伪狂犬病病毒疫苗
发明领域
1.本发明总体上属于针对伪狂犬病病毒的疫苗领域。
背景技术：
2.伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)是在世界范围内感染多个动物物种的疾病。prv感染被不同地称为传染性延髓麻痹、aujeszky病和疯痒病(mad itch)。prv感染的临床症状包括流产、仔猪高死亡率、以及仔猪和成熟猪的咳嗽、打喷嚏、发烧、便秘、抑郁、癫痫发作、共济失调、转圈和过度流涎(excess salivation)。一个月以内的仔猪死亡率接近100％，但一个月到六个月的仔猪死亡率不到10％。怀孕的猪可以重吸收它们的幼崽，或者产下木乃伊、死胎或虚弱的仔猪。在牛中，症状包括强烈的瘙痒，随后是神经体征和死亡。在狗中，症状包括剧烈瘙痒、下颚和咽部麻痹、嚎叫和死亡。任何被感染的第二宿主一般只活两到三天。发痒(pruritus)或搔痒(itching)被认为是幻觉，因为在瘙痒部位从未发现病毒。
3.已知感染发生在重要的家畜动物，诸如猪、牛、狗、猫、羊、大鼠和貂中。宿主范围非常广泛，包括大多数哺乳动物以及，至少在实验上包括许多种类的鸟(关于宿主的详细列表，参见d.p.gustafson,"pseudorabies",in diseases of swine，第5版，a.d.leman等人，编辑，(1981))。然而，成年猪并且可能还有大鼠不会被这种疾病杀死，因此是携带者。然而，对其它物种来说，这种疾病是致命的。
4.猪群对prv特别敏感。虽然成年猪很少表现出症状或死于所述疾病，但仔猪在感染时会急性发病，死亡通常在24-48小时内发生，通常没有具体的临床体征(t.c.jones and r.d.hunt,veterinary pathology，第5版，lea&febiger(1983))。
5.prv是一种疱疹病毒。prv基因组的特征在于两个独特的区域(ul和us)，其中us区域的两侧是内部和末端重复序列(分别是irs和trs)。整个prv基因组的序列和基因排列是已知的，并且已经建立了由实验数据很好支持的可能的转录本组织图谱。反向重复序列之间的重组可以产生两种可能的基因组的异构体，其中us区域的取向相反。已鉴定了70种不同基因的功能。关于prv的一般生物学及其作用机制，参见pomeranz等人，microbiol.andmol.biol.reviews 205,sept.,462-500.
6.已经通过各种技术生产了prv疫苗，在欧洲流行地区实施疫苗接种已超过15年。疫苗接种减少了损失，但疫苗接种使该病毒留在了环境中。接触强毒病毒的接种动物可能会在感染后存活下来，然后释放出更多的强毒病毒。因此，接种疫苗的动物可能会具有潜伏感染，所述感染可能会再次爆发。(参见d.p.gustafson，同上)。
7.prv的减毒活疫苗和灭活疫苗在美国可商购获得，并且已经得到usda的批准(参见，c.e.aronson，编辑，veterinary pharmaceuticals&biologicals,(1983))。
8.prv的减毒活疫苗和灭活疫苗在美国可商购获得，并且已经得到usda的批准(参见，c.e.aronson，编辑，veterinary pharmaceuticals&biologicals,(1983))。然而，仍然需要新型prv疫苗，特别是既安全又有效的减毒活疫苗。
技术实现要素：
9.一方面，本发明提供了减毒的猪疱疹病毒1型(伪狂犬病病毒)，其中其tk、gi和ge基因相对于亲本野毒株获得了修饰，使得所得病毒安全有效地用作保护猪动物免受强毒伪狂犬病病毒攻击的活疫苗，并且其中所述亲本毒株选自：毒株fs18(seq id no:1)；毒株js2012(seq id no:2)；毒株tj(genbank登录号kj789182)；毒株hen1(genbank登录号kp098534)；毒株hlj8(genbank登录号kt824771)；毒株hn1201(genbank登录号kp722022)，以及由与seq id：no:1或seq id no:2具有至少85％同一性的核苷酸序列编码的任何毒株。在某些实施方案中，所述病毒还包括us1、us2和us9基因中一个或多个基因的减毒修饰，条件是us2和us9基因中的至少一个未被修饰。
10.在某些实施方案中，所述病毒由seq id no:3或与其具有至少85％同一性的序列编码，并且所述序列包含：a)ul23基因核苷酸480-846的缺失(分离株m1707)；或b)ul23基因核苷酸526-607的缺失(分离株m1705)；或c)ul23基因核苷酸280-723的缺失(分离株m1708)；或d)ul23基因核苷酸364-615的缺失(分离株m1710)；或e)ul23基因的缺失，其包括
‘
a’、
‘
b’、
‘
c’或
‘
d’中的任何缺失。
11.另一方面，本发明提供了减毒的猪疱疹病毒i型(伪狂犬病病毒)，其源自毒株fs18(seq id no:1)；菌株js2012(sseq id no:2)、毒株tj(genbank登录号kj789182)、毒株hen1(genbank登录号kp098534)、毒株hlj8(genbank登录号kt824771)或毒株hn1201(genbank登录号kp722022)，或由与seq id no:1或seq id no:2具有至少85％同一性的核苷酸序列编码的任何毒株，其中所述减毒株由包含以下缺失的dna序列编码：对于ge基因，orf的所有核苷酸都被缺失；对于gi基因，1101个核苷酸的orf的至少核苷酸269-1101被缺失；以及对于tk基因，在963个核苷酸的orf中，缺失选自由位置526-607、480-846、280-723和364-615组成的核苷酸序列。
12.在某些实施方案中，所述病毒还包含us2基因的完全缺失、us9基因的完全缺失以及us1基因的1260个核苷酸orf的至少核苷酸909-1034和/或至少核苷酸301-315的缺失。在其它实施方案中，us1、us2和us9基因未被修饰。在某些优选实施方案中，所述病毒由seq id no:3(m1707)或与其具有至少85％同一性的序列编码。
13.在第三方面，本发明提供了根据本发明第一和/或第二方面的任何实施方案的编码所述病毒的分离的dna多核苷酸分子。
14.在第四方面，本发明提供了能够直接转染宿主细胞的质粒，所述质粒包含根据本发明第三方面的dna多核苷酸分子和能够允许所述编码序列转录的启动子。
15.在本发明的第五方面，提供了包含根据本发明的第一或第二方面的任何实施方案的病毒的疫苗。
16.在第六方面，本发明提供了保护猪动物免受伪狂犬病感染的方法，其中所述方法包括向所述猪动物施用根据本发明第五方面的任何实施方案的疫苗。在某些实施方案中，每剂疫苗包含10
4.5
至109tcid
50
，优选约107tcid
50
的病毒。优选地，所述病毒是由seq id no:3编码的分离株m1707。在不同的实施方案中，所述猪动物是公猪、母猪、小母猪或仔猪。
具体实施方式
17.以下定义和介绍性事项适用于本说明书。
18.除非上下文另有明确指示，否则单数术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物。类似地，除非上下文清楚地另有指示，否则词语“或”旨在包括“和”。词语“或”表示特定列表的任一个成员，也包括该列表的成员的任意组合。
19.术语“佐剂”是指增强疫苗效力，并且可被添加到包含免疫剂的制剂中的化合物。即使在只注射一剂疫苗后，佐剂也能提供增强的免疫反应。佐剂可包括例如胞壁酰二肽、吡啶、氢氧化铝、二甲基二十八烷基溴化铵(dda)、油、水包油乳液、皂苷、细胞因子和本领域已知的其它物质。美国专利申请公开号us2004/0213817a1描述了合适的佐剂的实例。“佐剂化的(adjuvanted)”是指掺入佐剂或与佐剂组合的组合物。
[0020]“抗体”是指多克隆抗体和单克隆抗体、嵌合抗体和单链抗体以及fab片段，包括fab或其它免疫球蛋白表达文库的产物。就抗体而言，术语“免疫特异性的”是与目标蛋白质的一个或多个表位结合，但基本上不识别和结合包含抗原性生物分子的混合群体的样品中的其它分子的抗体。
[0021]
如本文中所用，“减毒”prv是指能够在易感宿主中感染并且/或者复制，但对易感宿主无致病性或致病性较低的prv。例如，与相关的野外分离毒株相比，减毒病毒可能不引起可观察/可检测的临床表现，或只引起较少的临床表现，或较不严重的临床表现，或表现出病毒复制效率和/或传染性的降低。prv感染的临床表现包括但不限于：仔猪和成熟猪的咳嗽、打喷嚏、发热、便秘、抑郁、癫痫发作、共济失调、转圈以及唾液分泌过多。
[0022]“表位”是在一旦向宿主施用，其就能够引起体液(b细胞)和/或细胞类型(t细胞)的免疫反应的意义上具有免疫活性的抗原决定簇。它们是分子上具有抗原性的特殊化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽上的特定抗原表位。在动物中，大多数抗原会同时出现几个或甚至许多抗原决定簇。这种多肽也可能适合作为免疫原性多肽，并且表位可以如进一步描述的那样被鉴定。
[0023]
出于本发明的目的，在第二多核苷酸分子的核苷酸序列基于遗传密码的简并性与第一多核苷酸分子的核苷酸序列编码相同的聚氨基酸的情况下，或者当其编码与第一多核苷酸分子的核苷酸序列编码的聚氨基酸足够相似的聚氨基酸时，第二多核苷酸分子(rna或dna)的核苷酸序列与第一多核苷酸分子的核苷酸序列“同一”。通常，如果基于blastn算法(美国国立卫生研究院的美国国家生物技术信息中心，另称为ncbi,(bethesda,md.,usa))，第二多核苷酸分子与第一多核苷酸分子的核苷酸序列具有至少约85％的核苷酸序列同一性，则所述第二多核苷酸分子的核苷酸序列与第一多核苷酸分子的核苷酸序列同一。在根据本发明的实践进行计算的具体实例中，可参考blastp 2.2.6[tatusova ta和tl madden，"blast 2sequences
‑‑
a new tool for comparing protein and nucleotide sequences.”(1999)fems microbiol lett.174:247-250.]。简言之，使用为10的缺口开放罚分、为0.1的缺口延伸罚分以及henikoff和henikoff的“blosum62”评分矩阵(proc)对两个氨基酸序列进行比对以优化比对分数(proc.nat.acad.sci.usa 325 89:10915-10919.1992)。然后，如下计算同一性百分比：相同匹配的总数x 100/除以较长序列的长度+引入较长序列中以对齐两个序列的缺口数。
[0024]
术语“分离的”用于表示细胞、肽或核酸从其天然环境中分离出来。分离的肽和核酸可以是基本上纯的，即基本上不含它们在自然界中可能与之结合的其它物质。
[0025]
短语“缺乏功能性蛋白质”是指与非修饰基因编码的蛋白质相比，修饰基因编码的
蛋白质的量和/或活性降低了至少95％。在某些方面，由修饰基因编码的蛋白质的量和/或活性降低了至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％，或至少99.5％，或至少99.9％。在某些方面，由修饰基因编码的蛋白质的量和/或活性被完全消除。
[0026]“药学上可接受的载体”意指疫苗生产和施用领域中使用的任何常规药学上可接受的载体、媒介物或赋形剂。药学上可接受的载体通常是无毒的、惰性的固体或液体载体。
[0027]
术语“猪(porcine)”和“猪(swine)”在本文中可互换使用，指的是属于猪科的任何动物，诸如猪(pig)。
[0028]
如本文中所用，“易感”宿主是指可被pedv病毒感染的细胞或动物。当被引入易感动物时，减毒pedv病毒也可诱导针对pedv病毒或其抗原的免疫反应，从而使动物对pedv病毒感染产生免疫。
[0029]
术语“疫苗”是指用于对疾病产生免疫以预防或改善感染的影响的抗原制剂。疫苗通常使用免疫有效量的免疫原和佐剂的组合来制备，所述佐剂能有效增强接种的受试者对免疫原的免疫反应。
[0030]
疫苗制剂将包含“治疗有效量”的活性成分，即能够在施用了该组合物的受试者中诱导免疫保护反应的量。例如，在pedv病的治疗和预防中，“治疗有效量”优选为增强接种的受试者对新感染的抗性并且/或者降低疾病的临床严重性的量。这种保护将通过感染了prv病毒的受试者通常表现出的症状的减轻或缺乏、更快的恢复时间和/或更低的病毒颗粒计数来证明。疫苗可以在感染前接种，作为预防prv的措施。或者，可以在受试者已经感染疾病后接种疫苗。接触prv病毒后提供的疫苗可能能够减弱疾病，引发比天然感染本身更强的免疫反应。
[0031]
本公开提供了一种prv减毒株，如果用于疫苗中，所述减毒株是安全有效的，并且保护猪免受prv毒性株的攻击。在某些方面，prv的减毒株相对于亲本野外株在胸苷激酶(tk)、糖蛋白i(gi)和糖蛋白e(ge)基因中包含修饰。
[0032]
合适的亲本株包括但不限于fs18(seq id no:1)；毒株js2012(seq id no:2)；毒株tj(genbank登录号kj789182)；毒株hen1(genbank登录号kp098534)；毒株hlj8(genbank登录号kt824771)；毒株hn1201(genbank登录号kp722022)。其它合适的毒株是由如下核苷酸序列编码的毒株，所述核苷酸序列与全长seq idno:1或seq id no:2具有至少85％同一性(即，至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.2％、至少99.4％同一性、至少99.6％同一性、至少99.8％同一性、至少99.9％同一性)。
[0033]
在某些方面，亲本毒株与seq id no:1或2具有至少85％同一性，如先前段落中所引述的，并且至少一半(例如，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％)的不同碱基导致编码相似氨基酸的密码子，即保守氨基酸取代。此类特定的保守氨基酸取代通常被认为不会使整个蛋白质功能失活：诸如关于带正电荷的氨基酸(反之亦然)，赖氨酸、精氨酸和组氨酸；关于带负电荷的氨基酸(反之亦然)，天冬氨酸和谷氨酸；以及关于某些电中性氨基酸的组(以及在所有情况下，也反之亦然)，(1)丙氨酸和丝氨酸，(2)天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸，(3)半胱氨酸和丝氨酸，(4)甘氨酸和脯氨酸，(5)异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，(6)甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(7)苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和酪氨酸，
(8)丝氨酸和苏氨酸，(9)色氨酸和酪氨酸，(10)以及例如酪氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。氨基酸可根据物理性质以及对二级和三级蛋白质结构的贡献来分类。因此，保守取代在本领域中被认为是用一个氨基酸取代另一个具有相似性质的氨基酸，示例性保守取代可见于1997年3月13日公布的wo 97/09433中的第10页(1996年9月6日提交的pct/gb96/02197)。或者，保守氨基酸可如lehninger,(biochemistry，第2版；worth publishers,inc.ny:ny(1975)，第71-77页)所述进行分组。蛋白质序列可使用vector nti advance 11.5和clustal 2.1多序列比对进行比对。如本文中所用，特定氨基酸或核苷酸序列的引述对于核酸序列而言应包括所有沉默突变，对于氨基酸序列而言应包括任何和所有保守修饰的变体。
[0034]
伪狂犬病病毒的gi、ge和tk蛋白的序列和功能是已知的。胸苷激酶由ul23基因编码，参与核苷酸合成。糖蛋白i和e分别是由us7和us8基因编码的病毒体蛋白。pomeranz等人公开了gi和ge彼此复合。出于本公开的目的，基因ul23、us7和us8可分别被称为“tk基因”、“gi基因”和“ge基因”。
[0035]
在某些实施方案中，prv的减毒株还在us1、us2和us9基因中的一种或多种(即，一种、两种或全部三种)中包含修饰。这些基因分别编码rsp40/icp22、11k和28k蛋白。在某些实施方案中，us2和us9基因中的至少一种未被修饰。因此，例如，所述病毒可以包含未修饰的us2、经修饰的us9和经修饰的或未修饰的us1。或者，所述病毒可以包含未修饰的us9、经修饰的us2和经修饰的或未修饰的us1。
[0036]
在某些其它实施方案中，在本发明的prv减毒株中，us1、us2和us9基因未被修饰。
[0037]
pomeranz等人公开了us1编码rsp40/icp22蛋白。这种蛋白质在prv中的功能目前尚不清楚，但pomeranz公开了其hsv-1同源物作为基因表达的调节剂发挥作用。us2编码存在于病毒被膜中的蛋白质。us9编码包膜蛋白，其参与轴突中的蛋白质分选，并作为ii型尾锚定的膜蛋白发挥作用。
[0038]
编码tk、gi、ge蛋白的基因中的修饰以及us1、us2和us9基因的任选的修饰导致病毒缺乏由这些基因表达的功能蛋白。
[0039]
例如，在某些方面，缺乏功能性ge蛋白的本发明病毒可以通过多种方式制备。例如，可在编码ge蛋白的orf的近端部分引入终止密码子。在不同的实施方案中，可在n末端10个或更少的氨基酸(例如9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个氮末端氨基酸)之后引入终止密码子。在其它实施方案中，可改变转录起始位点使得转录不开始。在其它实施方案中，缺失编码ge蛋白的orf中的所有核苷酸。
[0040]
本发明的病毒也可以缺乏功能性gi蛋白。在某些实施方案中，从编码gi蛋白的1101个核苷酸的orf中缺失至少核苷酸269-1101。在某些实施方案中，缺失始于核苷酸269的上游，例如始于核苷酸250、200、150、100、50，或者甚至更上游。在某些实施方案中，缺失所有1101个核苷酸。在某些实施方案中，在269位或其上游引入终止密码子，而不引入移码突变。
[0041]
本发明的病毒还具有编码tk蛋白的经修饰的us23基因。ul23基因具有963个核苷酸长的orf。在某些方面，该963个核苷酸长的orf缺少至少一个(或至少两个，或至少三个，或全部四个)选自该963个核苷酸长的orf的核苷酸526-607、480-846、280-723和364-615定义的序列中的子序列。当然，也可以存在更长的缺失，例如由位置280-846定义的包含所有四个子序列的缺失，或者由位置300-650定义的包含两个子序列的缺失，等等。或者，可以缺
失orf的所有963个核苷酸。或者，可在位置526的上游、位置364的上游、位置480的上游或位置280的上游等引入终止密码子(不引起移码)。转录起始位点的突变在某些方面也是可能的。
[0042]
对us1、us2和us9基因中任一个的任选修饰优选使所得病毒缺乏由经修饰的基因编码的蛋白质。合适的突变包括基因缺失、插入、取代等。如上所述，可以引入移码突变，从而产生与非修饰基因编码的蛋白质具有最小相似性的蛋白质。框内突变可包括在基因的近端部分(例如，在n末端20个、15个、10个、5个、3个氨基酸内)中引入终止密码子，或者突变转录起始位点，使得相应的orf不被转录。
[0043]
在某些方面，本发明的减毒病毒的基因组与seq id no:1或2具有至少85％同一性，并且具有以下修饰：
[0044]
至少90％(至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的编码gi蛋白的orf；
[0045]
至少90％(至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的编码ge蛋白的orf；
[0046]
编码tk蛋白的orf缺少至少一个(即，至少两个、至少三个或全部四个)由该963个核苷酸长的orf的位置526-607、480-846、280-723和364-615处的核苷酸定义的子序列。
[0047]
在某些其它方面，经修饰的活病毒由seq id no:3或与其至少85％同一性的序列编码，条件是编码病毒的序列包含对ul23基因(编码tk)、us7基因(编码gi)、us8基因(编码ge)的修饰。根据本发明的这个方面，一些经修饰的活病毒可包含未修饰的us1、us2和us9基因。根据本发明这一方面的一些其它经修饰的活病毒还包含对us1、us2和us9基因的任选修饰，如上所述，例如经修饰的us2、未修饰的us9和经修饰的或未修饰的us1，或经修饰的us9、未修饰的us2和经修饰的或未修饰的us1。在其它方面，所有这三个基因(us1、us2、us9)都被修饰
[0048]
以产生的病毒将缺乏由这些基因编码的功能蛋白这种方式修饰基因的方法是公知的。这些方法包括但不限于完全或部分缺失、移码突变、核苷酸取代或插入。例如，可以修饰调节所述基因的启动子，或转录起始位点。可选地(或另外地)，可在编码序列中插入导致过早终止密码子的突变。其它合适的方法在本领域普通技术人员的专业知识范围内。
[0049]
上述修饰可通过多种方法引入病毒基因组，包括但不限于靶向诱变和同源重组。
[0050]
这项技术的第一步包括构建重组dna分子，用于与prv基因组dna重组。这种重组dna分子可衍生自任何合适的质粒、粘粒或噬菌体，质粒是最优选的，并且包含含有如上定义的prv基因组部分的dna的prv dna的片段。如上定义的prv基因组部分的dna序列优选侧翼是prv核酸序列，所述序列应该具有合适的长度，例如50-3000bp，以允许与病毒prv基因组发生体内同源重组。
[0051]
以这种方式获得的重组dna分子适于将突变引入prv基因组。
[0052]
接下来，可用prv dna转染细胞，例如猪肾细胞或vero细胞，或者在如上所述的重组dna分子存在的情况下用野生型prv感染所述细胞，由此在重组dna分子中的序列与prv基因组中的相应序列之间发生重组。
[0053]
重组还可通过用含有突变序列的核酸序列共转染所述细胞来诱导，所述突变序列的两侧是无质粒序列的合适的侧翼prv序列。重组病毒子代随后在细胞培养物中产生，并且
可以例如从基因型或表型上进行选择。另一种可能性是检测突变所在的核酸序列编码的多肽的不存在。同样，可以检测由插入的异源核酸序列编码的多肽的存在。还可根据对诸如新霉素、庆大霉素或霉酚酸等化合物的抗性来阳性选择重组病毒。
[0054]
可将所选择的重组prv在细胞培养物中大规模培养，之后可以收集含有重组prv的物质或由所述prv表达的异源多肽。
[0055]
作为重组dna技术的替代或补充，可将与克隆富集和克隆选择结合的细胞培养传代用于制备本发明的病毒。例如，可选择在基因例如gi或ge之一中具有缺失的克隆，用于进一步增殖，并且已知tk天然基因缺失突变体可能是由病毒复制缺陷引起的。
[0056]
合适的细胞系包括但不限于猪睾丸细胞系st、猪肾细胞系pk-15或mrs-2、兔肾细胞系rk、非洲绿猴肾细胞系vero、猴胚胎肾上皮细胞系marc-145、牛肾细胞系mdbk、牛睾丸细胞系bt、鸡胚成纤维细胞(cef)和幼仓鼠肾细胞系bhk-21。在一个优选实施方案中，合适的细胞系是vero(atcc ccl-81)。
[0057]
向需要保护免受病毒感染的猪施用免疫有效量的本发明疫苗。用于接种猪的免疫有效量或免疫原性量可通过常规测试容易地确定或容易地滴定。有效量是获得足够的对疫苗的免疫反应以保护接触prv病毒的猪的量。优选地，猪被保护到其中病毒性疾病的一种至所有不利的生理症状或影响被显著减轻、改善或完全预防的程度。
[0058]
本发明的疫苗可以按照接受的惯例进行配制，以包括动物可接受的载体，诸如标准缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，并且也可以配制成促进持续释放。稀释剂包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗性添加剂尤其包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。其它合适的疫苗媒介物和添加剂，包括那些特别适用于配制改良活疫苗的那些媒介物和添加剂，对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的。参见例如remington's pharmaceutical science，第18版，1990,mack publishing，其通过引用并入本文。
[0059]
本发明的疫苗可以是无佐剂的。或者，本发明的疫苗还可包含一种或多种另外的免疫调节组分，诸如佐剂或细胞因子等。可用于本发明疫苗的佐剂的非限制性实例包括ribi佐剂系统(ribi inc.,hamilton,mont.)、明矾、矿物凝胶诸如氢氧化铝凝胶，水包油乳液、油包水乳液诸如弗氏完全和不完全佐剂、嵌段共聚物(cytrx,atlanta ga.)、qs-21(cambridge biotech inc.,cambridge mass.)、saf-m(chiron,emeryville calif.)、皂苷、quil a或其它皂苷级分、单磷酰基脂质a、离子多糖和avridine脂质-胺佐剂。可用于本发明疫苗的水包油乳液的非限制性实例包括改性的seam62和sem1/2制剂。改性的seam62是一种水包油乳液，其含有5％(v/v)角鲨烯(sigma)、1％(v/v)85去垢剂(ici表面活性剂)、0.7％(v/v)80去垢剂(ici表面活性剂)、2.5％(v/v)乙醇、200μg/ml quil a、100μg/ml胆固醇和0.5％(v/v)卵磷脂。改性seam 1/2是水包油乳液，其含有5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)85去垢剂、0.7％(v/v)tween 80去垢剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/ml quil a和50μg/ml胆固醇。可包含在疫苗中的其它免疫调节剂包括例如一种或多种白细胞介素、干扰素或其它已知的细胞因子。
[0060]
额外的佐剂系统允许t辅助细胞和b细胞表位的组合，产生一种或多种类型的共价t-b表位连接的结构，并且可被额外脂质化，诸如wo2006/084319、wo2004/014957和wo2004/
014956中描述的那些。
[0061]
在本发明的一个优选实施方案中，用下文所述的5％配制orfi pedv蛋白或其它pedv蛋白或其片段。
[0062]
佐剂组分
[0063]
本发明的疫苗组合物可以包含或可以不包含佐剂。特别地，基于经口感染的病毒，本发明的经修饰的活疫苗可以不含佐剂使用，采用无菌载体。可用于口服给药的佐剂包括基于ct样免疫调节剂(rmlt、ct-b，即大肠杆菌(e.coli)的重组突变热不稳定毒素、霍乱毒素-b亚单位)的佐剂；或者通过用聚合物和藻酸盐/酯包封，或者用粘膜粘合剂诸如脱乙酰壳多糖包封，或者通过脂质体。通过疫苗释放的最小保护剂量的优选佐剂化或非佐剂化疫苗剂量可以提供每剂量约10至约106log
10
tcid
50
或更多的病毒。“tcid
50”是指“组织培养物感染剂量”,定义为感染50％的给定批次的接种细胞培养物所需的病毒的该稀释度。可使用各种方法来计算tcid
50
，包括贯穿本说明书使用的斯皮尔曼-卡尔伯(spearman-karber)方法。关于斯皮尔曼-卡尔伯方法的描述，参见b.w.mahy&h.o.kangro,virology methods manual，第25-46页(1996)。如果存在的话，更常见地如果选择非口服施用，佐剂可以以乳剂的形式提供，但不应使起始滴度降低超过0.7log(降低80％)。
[0064]
在一个实例中，佐剂组分由轻质矿物油中的卵磷脂以及还有氢氧化铝组分的组合提供。关于(作为代表性卵磷脂/矿物油组分)的组成和配方的细节如下。
[0065]
优选的佐剂可以在缓冲溶液中以2ml剂量提供，所述缓冲溶液还包含约5％(v/v)(氢氧化铝凝胶)和“20％”，其最终含量约为25％(v/v)。在美国专利第5,084,269号中一般性地描述了其提供了溶解在轻质油中的脱油卵磷脂(优选大豆)，所述脱油卵磷脂然后分散到抗原的水溶液或悬浮液中，形成水包油乳液。已根据美国专利第6,814,971号(参见其第8-9栏)的方案改进了amphigen，以提供用于本发明最终佐剂化疫苗组合物中的所谓“20％amphigen”组分。因此，用0.63％磷酸盐缓冲盐水溶液以1:4稀释10％的卵磷脂和90％的载体油的储备混合物(penreco,karns city,pa.)，从而将卵磷脂和组分分别减少至2％和18％(即，其原始浓度的20％)。向组合物中加入tween 80和span 80表面活性剂，代表性的和优选的最终量为5.6％(v/v)和2.4％(v/v)其中最初在储备组分中提供，最初由缓冲盐水组分提供，因此盐水和组分的混合物导致最终所需的表面活性剂浓度。/卵磷脂和盐水溶液的混合物可使用charles ross and son,hauppauge,n.y.,usa的405型在线超薄乳化器来完成。
[0066]
疫苗组合物还包括lv(储备原料中约2％的氢氧化铝含量)，作为额外的佐剂组分(可从reheis,n.j.,usa和chemtrade logistics,usa获得)。使用0.63％的pbs进一步稀释，最终疫苗组合物每2ml剂量含有以下组成量；5％(v/v)lv；25％(v/v)“20％amphigen”，即进一步稀释4倍)；和0.01％(w/v)的硫柳汞。
[0067]
如本领域所理解的，可以改变组分的添加顺序以提供等效的最终疫苗组合物。例如，可在缓冲液中制备适当稀释的病毒。然后可以加入适量的lv(约2％的氢氧化铝含量)储备溶液，并进行掺混，以使lv在实际最终产品中达到所需的5％(v/v)浓度。一旦制备好，将这种中间储备原料与适量的“20％amphigen”储备原料(如上文中一般性描述的，并且已经含有必要量的tween 80和span 80)混合，再次获得具有25％(v/v)“20％amphigen”的最终产品。最终可以加入适量的10％的硫柳汞。
[0068]
本发明的疫苗组合物允许所有成分变化，使得与上述抗原剂量相比，抗原的总剂量可以优选变化100倍(增加或减少)，最优选变化10倍或更少(增加或减少)。类似地，表面活性剂浓度(无论是还是)可以相互独立地变化高达10倍，或者它们可以被完全删除，用适当浓度的类似物质代替，这在本领域中是众所周知的。
[0069]
最终产品中的浓度可以首先通过使用可从许多其它制造商获得的等效材料(即，brenntag；denmark)，或者通过在系列产品诸如cg、hpa或hs中使用另外的变型来改变。以lv为例，其最终有用浓度包括0％至20％，更优选2-12％，最优选4-8％。类似地，尽管的最终浓度(表示为“20％amphigen”的百分比)优选为25％，但该量可以在5％至50％，优选20％至30％，最优选约24％至26％之间变化。
[0070]
根据本发明的实践，本发明佐剂制剂中使用的油优选为矿物油。如本文中所用，术语“矿物油”是指通过蒸馏技术从矿脂中获得的液态烃的混合物。该术语与“液化石蜡”、“液体凡士林”和“白色矿物油”同义。该术语还旨在包括“轻质矿物油”，即类似地通过蒸馏矿脂获得的油，但其比重略低于白色矿物油。参见，例如，remington's pharmaceutical sciences，第18版(easton,pa.:mack publishing company,1990，在第788页和第1323页)。矿物油可以从各种商业来源，例如.t.baker(phillipsburg,pa.)、usb corporation(cleveland,ohio)获得。优选矿物油是以名称销售的轻质矿物油。
[0071]
本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物还可以以冻干制剂或水溶液的形式包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂(参见，例如remington:the science and practice of pharmacy,2005,lippincott williams)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所述剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且可以包含缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如汞((邻-羧基苯基)硫代)乙基钠盐十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，诸如edta；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(peg)、或
[0072]
本发明的疫苗可以任选地被配制用于本发明的病毒、感染性dna分子、质粒或病毒载体的持续释放。此类持续释放制剂的实例包括病毒、感染性dna分子、质粒或病毒载体与生物相容性聚合物(诸如聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、甲基纤维素、透明质酸、胶原等)的复合物的组合。可降解聚合物在药物递送媒介物中的结构、选择和使用已经在几个出版物中进行了综述，包括a.domb等人，1992,polymers for advanced technologies 3:279-292，其通过引用并入本文。在药物制剂中选择和使用聚合物的其它指导可见于本领域已知的文献，例如m.chasin和r.langer(编辑)，1990,"biodegradable polymers as drug delivery systems"，在drugs and the pharmaceutical sciences第45卷中，m.dekker,ny,所述文献也通过引用并入本文。可选地或另外地，可将所述病毒、质粒或病毒载体微囊化以改善施用和功效。微囊化抗原的方法在本领域是公知的，包括例如美国专利第3,137,631号、美国专利第3,959,457号、美国专利第4,205,060号、美国专利第4,606,940号、美国专利第4,744,933号、美国专利第5,132,117号；和国际专利公布wo 95/28227(所有所述专利通过引入并入本文)中描述的技术。
[0073]
脂质体也可用于提供病毒、质粒、病毒蛋白或病毒载体的持续释放。关于如何制备和使用脂质体制剂的细节可见于美国专利第4,016,100号、美国专利第4,452,747号、美国专利第4,921,706号、美国专利第4,927,637号、美国专利第4,944,948号、美国专利第5，008，050号和美国专利第5,009,956号等处(所有所述专利通过引用并入本文)中。
[0074]
任何上述疫苗的有效量可以通过常规方法，从低剂量的病毒、病毒蛋白质粒或病毒载体开始，然后逐渐增加剂量同时监测效果来确定。可在单次施用疫苗后或在多次施用疫苗后获得有效量。在确定每只动物的最佳剂量时，可以考虑已知因素。这些因素包括动物的种类、个头大小、年龄和一般状况，动物体内其它药物的存在等。优选在考虑其它动物研究的结果后选择实际剂量。
[0075]
一种检测是否已获得足够免疫反应的方法是确定动物接种疫苗后的血清转化和抗体滴度。接种疫苗的时间安排和加强剂的数量(如果有的话)优选由医生或兽医根据对所有相关因素的分析来决定，其中一些因素已在上面描述过。
[0076]
在本发明关于猪的疫苗接种的一个优选实例中，动物的最佳年龄目标在约1至21天之间，在断奶前，这也可能对应于其它预定的疫苗接种，诸如针对猪肺炎支原体(mycoplasma hyopneumoniae)或猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗接种。另外，用于繁殖母猪的优选疫苗接种计划将包括类似的剂量，以及每年的再接种计划。
[0077]
给药
[0078]
一个优选的临床适应症是在繁殖母猪和小母猪分娩前进行治疗、控制和预防，随后对仔猪进行疫苗接种。在一个代表性实例(适用于母猪和小母猪)中，使用单剂量疫苗，当然，如果需要，也可以设想两剂量的疫苗接种方案。
[0079]
剂量的实际体积是疫苗配制方式的函数，其中实际给药量的范围为0.05至5ml，同时还要考虑到动物的个头大小。单剂量疫苗接种也是合适的。伪狂犬病病毒在疫苗中的量为每剂10
4.5
tcid
50
至108tcid
50
，优选每剂105至107tcid
50
，或更优选每剂10
5.5
至10
6.5
tcid
50
。
[0080]
优选地，仅单次给药就足以提供保护。然而，如果需要两次剂量方案，可以在任何后续分娩前两到四周给予加强剂量。肌内接种疫苗(所有剂量)是优选的，尽管可以皮下施
用一个或多个剂量。口服施用也是优选的。接种疫苗也可能对首次接触实验的动物、以及通过计划或自然感染而实现的非首次接触实验的动物有效。
[0081]
在另一优选实例中，母猪或小母猪在分娩前5周，然后在分娩前2周进行肌内或口服接种疫苗。本发明的方案也适用于已为血清阳性的母猪和小母猪以及仔猪和公猪的治疗。也可进行加强疫苗接种，这些可通过不同的施用途径进行。尽管优选在任何后续分娩之前对怀孕母猪重新接种疫苗，但本发明的疫苗组合物仍然可以通过抗体的持续被动转移而为仔猪提供保护，即使怀疑母猪只进行了与之前的分娩相关的疫苗接种亦如此。
[0082]
应该注意的是，仔猪可能早在出生的第一天就接种疫苗。例如，可在第1天对仔猪接种疫苗，在3周龄时可以使用或不使用加强剂量，特别是在亲本母猪虽然在繁殖前接种过疫苗，但在分娩前没有接种的情况下。如果亲本母猪先前由于自然或计划感染而不是首次接触实验的，那么仔猪疫苗接种也可能是有效的。当母亲先前既没有接触过病毒，也没有在分娩前接种过疫苗时，则给仔猪接种疫苗也可能有效。
[0083]
在其它方面，可对约6日龄或更大，或约14日龄或更大，或约21日龄或更大，或约28日龄或更大，或约35日龄或更大，或约42日龄或更大的仔猪施用疫苗。
[0084]
公猪(通常用于繁殖目的)应每6个月接种一次疫苗。剂量的变化完全在本领域的实践范围内。应该注意的是，本发明的疫苗对于怀孕动物(所有三个月)和新生猪是安全的。本发明的疫苗被减毒至安全水平(即没有死亡，只有短暂的轻微临床体征或新生猪的正常体征)，即使对于最敏感的动物(仍然包括新生猪)，所述安全水平也是可以接的。当然，从保护猪群免受prv流行病和持续低水平prv发生的角度来看，持续的母猪接种计划是非常重要的。应当理解，用prv mlv免疫的母猪或小母猪将被动地将免疫力(包括prv特异性iga)转移给仔猪，这将保护仔猪免于prv相关疾病和死亡。另外，一般来说，用prv mlv免疫的猪的数量和/或持续时间会减少，或者被保护免于将prv病毒从其粪便中排出，此外，用prv mlv免疫的猪将被保护免于prv的临床体征，包括但不限于prv的死亡率、生殖、神经和呼吸表现，此外，prv mlv将有助于停止或控制pedv的传播周期。
[0085]
还应该注意的是，用本发明的疫苗接种的动物对于人食用也是立即安全的，没有任何显著的屠宰滞留(slaughter withhold)，诸如21天或更少。
[0086]
当治疗性提供时，在检测到实际感染体征时，以有效量提供疫苗。如果组合物的施用能够被接受者耐受，则认为其为“药理学上可接受的”。如果施用的量具有生理学意义，则这种组合物被认为以“治疗或预防有效量”施用。
[0087]
可使用本文所述的药物组合物，通过实现预期目的的任何方式来施用本发明的至少一种疫苗组合物或免疫原性组合物。例如，这种组合物的施用途径可以是通过肠胃外、口服、经口鼻、鼻内、气管内、局部、皮下、肌内、经皮、皮内、腹膜内、眼内和静脉内途径。在本发明的一个实施方案中，通过肌内施用组合物。肠胃外施用可通过推注或在一段时间内逐渐灌注的方式进行。可使用任何合适的装置(包括注射器、滴管、无针注射装置、贴片等)来施用组合物。被选择使用的途径和装置将取决于佐剂、抗原和受试者的组成，这些是技术人员熟知的。口服或者可选地皮下施用是优选的。口服施用可以是直接施用，通过水，或通过饲料(固体或液体饲料)施用。当以液体形式提供时，疫苗可被冻干并重构，或者以糊剂提供，用于直接添加到饲料中(混合在敷料中或涂覆在敷料表面)，或者以其它方式添加到水或液体饲料中。
[0088]
诊断试剂盒
[0089]
本发明还提供了诊断试剂盒。所述试剂盒对于区分自然感染prv病毒野外株的猪动物与接种了本文所述的任何prv疫苗的猪动物可以是有价值的。所述试剂盒也是有价值的，因为可以在出现临床症状之前检测出可能感染prv病毒野外毒株的动物，并将其从畜群中移除，或者与未接种或接种疫苗的动物隔离。
[0090]
所述试剂盒包括用于分析猪动物的样品中针对指定的prv病毒的特定组分的抗体的存在的试剂。本发明的诊断试剂盒可包括来自本发明的变体prv株的一种或多种肽作为组分，所述肽存在于野外株中但不存在于目标疫苗中，反之亦然，并且通过广泛的氨基酸测序可以选择此类合适的肽结构域。这些肽可用于本领域已知的任何免疫测定系统，包括但不限于：放射免疫测定、酶联免疫吸附测定、“夹心”测定、沉淀素反应、凝胶扩散免疫扩散测定、凝集测定、荧光免疫测定、蛋白a免疫测定和免疫电泳测定，仅举几例。美国专利第4,629,783号和其中引用的专利也描述了合适的测定。
[0091]
例如，试剂盒可以包含免疫原性肽，其存在于未修饰的tk、ge和/或gi蛋白以及任选经修饰的us1、us2和/或us9基因的产物中，并且不存在于经修饰的基因的表达产物中。如果在与怀疑感染了prv病毒的动物的样品接触时，该肽与针对这些蛋白质之一的抗体结合，这表明该动物已被感染。缺乏结合表明该动物未被感染，但可能已用本发明的疫苗接种过。
[0092]
所述试剂盒还可包含在prv的减毒株和野生型株中均存在的肽。此类肽的合适的非限制性实例包括由ul53、ul49.5、ul27、ul34基因编码的包膜蛋白。如果在与怀疑感染prv病毒的动物的样品接触时，该肽与针对这些蛋白质之一的抗体结合，则表明该动物已被感染或已接种了疫苗。缺乏结合表明该动物既未被感染也未接种疫苗。
[0093]
以下实施例旨在说明上述发明，并且不应被解释为缩小其范围。本领域技术人员将容易认识到，这些实施例暗示了本发明可以实施的许多其它方式。应当理解，在本发明的范围内，可以进行许多变化和修改。
[0094]
实施例1
[0095]
prv抗原和抗体均为阴性的仔猪被分成几组，每组7只仔猪。向仔猪提供商业饮食和自由饮水。
[0096]
将株m1707(包含seq id no:3，并且其中编码tk的ul23基因的核苷酸480-846被缺失)与mem、明胶、nz胺、谷氨酰胺、蔗糖、葡聚糖40、乳糖、山梨醇和青霉素-链霉素一起配制。
[0097]
第二组猪接种bartha k61株。第三组猪接种dmem。接种方法是颈部肌内注射。处理组的接种体积均为每只仔猪1ml。接种后，每天进行临床观察，包括测量猪的直肠温度。
[0098]
数据显示，采用》10
6.5
tcid
50
/猪的处理，用3种不同批次的实验室产品，f35实验室产品水平的株m1707在3～4周龄的仔猪(7头猪被处理)以及7周龄的目标年龄仔猪(14头猪被处理)中是安全的。包括对照猪在内的所有猪的体温都是正常的，在14天的观察期内没有出现临床症状。
[0099]
实施例2
[0100]
prv抗原和抗体均为阴性的仔猪被分成几组，每组7只仔猪。向仔猪提供商业饮食和自由饮水。
[0101]
制备了三个批次(批次a、批次b和批次c)的prv株m1707。将所述病毒与mem、明胶、nz胺、谷氨酰胺、蔗糖、葡聚糖40、乳糖、山梨醇和青霉素-链霉素一起配制。
[0102]
在第0天，以每剂量10
5.0
tcid
50
的量通过肌内注射用其中一个批次的制剂处理猪。对照组仅用dmem处理。接种后，每天测量猪的直肠温度。临床症状观察发现，在21天的观察期内，所有猪的体温正常，食欲良好，精神状态正常，无呼吸道和胃肠道症状，无神经学症状。在第21天，用2ml(10
5.0
tcid
50
)的株fs21pf1115鼻内攻击三个接种组和对照组。
[0103]
保护由症状的严重性(或无症状)确定。在三个接种组中，20头猪中有19头受到保护(批次a和批次b各7头中有7头，批次c中7头中有6头)。在对照组中，7头猪中有0头受到保护。
[0104]
实施例3
[0105]
prv抗原和抗体均为阴性的仔猪被分成几组，每组5只仔猪。向仔猪提供商业饮食和自由饮水。
[0106]
用mem、明胶、nz胺、谷氨酰胺、蔗糖、葡聚糖40、乳糖、山梨醇和青霉素-链霉素配制prv株1707。每只接种过的猪接受10
5.0
tcid
50
的抗原/剂量。对照组用dmem处理。通过肌肉注射施用所述制剂。接种疫苗后6个月，用fs21pf1115以2ml(10
6.0
tcid
50
)鼻内攻击接种疫苗组和对照组。
[0107]
免疫力持续时间由症状的严重性(或无症状)决定。接种组中的5头猪中有5头表现出保护性滴度，而对照组中的猪都未表现出保护性滴度。