夜来香花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种夜来香花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

背景技术：

西番莲(passifloracaeruleal.)又名百香果，是西番莲科(passifloraceae)西番莲属(passifloral.)的多年生常绿藤本植物，其果实营养价值高，甜度高、酸度低，具有“饮料之王”的美誉，在饮料市场占有重要地位。近年来，随着国内消费者对西番莲需求的不断增长，我国台湾、广东、福建、广西、浙江、四川等地区大规模种植西番莲。然而，西番莲病毒病病害的发生，导致西番莲种质退化，产量和品质下降，严重阻碍了我国西番莲产业的发展。随着我国的西番莲种植面积增大，病毒病传播和扩散的风险也越来越高。加强病毒的早期检测，明确病毒发生的种类，对及时预防与控制西番莲病毒病具有重要意义。

目前在西番莲植株上发现的病毒主要有黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus，cmv)、东亚西番莲病毒(eastasianpassifloravirus，eapv)、西番莲斑驳病毒(passionfruitmottlevirus，pamv)、广东番木瓜曲叶病毒(papayaleafcurlguangdongvirus，palcugdv)、大戟曲叶病毒(euphorbialeafcurlvirus，elcv)和夜来香花叶病毒(telosmamosaicvirus，temv)。其中，temv是马铃薯y病毒科(potyviridae)马铃薯y病毒属成员，基因组为正义单链rna，全长9689nts，病毒粒体呈线状，长约750nm，宽约12nm。temv在西番莲上可导致叶片呈花叶状，严重影响植株正常生长。

目前用于病毒检测的方法主要有鉴别寄主法、电子显微镜观察法、rt-pcr法、试纸条检测等方法。鉴别寄主法需要隔离种植的指示植物，鉴定周期长，且及易受环境条件的影响。电镜观察和rt-pcr检测需要昂贵的仪器，并对操作的专业技术人员有较高的要求，其应用局限于实验室。试纸条检测方法具有样品处理简单、可大批量操作和无需特殊设备的特点，被广泛应用于病毒病的检测。针对temv的试纸条检测，并没有相关方法的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种夜来香花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

本发明首先保护一种多肽(夜来香花叶病毒的cp多肽，简称cp多肽)，如序列表的序列1所示。

本发明还保护序列表的序列2所示的多肽。

本发明还保护与cp多肽或序列表的序列2所示的多肽特异结合的抗体(命名为cp抗体)。

所述cp抗体可为以cp多肽为免疫原得到的抗体。

所述cp抗体也可为以cp多肽与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的抗体。

所述cp抗体可为以序列表的序列2所示的多肽为免疫原得到的抗体。

所述cp抗体也可为以序列表的序列2所示的多肽与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的抗体。

所述抗体具体可为多克隆抗体。

所述cp抗体具体可为以cp多肽为免疫原免疫动物得到的多克隆抗体。

所述cp抗体具体可为以cp多肽与载体蛋白的偶联物为免疫原免疫动物得到的多克隆抗体。

所述cp抗体可为以序列表的序列2所示的多肽为免疫原免疫动物得到的多克隆抗体。

所述cp抗体也可为以序列表的序列2所示的多肽与载体蛋白的偶联物为免疫原免疫动物得到的多克隆抗体。

cp多肽与载体蛋白的偶联物具体可为cp多肽与血蓝蛋白的偶联物(命名为cp-klh偶联物)。

序列表的序列2所示的多肽与载体蛋白的偶联物具体可为序列表的序列2所示的多肽与血蓝蛋白的偶联物(命名为cp-klh偶联物)。

具体的，cp多肽位于c端，血蓝蛋白位于n端。

所述动物可为哺乳动物。

所述动物具体可为兔子。

所述动物具体可为新西兰大白兔。

所述抗体的制备方法具体包括如下步骤：取新西兰大白兔，第1天进行初次免疫，第21天进行第1次加强免疫，第28天进行第2次加强免疫，第35天进行第3次加强免疫，第42天采血，收集血清，即为抗体。

所述免疫的方式均为背部皮下多点注射。

初次免疫采用的免疫物由cp多肽溶液和弗氏不完全佐剂等体积混合得到，cp多肽溶液是将cp多肽用ph7.2的pbs缓冲液稀释得到的；初次免疫中，每只动物免疫2ml免疫物，相应的cp多肽的剂量为80μg/只动物。

加强免疫采用的免疫物由cp多肽溶液和弗氏不完全佐剂等体积混合得到，cp多肽溶液是将cp多肽用ph7.2的pbs缓冲液稀释得到的；加强免疫中，每只动物免疫2ml免疫物，相应的cp多肽的剂量为40μg/只动物。

初次免疫采用的免疫物由多肽溶液和弗氏不完全佐剂等体积混合得到，多肽溶液是将序列表的序列2所示的多肽用ph7.2的pbs缓冲液稀释得到的；初次免疫中，每只动物免疫2ml免疫物，相应的序列表的序列2所示的多肽的剂量为80μg/只动物。

加强免疫采用的免疫物由多肽溶液和弗氏不完全佐剂等体积混合得到，多肽溶液是将序列表的序列2所示的多肽用ph7.2的pbs缓冲液稀释得到的；加强免疫中，每只动物免疫2ml免疫物，相应的序列表的序列2所示的多肽的剂量为40μg/只动物。

初次免疫采用的免疫物由cp-klh溶液和弗氏不完全佐剂等体积混合得到，cp-klh溶液是将cp-klh偶联物用ph7.2的pbs缓冲液稀释得到的；初次免疫中，每只动物免疫2ml免疫物，相应的cp-klh偶联物的剂量为80μg/只动物。

加强免疫采用的免疫物由cp-klh溶液和弗氏不完全佐剂等体积混合得到，cp-klh溶液是将cp-klh偶联物用ph7.2的pbs缓冲液稀释得到的；加强免疫中，每只动物免疫2ml免疫物，相应的cp-klh偶联物的剂量为40μg/只动物。

本发明还保护cp抗体与纳米酶的偶联复合物。

本发明还保护一种制备cp抗体与纳米酶的偶联复合物的方法，包括如下步骤：将活化后的纳米酶与cp抗体共孵育。

活化后的纳米酶是将纳米酶进行活化得到的。

将纳米酶进行活化借助edc和nhs。

将纳米酶进行活化的方法包括如下步骤：取1ml活化剂，加入浓度为1mg/ml的纳米酶溶液500μl，涡旋振荡，然后置于静音混合器中反应30min，得到活化后纳米酶溶液。

将5mgedc和5mgnhs溶于1ml水中，得到活化剂。

纳米酶溶液的制备方法包括如下步骤：将水溶性镧盐、铁盐和镍盐溶于水中得到混合物a；将2-二乙氨基乙醇溶于乙醇中得到混合物b；将聚乙烯亚胺溶于乙醇中得到混合物c；然后同时将混合物b和混合物c滴加到混合物a中，搅拌后得到混合物d；用氨水调节混合物d的ph为9-10，然后至于密闭反应釜内，以5-10℃/min的升温速度升温至200℃，反应12-24小时后降温至25℃，然后离心收集沉淀，500℃焙烧1-5小时，然后超声分散于水中，即得纳米酶溶液。

混合物a中，镧离子的浓度为0.01-0.1mol/l、铁离子的浓度为0.05-0.15mol/l、镍离子的浓度为0.01-0.05mol/l。混合物b中，2-二乙氨基乙醇的浓度为0.1-0.3mol/l。混合物c中，聚乙烯亚胺的浓度为3-15g/l。

具体的，聚乙烯亚胺的重均分子量为600。

混合物a、混合物b和混合物c三者的体积配比依次为：1：(2-3)：(2-3)。

具体的，水溶性镧盐为醋酸镧。

具体的，水溶性铁盐为醋酸亚铁。

具体的，水溶性镍盐为醋酸镍。

纳米酶溶液的制备方法包括如下步骤：将0.003mol醋酸镧、0.006mol醋酸亚铁和0.002mol醋酸镍溶于100ml水中，得到混合物a；将0.04mol的2-二乙氨基乙醇溶于200ml乙醇中，得到混合物b；将1g重均分子量为600的聚乙烯亚胺溶于200ml乙醇中，得到混合物c；同时将全部混合物b和全部混合物c滴加到混合物a中，搅拌后得到混合物d；取混合物d，先用25％氨水调ph至10，然后转移至密闭反应釜中，以6℃/min的速度升温至200℃，然后200℃反应15h，然后自然降温至25℃，然后5000rpm离心10min并收集沉淀，将沉淀500℃焙烧3h，每100mg焙烧产物超声(53khz，10min)分散于100ml水中，即得浓度为1mg/ml的纳米酶溶液。

将活化后的纳米酶与cp抗体共孵育的方法包括如下步骤：将1ml抗体浓度为100μg/ml的cp抗体溶液与450μl醋酸钠溶液混合，然后加入至活化后纳米酶溶液中，振荡混匀，然后置于4℃旋转混匀仪孵育12h。

用ph7.2的pbs缓冲液稀释cp抗体，得到抗体浓度为100μg/ml的cp抗体溶液。

醋酸钠溶液：ph6.0、50mmol/l。

所述制备cp抗体与纳米酶的偶联复合物的方法还包括纯化步骤。

所述纯化的方法包括如下步骤：完成共孵育后，将液相体系转移至磁力架上，待溶液透明后弃上清，加入1ml终止液，然后置于4℃的旋转混匀仪中3h；然后将液相体系转移至磁力架上，待溶液透明后弃上清；然后加入1ml含5g/100mlbsa的pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)，超声(53khz，1min)混匀，然后置于4℃旋转混匀仪孵育3h；然后将液相体系转移至磁力架上，待溶液透明后弃上清，加入500μl含1g/100mlbsa的pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)，得到抗体与纳米酶的偶联复合物。

终止液为tris-hcl缓冲液(ph7.2、0.05mol/l)。

所述方法制备得到的cp抗体与纳米酶的偶联复合物也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种检测夜来香花叶病毒的试纸条，其检测垫上具有t线和c线，t线上包被cp抗体。

t线为检测线。

c线为质控线，包被有用于质控的抗体。

c线上具体包被羊抗兔igg抗体。

试纸条本体包括pvc底板、样品垫、检测垫和吸水垫。沿样品流动方向，样品垫、检测垫和吸水垫依次固定于pvc底板上。

沿样品流动方向作为试纸条的长度方向，与长度方向垂直的方向作为试纸条的宽度方向。试纸条的宽度为4mm。试纸条的总长度为6cm，其中样品垫的长度为1.7cm，检测垫的长度为2.5cm，吸水垫的长度为2.2cm。c线靠近吸水垫。t线靠近样品垫。

将卡壳套设于试纸条本体外，得到试纸条。卡壳上具有检测孔和加样孔。加样孔位于样品垫上方。检测孔用于加入显色液并观察t线和c线的显色情况。

检测垫的制备方法具体包括如下步骤：利用xyz三维划膜喷金仪在硝酸纤维素膜上表面进行喷涂，用t溶液喷一条t线(t线线宽为1mm；t线线长方向，每厘米t线喷1μlt溶液)，用c溶液喷一条c线(c线线宽为1mm；c线线长方向，每厘米c线喷1μlc溶液)，在37℃烘箱中烘干。t线和c线相互平行。t线和c线的垂直距离为0.7cm。

cp抗体用pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)稀释至2mg/ml，得到t溶液。

羊抗兔igg抗体用pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)稀释至2mg/ml，得到c溶液。

吸水垫的材质为吸水纸。

样品垫的材质为玻璃纤维膜。

本发明还保护一种用于检测夜来香花叶病毒的试剂盒，包括所述试纸条和以上任一所述偶联复合物。

本发明还保护cp多肽或序列表的序列2所示的多肽或cp抗体或以上任一所述偶联复合物或以上任一所述试纸条或所述试剂盒在检测夜来香花叶病毒中的应用。

本发明还保护cp多肽或序列表的序列2所示的多肽或cp抗体或以上任一所述偶联复合物或以上任一所述试纸条或所述试剂盒在制备用于检测夜来香花叶病毒的产品中的应用。

本发明以夜来香花叶病毒为研究对象，开发了纳米酶免疫层析试纸条，可用于夜来香花叶病毒的检测，具有以下优点：(1)检测夜来香花叶病毒的灵敏度高；(2)检测夜来香花叶病毒的特异性强；(3)检测时间短，检测速度快。本发明可适用于夜来香花叶病毒批量检测，对保护西番莲产业具有重要的意义和价值。

附图说明

图1为试纸条本体的结构示意图。

图2为灵敏度试验的结果。

图3为特异性试验的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。聚氯乙烯板(pvc底板)、硝酸纤维素膜(nmilliporehi-flow135)、吸水垫为北京宏捷科技有限公司产品。羊抗兔igg抗体：北京中杉金桥生物有限公司，货号为zb-2301。二氨基联苯胺(diaminobenzidine,dab)显色试剂盒：北京中杉金桥生物有限公司，货号为zli-9018。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、试剂盒的制备

一、cp抗体的制备

1、cp-klh偶联物的制备

夜来香花叶病毒cp多肽如序列表的序列1所示。

cp多肽(序列1)：dykpnqtdlfntrat。

在cp多肽的n末端增加半胱氨酸残基，得到序列表的序列2所示的多肽。

人工合成序列表的序列2所示的多肽。

序列2：cdykpnqtdlfntrat。

将序列表的序列2所示的多肽与血蓝蛋白(klh蛋白)进行偶联，得到多肽与klh蛋白的偶联物(klh蛋白位于n端，cp多肽位于c端)，简称cp-klh偶联物。

2、cp抗体的制备

取新西兰大白兔，进行初次免疫(初次免疫当天作为第1天)，第21天进行第1次加强免疫，第28天进行第2次加强免疫，第35天进行第3次加强免疫，第42天采血，收集血清，即为cp抗体(多克隆抗体)。

免疫方式均为背部皮下多点注射。

初次免疫采用的免疫物由cp-klh溶液和弗氏不完全佐剂等体积混合得到，cp-klh溶液是将cp-klh偶联物用ph7.2的pbs缓冲液稀释得到的；初次免疫中，每只动物免疫2ml免疫物，相应的cp-klh偶联物的剂量为80μg/只动物。

加强免疫采用的免疫物由cp-klh溶液和弗氏不完全佐剂等体积混合得到，cp-klh溶液是将cp-klh偶联物用ph7.2的pbs缓冲液稀释得到的；加强免疫中，每只动物每次免疫2ml免疫物，相应的cp-klh偶联物的剂量为40μg/只动物。

二、抗体纳米酶偶联复合物的制备

1、纳米酶溶液的制备

将0.003mol醋酸镧、0.006mol醋酸亚铁和0.002mol醋酸镍溶于100ml水中，得到混合物a。将0.04mol的2-二乙氨基乙醇溶于200ml乙醇中，得到混合物b。将1g重均分子量为600的聚乙烯亚胺溶于200ml乙醇中，得到混合物c。同时将全部混合物b和全部混合物c滴加到混合物a中，搅拌后得到混合物d。取混合物d，先用25％氨水调ph至10，然后转移至密闭反应釜中，以6℃/min的速度升温至200℃，然后200℃反应15h，然后自然降温至25℃，然后5000rpm离心10min并收集沉淀，将沉淀500℃焙烧3h，每100mg焙烧产物超声(53khz，10min)分散于100ml水中，即得浓度为1mg/ml的纳米酶溶液。

2、抗体纳米酶偶联复合物的制备

edc：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。nhs：n-羟基琥珀酰亚胺。将5mgedc和5mgnhs溶于1ml水中，得到活化剂。醋酸钠溶液：ph6.0、50mmol/l。终止液为tris-hcl缓冲液(ph7.2、0.05mol/l)。用ph7.2的pbs缓冲液稀释cp抗体，得到抗体浓度为100μg/ml的cp抗体溶液。

取1ml活化剂，加入浓度为1mg/ml的纳米酶溶液500μl，涡旋振荡，然后置于静音混合器中反应30min，得到活化后纳米酶溶液。将1ml抗体浓度为100μg/ml的cp抗体溶液与450μl醋酸钠溶液混合，然后加入至全部活化后纳米酶溶液中，振荡混匀，然后置于4℃旋转混匀仪孵育12h。然后将液相体系转移至磁力架上，待溶液透明后弃上清，加入1ml终止液，然后置于4℃的旋转混匀仪中3h。然后将液相体系转移至磁力架上，待溶液透明后弃上清。然后加入1ml含5g/100mlbsa的pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)，超声(53khz，1min)混匀，然后置于4℃旋转混匀仪孵育3h(期间振荡3-4次)。然后将液相体系转移至磁力架上，待溶液透明后弃上清，加入500μl含1g/100mlbsa的pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)，得到抗体纳米酶偶联复合物，4℃保存。

三、试纸条的制备

1、检测垫的制备方法

cp抗体用pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)稀释至2mg/ml，得到t溶液。羊抗兔igg抗体用pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)稀释至2mg/ml，得到c溶液。

利用xyz三维划膜喷金仪在硝酸纤维素膜上表面进行喷涂，用t溶液喷一条t线(t线线宽为1mm；t线线长方向，每厘米t线喷1μlt溶液)，用c溶液喷一条c线(c线线宽为1mm；c线线长方向，每厘米c线喷1μlc溶液)，在37℃烘箱中烘干，干燥保存。t线和c线相互平行。t线和c线的垂直距离为0.7cm。

2、试纸条的制备

试纸条本体的结构示意图见图1。

试纸条本体包括pvc底板、样品垫、检测垫和吸水垫。沿样品流动方向，样品垫、检测垫和吸水垫依次固定于pvc底板上(相邻垫之间略重叠)。

沿样品流动方向作为试纸条的长度方向，与长度方向垂直的方向作为试纸条的宽度方向。试纸条的宽度为4mm。试纸条的总长度为6cm，其中样品垫的长度为1.7cm，检测垫的长度为2.5cm，吸水垫的长度为2.2cm。c线靠近吸水垫。t线靠近样品垫。

将卡壳套设于试纸条本体外，得到试纸条。卡壳上具有检测孔和加样孔。加样孔位于样品垫上方。检测孔用于加入显色液并观察t线和c线的显色情况。

吸水垫的材质为吸水纸。

样品垫的材质为玻璃纤维膜。

四、试剂盒的制备

试剂盒由步骤二制备的抗体纳米酶偶联复合物和步骤三制备的试纸条组成。

五、试剂盒的使用方法

1、取0.1g待测样品，加入5ml含1g/100mlbsa的pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)并充分研磨，然后5500r/min离心20min，取上清并5500r/min离心20min，取上清，即为供试样本液。-20℃冷冻保存。

2、抗体纳米酶偶联复合物震荡混匀5min，然后用含1g/100mlbsa的pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)稀释至5倍体积，再次震荡混匀，得到纳米酶稀释液。

3、将65μl供试样本液与5μl纳米酶稀释液混合，然后滴加至试纸条的加样孔中，水平放置15min，然后将1ml显色液滴加至显色孔中，继续放置7min，然后观察t线和c线的显色情况。如果c线显色且t线不显色，检测结果为阴性。如果c线显色且t线显色，检测结果为阳性。如果c线不显色，检测结果无效。

显色液，即二氨基联苯胺底物液(dab的中文全称为二氨基联苯胺)，为二氨基联苯胺(diaminobenzidine,dab)显色试剂盒中的组件。

实施例2、灵敏度

取0.1g夜来香花叶病毒阳性叶片(夜来香花叶病毒阳性叶片为将夜来香花叶病毒接种至西番莲植株后获得的具有相应表征的叶片)，加入5ml含1g/100mlbsa的pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)并充分研磨，然后5500r/min离心20min，取上清并5500r/min离心20min，取上清，即为原液。将原液用含1g/100mlbsa的pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)进行10倍梯度稀释，得到各个稀释液。

取未感染病毒的西番莲叶片，作为阴性叶片。取0.1g阴性叶片，加入5ml含1g/100mlbsa的pbs缓冲液(ph7.4，10mmol/l)并充分研磨，然后5500r/min离心20min，取上清并5500r/min离心20min，取上清，即为阴性对照液。

将原液以及各个稀释液以及阴性对照液分别作为供试样本液，采用实施例1的试剂盒并按试剂盒的使用方法(实施例1的步骤五的2和3)进行检测。

结果见图2。图2中，自左至右的6个试纸条，依次对应原液、原液的10倍稀释液、原液的100倍稀释液、原液的1000倍稀释液、原液的10000倍稀释液和阴性对照液。结果表明，试纸条最低可检测原液的100倍稀释液。

实施例3、特异性

待测样本分别为：夜来香花叶病毒阳性叶片、黄瓜花叶病毒阳性叶片、广东番木瓜曲叶病毒阳性叶片、莴苣花叶病毒阳性叶片、大豆花叶病毒阳性叶片、马铃薯y病毒阳性叶片、阴性对照叶片。

夜来香花叶病毒阳性叶片为将夜来香花叶病毒(temv)接种至西番莲植株后获得的具有相应表征的叶片。黄瓜花叶病毒阳性叶片为将黄瓜花叶病毒(cmv)接种至烟草植株后获得的具有相应表征的叶片。广东番木瓜曲叶病毒阳性叶片为田间采集的检测为广东番木瓜曲叶病毒(palcugdv)阳性的西番莲叶片。莴苣花叶病毒阳性叶片为将莴苣花叶病毒(lmv)接种至烟草植株后获得的具有相应表征的叶片。大豆花叶病毒阳性叶片为将大豆花叶病毒(smv)接种至大豆植株后获得的具有相应表征的叶片。马铃薯y病毒阳性叶片为马铃薯y病毒(pvy)接种至烟草植株后获得的具有相应表征的叶片。阴性对照叶片为未感染病毒的西番莲叶片。

采用实施例1的试剂盒并按试剂盒的使用方法进行检测。

结果见图3。图3中，自左至右的7个试纸条依次对应夜来香花叶病毒阳性叶片、黄瓜花叶病毒阳性叶片、广东番木瓜曲叶病毒阳性叶片、莴苣花叶病毒阳性叶片、大豆花叶病毒阳性叶片、马铃薯y病毒阳性叶片、阴性对照叶片。

只有夜来香花叶病毒阳性叶片为阳性结果，其他待测样本均为阴性结果。

结果表明，试纸条具有良好的特异性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院

<120>夜来香花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条及其制备方法和应用

<130>gncyx210820

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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