金山乳杆菌、其组合物及应用

1.本发明属于白酒酿造领域，具体地说涉及一种金山乳杆菌，以及该金山乳杆菌在白酒生产中的应用。


背景技术：

2.乳酸菌在白酒酿造过程中具有重要作用，其种类及动态变化对于白酒品质与产量具有重要影响。乳酸菌代谢产生的乳酸、乙酸等有机酸和以其为底物产生的乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯类物质可以直接影响白酒风味的形成，此外，乳酸菌还具有调节酿酒菌群结构和调控发酵过程的作用(邢敏钰,等.微生物学通报,2018,45(1):19
‑
28；sun sy,等.food microbiol,2016,55:16
‑
24；liu n,等.food res int,2020,137:109672)。有研究表明，乳杆菌属(lactobacillus)细菌是白酒酒醅发酵中后期的优势细菌，直接影响白酒产品的风味，是白酒发酵过程中的核心微生物(王鹏,等.微生物学报,2018,58(1):142
‑
153；肖辰，等.微生物学报,2019,59(1):195
‑
204)。乳酸菌和酵母菌是酒醅发酵阶段的主导微生物，它们的种类、数量及其相互作用的代谢产物将对白酒的产量和风味产生很大影响(xia x,等.j agric food chem,2018,66(25):6348
‑
6356；viesser ja,等.int j food microbiol,2020,339:109015)。
3.金山乳杆菌(lactobacillus jinshani)是由我国科研工作者最早从醋醅中分离和鉴定的一种新型乳杆菌，2019年才在国际上鉴定和命名并在网络版上公开发表为一个乳杆菌属的新种(yu y,等.antonie van leeuwenhoek,2020,113(1):43
‑
54.epub 2019aug 12)。2020年，江南大学du r等人采用荧光定量pcr方法检测并证实了金山乳杆菌(l.jinshani)和耐酸乳杆菌(lactobacillus acetotolerans)在白酒酒醅后期中占优势(du r,等.appl environ microbiol,2020,86(12):e00456
‑
20)。该菌种在白酒酒醅后期占优势，但在金山乳杆菌获得纯培养之前，该菌种属于未培养的乳杆菌。目前，人们对金山乳杆菌的生理、代谢等特征及其在白酒酿造中的功能仍然未知。
4.有机酸是白酒的重要呈味物质，有机酸在各类香型白酒中都起着举足轻重的作用。白酒中有机酸分为挥发酸和不挥发酸,其中不挥发酸有乳酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸等。白酒中的不挥发酸具有除苦减涩、斧正香气和口味、稳定香气、柔和酒体、丰富味感、提高酒体的总酸度和缓冲作用等，可丰富白酒香味和提高白酒质量(何育明，酿酒科技，2007，156(6)：56
‑
58)。酒石酸是葡萄果实和葡萄酒所特有的有机酸，是葡萄、葡萄酒酸度的主要贡献者，在一定程度上决定了葡萄果实的酿酒品质(曹慧玲，等.中国果树，2021(4)：8
‑
13)。此外，酒石酸等有机酸在食品上还具有抗氧化和防腐的功能(束文秀，等.食品科学，2019,40(2)：152
‑
158)。
5.传统固态发酵白酒酒醅的ph值一般在3.5左右，只有耐酸性好的微生物才能在该环境中具备生存和竞争优势。中国专利(申请号201910881873.0)公开了用于白酒酿造系统中一株重要功能菌株lactobacillus sp.的定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用。目前尚未有关于产酒石酸、乳酸、乙酸等有机酸能力强、耐受性好的金山乳杆菌及其在白酒中应
用的报道。
6.发明技术内容：
7.本发明的一个目的是提供一种产酒石酸、柠檬酸和富马酸等有机酸及含量高、具有较强耐受能力、可用于发酵白酒的金山乳杆菌菌株。
8.本发明的另一个目的是提供含有金山乳杆菌的菌剂。
9.本发明的另一个目的是提供金山乳杆菌发酵白酒的方法。
10.本发明的再一个目的是提供制备金山乳杆菌固体菌剂的方法。
11.本发明的再一个目的是提供一种金山乳杆菌及菌剂在发酵白酒中的应用。
12.本发明公开了一株新的金山乳杆菌，其特征在于,该菌株为金山乳杆菌bj01lactobacillus jinshani bj01，保藏于国家知识产权局指定的保藏机构
‑
中国典型培养物保藏中心，保藏编号为金山乳杆菌bj01株lactobacillus jinshani bj01，保藏日期是2021年4月20日。中国典型培养物保藏中心简称cctcc，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027
‑
68752319，email:cctcc@whu.edu.cn。
13.金山乳杆菌bj01菌株是从湖北省某白酒厂酒醅中经分离筛选获得。该菌株有如下特征：金山乳杆菌bj01菌株对有机酸和乙醇具有较强的耐受性，能够在ph3.5和6％(v/v)乙醇浓度的酸性mrs培养基中生长良好，发酵产总酸含量高，其中酒石酸的含量达104.8mg/l，乳酸和乙酸含量分别达7703.80mg/l和4168.87mg/l。添加该菌株酿造的白酒原酒总酸、总酯含量高，口感丰富、柔和。
14.金山乳杆菌bj01株形态特征是：菌落呈乳白色，表面隆起、光滑湿润，边缘整齐，细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，不产芽孢。
15.金山乳杆菌bj01株生化特征是：可利用葡萄糖，乳酸等。能在含乳酸和乙酸的ph3.5
‑
4.5的酸性mrs培养基中生长。
16.金山乳杆菌bj01株生长特征是：ph3.5
‑
4.0的酸性mrs平板上划线接种，分别在28℃至35℃下培养均生长良好。
17.金山乳杆菌bj01株16s rdna基因序列分析显示：金山乳杆菌bj01株与lactobacillus jinshani hslz
‑
75t菌株的序列的相似度达到99.74％。
18.本发明还公开了一种含金山乳杆菌bj01的菌剂，该菌剂主要成份是金山乳杆菌bj01株及其胞外产物和发酵基质。
19.本发明公开的菌剂为固态或液态。优先的，本发明公开的bj01乳杆菌菌剂为固态。
20.本发明还公开了一种微生物菌剂组合物，其特征在于它含有下列组份(接种量)：10份的酿酒酵母cctcc ay92003和1份金山乳杆菌bj01株。
21.本发明还公开了制备微生物菌剂组合物的方法，包括如下步骤：
22.(1)bj01菌种活化：用接种环挑取一环bj01菌种接种于ph3.5
‑
4.0的酸性mrs斜面培养基中，置30℃恒温培养箱中培养5
‑
7d；
23.(2)液体菌种的制备：挑取一环经活化的bj01菌株接入装有200ml的酸性mrs液体培养基中，静置培养5
‑
7d，制备成bj01液体菌种；
24.(3)固体菌剂的制备：将200ml培养好的bj01菌液分装4个50ml无菌离心管中，5000rpm/min离心10min，倒去上清液后加入20ml预先灭菌的含20％脱脂牛奶的保护剂中，搅拌均匀制成浓菌液。放入
‑
80℃冰箱预冻1h后，再放入
‑
40℃的真空冷冻干燥机内冷冻干
燥48h。
25.(4)粉碎：将上述固体菌剂冷冻干燥至含水率低于10％，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置冰箱冷冻层中保藏；其中，菌剂样品中bj01菌种的活菌数达500
‑
2000亿cfu/克。
26.(5)混合与包装：将酿酒酵母cctcc ay92003与bj01按活菌数比＝10:1比例混合后塑料袋后封口制成酿酒菌剂组合物。
27.本发明还公开了金山乳杆菌bj01及其微生物菌剂在发酵白酒中的应用。
28.本发明还公开了金山乳杆菌bj01菌剂组合物在发酵白酒中的应用。
29.在本发明中采用的参比菌株均为普通微生物菌种，其中耐酸乳杆菌(lactobacillus acetotolerans)cicc 20274、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)cicc 20261均登载于中国工业微生物菌种保藏管理中心目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。酿酒酵母cctcc ay92003为常用普通微生物菌种，登载于中国典型培养物保藏中心目录，处于公开状态，科学工作者可向中国典型培养物保藏中心索取。
30.本发明的优点：
31.1、本发明提供的金山乳杆菌bj01株是一株新的菌株。该菌株具有专性嗜酸等特性，只能在ph3.5
‑
4.5的酸性环境下生长，生长的ph值范围狭窄，不与酵母菌在发酵初始阶段竞争营养，有利于在白酒酸性发酵环境下发挥作用，这与其他乳杆菌明显不同。
32.2、金山乳杆菌bj01株产总酸能力强，发酵产总酸含量分别是耐酸乳杆菌cicc20274和植物乳杆菌cicc 20261的1.46倍和1.43倍。其中，bj01株产酒石酸的含量达104.81mg/l，而耐酸乳杆菌和植物乳杆菌均不产酒石酸。bj01株产柠檬酸的含量达196.23mg/l，是植物乳杆菌的8.82倍，而耐酸乳杆菌不产柠檬酸。bj01株产乳酸、乙酸和富马酸的能力均高于耐酸乳杆菌和植物乳杆菌。
33.3、金山乳杆菌bj01株具有较好的耐受性。bj01株耐酸能力好，能在ph3.5的基质中生长良好，而参比的耐酸乳杆菌cicc 20274和植物乳杆菌cicc 20261几乎不生长。bj01株对乙醇具有较好的耐受性，在含6％的乙醇培养基中生长良好，在8％的乙醇浓度下仍有一定的生长。
34.4、组合物发酵的优点：添加含金山乳杆菌bj01和酿酒酵母的组合物固态发酵白酒的总酸和总酯含量分别比对照提高20.7％和23.9％。发酵白酒风味感官好，口感柔和。
35.即金山乳杆菌bj01株具有较高的耐酸、耐乙醇能力，并具有独特的专性嗜酸生长特性，发酵产总酸能力强，产酒石酸、乳酸和乙酸等有机酸含量高，发酵白酒口感好的特点。
附图说明
36.图1是金山乳杆菌bj01菌株的系统发育树图。
具体实施方式
37.下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
38.实施例
39.实施例1金山乳杆菌bj01菌株的分离与鉴定
40.1.1金山乳杆菌bj01菌株的分离:从湖北省某白酒厂采集酒醅样品，称取酒醅样品10g，加入到90ml用乳酸调ph至3.5的酸性mrs液态培养基中，30℃静置富集培养7d后,取10ml菌液加至装有90ml无菌水的三角瓶中，摇匀稀释后，取10
‑4、10
‑5、10
‑6三个稀释梯度涂布到酸性mrs培养基上，每个稀释梯度做3个重复，置30℃厌氧培养箱中培养10
‑
15d，获得单菌落经进一步划线分离纯化保存用于菌种鉴定。采用此方法经筛选后获得1株在能在ph3.5的酸性mrs平板上厌氧生长的细菌，菌株编号为bj01，将该菌株接种于普通mrs(ph6.0)培养基中培养不能生长。
41.本发明人将分离的一株新的金山乳杆菌bj01株(lactobacillus jinshani bj01)保藏于国家知识产权局指定的保藏机构
‑
中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m2021419，保藏日期是2021年4月20日。中国典型培养物保藏中心简称cctcc，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027
‑
68752319，email:cctcc@whu.edu.cn。
42.1.2金山乳杆菌bj01株的鉴定：通过形态特征观察、生理生化测定及16s rdna基因序列分析结果对bj01进行鉴定。在鉴定中，本实验选择金山乳杆菌(lactobacillus jinshani)hslz
‑
75
t
(cicc6269)菌株作为对照菌株。金山乳杆菌cicc6269为普通微生物菌种，登载于中国工业菌种保藏中心目录中，处于公开状态，科学工作者可向保藏中心索取。
43.1.2.1金山乳杆菌bj01株形态特征是：菌落呈乳白色，表面隆起、光滑湿润，边缘整齐，细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，不产芽孢。
44.1.2.2通过16s rdna序列分析进行系统发育地位鉴定：
45.将分离纯化得到的细菌菌株接种到ph3.5的酸性mrs液态培养基中，在30℃，静置培养5
‑
7d，再利用细菌基因组试剂盒提取基因组dna。
46.采取试剂盒抽提得到细菌dna后，通过pcr扩增16s rdna，配置50μl的反应体系，细菌的16s rdna引物为27f(5'
‑
gagtttgatcctggctcag
‑
3')和1492r(5'
‑
acggctaccttgttacgactt
‑
3')。
47.pcr循环程序为：94℃预变性5min，94℃50s，54℃50s，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。扩增得到的细菌pcr产物送至金唯智生物科技有限公司测序，测序的长度在1400bp左右，测序结果采用bioaedit软件序列图谱人工校对拼接，拼接后的序列在ncbi核酸序列数据库中进行同源序列搜索比对。根据同源序列搜索结果，选取测试菌株关系较近的模式菌株的16s rdna序列区序列，用mega软件采取邻接法构建系统发育树。
48.实验得到1042bp的基因序列，在genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，bj01与lactobacillus jinshani hslz
‑
75
t
菌株的序列的相似度达到99.74％，符合kuttzman&robnett所定的同种内不同菌株见差异不超过1％的标准。图1是根据16s rdna序列所做的系统发育树。
49.1.2.3金山乳杆菌bj01株的生理生化实验测定结果：见表1。根据16s rdna序列分析结果和生理生化实验测定结果，参照文献报道(东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社,2001,267
‑
295.),可判断bj01菌为金山乳杆菌。
50.表1金山乳杆菌bj01株的生理生化实验结果
[0051][0052][0053]
1.3金山乳杆菌bj01株发酵代谢产物分析：bj01菌株采用酸性酸性mrs液体培养基，30℃静置培养7d，菌液经4000rpm离心10mim,获得发酵液上清液，经0.22μm的滤膜过滤除菌，注入2ml的液相进样瓶中分析。高效液相色谱对有机酸的测定采用安捷伦c18色谱柱，以酒石酸mg/l、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸七种标准物质作为对照，以保留时间和样品加标定性，采用峰面积外标法定量。
[0054]
高效液相测定结果表明(表2)，金山乳杆菌bj01株产总酸能力强，其发酵产总酸含量分别是耐酸乳杆菌cicc 20274和植物乳杆菌cicc 20261的1.46倍和1.43倍。其中，bj01株产酒石酸的含量达104.81mg/l，而耐酸乳杆菌和植物乳杆菌均不产酒石酸。bj01株产柠檬酸的含量达196.23mg/l，是植物乳杆菌的8.82倍，而耐酸乳杆菌不产柠檬酸。bj01株产乳酸、乙酸和富马酸的能力均高于耐酸乳杆菌和植物乳杆菌。
[0055]
表2液相色谱分析金山乳杆菌bj01株等乳杆菌发酵液中有机酸的分析结果(mg/l)
[0056][0057]
注：
“‑”
表示未检测到
[0058]
实施例2金山乳杆菌bj01生理特性分析
[0059]
2.1金山乳杆菌bj01株耐酒精能力测定结果
[0060]
将菌株bj01的种子液接入含有乙醇浓度(v/v)分别为0％、2％、4％、6％、8％、10％的酸性酸性mrs液体培养基中，30℃静置培养7d，菌液稀释10倍后用分光光度计测od
600
值。如表3所示，bj01菌株在乙醇含量0％到6％的培养基中均生长良好，在乙醇含量4％时生长量达到最大，乙醇含量达到8％时其生长受到抑制，表明bj01菌株具有较好的耐乙醇生长的能力。
[0061]
表3金山乳杆菌bj01株耐酒精生长能力测定(od
600
值)
[0062][0063]
2.2金山乳杆菌bj01株耐酸能力比较
[0064]
使用乙酸：乳酸＝1:1分别调节mrs液体培养基ph至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。将菌株bj01和耐酸乳杆菌cicc 20274、植物乳杆菌cicc 20261的种子液分别转接到上述不同ph的mrs液体培养基中，30℃静置培养5d,稀释10倍后测od
600
值。从表4可以看出，金山乳杆菌bj01生长的ph值范围很窄,具有专性嗜酸特性，其最适ph为3.5，培养基ph低于3.5或高于4.0时，bj01菌株生长会受到明显抑制几乎不生长，而耐酸乳杆菌和植物乳杆菌最适生长ph值均为6.0左右，在ph3.5时几乎不生长。表明bj01菌株耐酸生长能力明显高于耐酸乳杆菌cicc 20274和植物乳杆菌cicc 20261菌株。
[0065]
表4金山乳杆菌bj01株与耐酸乳杆菌和植物乳杆菌耐酸能力比较
[0066][0067]
2.3金山乳杆菌bj01株利用不同有机酸生长能力的测定
[0068]
分别使用乙酸、乳酸及乙酸：乳酸＝1:1的混合酸调节mrs液体培养基ph至3.5，接种经活化的bj01种子液，30℃静置培养5d,稀释10倍后测od
600
值。从表5可以看出，bj01菌株在添加乙酸的培养基中基本上不生长，而在添加有乳酸或乳酸与乙酸的混合酸培养基中均生长较好，其中，在混合酸培养基中bj01菌株的生长量达到最大。表明bj01菌株可以较好地利用乳酸生长。
[0069]
表5 bj01菌株对不同有机酸的利用能力测定结果(od
600
)
[0070][0071]
实施例3 bj01酿酒菌剂及其组合物的制备方法
[0072]
按照如下步骤进行：
[0073]
(1)bj01菌种活化：用接种环挑取一环bj01菌种接种于ph3.5
‑
4.0的酸性mrs斜面培养基中，置30℃恒温培养箱中培养5
‑
7d；
[0074]
(2)液体菌种的制备：挑取一环经活化的bj01菌株接入装有200ml的酸性mrs液体培养基中，静置培养5
‑
7d，制备成bj01液体菌种；
[0075]
(3)固体菌剂的制备：将200ml培养好的bj01菌液分装4个50ml无菌离心管中，5000rpm/min离心10min，倒去上清液后加入20ml预先灭菌的含20％脱脂牛奶的保护剂中，搅拌均匀制成浓菌液。放入
‑
80℃冰箱预冻1h后，再放入
‑
40℃的真空冷冻干燥机内冷冻干燥48h。
[0076]
(4)粉碎：将上述固体菌剂冷冻干燥至含水率低于10％，用万能粉碎机将干燥的培
养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置冰箱冷冻层中保藏；其中，菌剂样品中bj01菌种的活菌数达500
‑
2000亿cfu/克。
[0077]
(5)混合与包装：将酿酒酵母cctcc ay92003与bj01按活菌数比＝10:1比例混合后塑料袋后封口制成酿酒菌剂组合物。
[0078]
实施例4 bj01酿酒菌剂在液态白酒发酵中的应用
[0079]
将酿酒酵母ay92003与金山乳杆菌bj01酿酒菌剂分别按1:0、10:1、1:1、1:10和0:1的菌数比混合接种高粱糖化液进行液态白酒发酵。发酵结束后对发酵液进行气相色谱分析，结果见表6。从表中可以看出，当酿酒酵母ay92003与金山乳杆菌bj01菌数按10:1混合发酵时，酒样中的酒精度及乙酸乙酯、乳酸乙酯、丙酸乙酯含量较高，乙酸含量适中。表明在酿酒酵母中添加一定比例的bj01酿酒菌剂后，对于提高白酒酯类和酸类风味物质含量具有明显的促进作用。
[0080]
表6酿酒酵母ay92003与bj01不同比例混合发酵结果分析(mg/l)
[0081][0082]
实施例5 bj01酿酒组合菌剂在提高白酒品质量中的应用
[0083]
5.1试验方法
[0084]
将某白酒企业酿酒车间蒸馏后的酒醅摊凉后按照200kg/组分堆，对照组接种大曲比例为投料量的6％，实验组接种同等比例的曲粉的同时，加入实施例3制备的bj01酿酒菌剂组合物，接种比例为大曲量的0.5
‰
。接种后入池发酵30d后取样蒸馏。每个处理三个平行样。发酵结束后对蒸馏样品中的酒精度、总酸和总酯等成分含量进行气相色谱分析。主要仪器：气相色谱分析仪。
[0085]
5.2酒质色谱分析结果及感官品评
[0086]
由表7可以看出：含bj01酿酒菌剂组合物的实验组酒醅中酒精度可达5.9％，比对照组提高了1.7％。实验组中总酸、总酯的含量分别较对照组提高了20.7％、和23.9％。对提高原酒的风味和改善口感作用明显。表明酒醅中添加含bj01酿酒菌剂组合物对于提高原酒品质量有明显的促进作用。
[0087]
表7发酵酒醅蒸馏酒样中各成分气相色谱分析结果
[0088][0089]
感官品评对比为：对照组酒样分数在85
‑
89，评语是香味较谐调、酒体较丰满；实验组酒样分数在90
‑
95，评语为香味谐调、酒体醇厚、柔和。表明大曲配合使用金山乳杆菌bj01组合菌剂可以明显改善酒质，由于总酸和总酯等白酒的主要香味成分含量的增加，使酒中的香气更加协调，口感更佳。