dsy4
‑
r：5'
‑
gttccgttccatctttca
‑
3'；
9.dsy6
‑
f：5'
‑
tgaaccgacgacttacgc
‑
3'
10.dsy6
‑
r：5'
‑
gccgctatgagtttactggat
‑
3'；
11.dsy9
‑
f：5'
‑
catcccttcaattagcct
‑
3'
12.dsy9
‑
r：5'
‑
ttccgttccatctttcata
‑
3'；
13.dsy11
‑
f：5'
‑
ctgacaagtcgcactataagt
‑
3'
14.dsy11
‑
r：5'
‑
atgatgcctgttggtgtt
‑
3'；
15.dsy8
–
f：5'
‑
gataggctggttcgcttga
‑
3'
16.dsy8
–
r：5'
‑
ggtcgggtcggtagttag
‑
3'。
17.上述的cpssr分子标记在筛选或鉴别党参属物种中的应用，利用该标记将轮叶党参物种与其它党参物种区别开。
18.进一步的，上述应用，包括以下步骤：
19.1)提取待测党参属物种材料的基因组dna；
20.2)以待测党参属物种材料的基因组dna为模板，利用权利要求1所述的cpssr分子标记的五个引物对中的任意一对进行pcr扩增；
21.3)然后通过电泳检测pcr扩增产物；
22.当引物选择dsy4
‑
f和r，若能够扩增出220bp大小的特异条带，则待测党参属物种为轮叶党参物种；
23.当引物选择dsy6
‑
f和r，若能够扩增出200bp大小的特异条带，则待测党参属物种为轮叶党参物种；
24.当引物选择dsy9
‑
f和r，若能够扩增出220bp大小的特异条带，则待测党参属物种为轮叶党参物种；
25.当引物选择dsy11
‑
f和r，若能够扩增出170bp大小的特异条带，则待测党参属物种为轮叶党参物种；
26.当引物选择dsy8
‑
f和r，若能够扩增出490bp大小的特异条带，则待测党参属物种为轮叶党参物种。
27.进一步的，步骤2)中的pcr反应总体系为15μl，包括1
×
taq dna聚合酶buffer，25mm mgcl2，1.5u taq酶，15mm dntps，cpssr标记上下游引物各0.2μm、模板dna40 ng，双蒸水补齐到15μl；
28.pcr扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，50℃～60℃退火45s，72℃延伸1.5min，34个循环，最后72℃延伸5min，
29.当引物选择dsy4
‑
f和r，退火温度为55℃；
30.当引物选择dsy6
‑
f和r，退火温度为56℃；
31.当引物选择dsy9
‑
f和r，退火温度为54℃；
32.当引物选择dsy11
‑
f和r，退火温度为56℃；
33.当引物选择dsy8
‑
f和r，退火温度为55℃。
34.与现有技术相比本发明具有以下有益效果：
35.l、小党参和秦岭党参叶绿体全基因组序列均为0.17mb，最近刚公布的轮叶党参核基因组为1273.26mb。与核基因组序列相比，叶绿体基因组结构简单、分子量小，在位点分析和标记设计方面具周期短、费用低的优点。
36.2、党参cpssr标记既具有核基因组ssr标记的共显性和多态性等特点，又具有多拷贝、单亲遗传、不易发生重组等特点。本发明可以填补当前党参无细胞质遗传分子标记的空白，并丰富党参分子标记的类型。
37.3、由于叶绿体基因组中的简单重复序列主要分布于非编码区，研究表明叶绿体dna的非编码区序列在不同种群间也存在物种特异性，因此，本发明开发的党参特异性
cpssr标记能全面的反映检测物种的遗传信息，可用于对党参属物种进行准确鉴定和遗传多样性分析。
附图说明
38.图1为实施例2五对引物在3份党参属材料中的扩增结果(电泳图)；图中m：marker；1：山西陵川县野生党参；2：轮叶党参；3：大同市栽培党参；箭头表示特异条带。
具体实施方式
39.以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
40.实施例1
41.小党参cpssr位点分析
42.利用misa软件搜索小党参和秦岭党参叶绿体基因组中的ssr位点，软件设置标准为：base pair，bp 1、2、3、4、5、6bp，重复次数依次不少于10、6、5、5、5、5、5次，复合ssr小于100bp。结果表明，在轮叶党参叶绿体基因组中有29个cpssr位点，其中，单核苷酸重复基元a/t位点25个，占位点总数的86.20％；二核苷酸重复基元(at/at)和三核苷酸重复基元(aag/ctt)的cpssr位点各为2个，分别占cpssr位点总数的6.9％(表1)。
43.表1党参中不同ssr重复基序
[0044][0045]
党参cpssr引物设计
[0046]
利用primer 5.0进行cpssr标记设计，结合手动对引物进行调整。引物的设计标准为：gc含量在30％～70％，产物大小为100～300bp，tm值在55℃～65℃之间，上下游引物tm值差异不超过5℃，引物长度为18～22bp，引物gc含量30％～70％。共设计出120对cpssr引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0047]
党参cpssr标记筛选与验证
[0048]
设计出的引物选取山西陵川县野生党参、轮叶党参、大同市栽培党参3个党参属材料进行pcr反应，pcr扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测，结果发现有5对cpssr
‑
pcr在各材料间能扩增出特异条带，说明开发的cpssr
‑
pcr可进行党参属材料的鉴定分析。
[0049]
实施例2
[0050]
利用本发明提供的cpssr分子标记的五对引物进行轮叶党参属物种快速鉴定，包括以下步骤：
[0051]
(1)材料收集和dna提取
[0052]
实验所用材料分别采自山西陵川县野生党参、轮叶党参、大同市栽培党参三个党参属材料，以改良sds法提取基因组dna，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的浓度。
[0053]
(2)党参cpssr
‑
pcr反应
[0054]
cpssr
‑
pcr反应总体系为15μl，包括1
×
taq dna聚合酶buffer、25mm mgcl2、1.5u taq酶、15mm dntps、cpssr标记上下游引物各0.2μm、模板dna40 ng，双蒸水补齐到15μl。cpssr
‑
pcr反应程序为94℃预变性5min，94℃变性1min、50℃～60℃复性45s、72℃延伸1.5min，34个循环，最后72℃延伸5min。
[0055][0056][0057]
(3)党参cpssr
‑
pcr反应电泳检测
[0058]
取扩增产物2.5μl与等量6
×
上样液混合，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180v恒压1h，银染显色。
[0059]
(4)分析
[0060]
如图1所示，轮叶党参的材料能够扩增出特异条带，说明本发明开发的cpssr
‑
pcr可进行党参属材料的鉴定分析。