一种适于间充质干细胞外泌体制备的饥饿处理方法与流程

1.本发明涉及生物医药的干细胞医药技术领域，尤其涉及一种适于间充质干细胞外泌体制备的饥饿处理方法及其制备的间充质干细胞外泌体及其在在治疗肺部疾病药物方面的应用。


背景技术：

2.近年来，已经有许多研究表明了间充质干细胞在再生医学领域中具有广阔的应用前景，同时国际上也已经有干细胞新药获批上市。除了干细胞本身，源自于干细胞的外泌体也成为了医学届关注的热点，为疾病的治疗带来了新思路。
3.但是，外泌体制剂存在外泌体提取效率不高的弊端，这与间充质干细胞的来源稀少一同导致了外泌体产量难以满足试验与制药的需求。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的上述缺点，本发明的目的是提供一种间充质干细胞外泌体的制备方法，旨在提升外泌体的整体制备效率。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
6.一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括预处理步骤与提纯步骤；
7.所述预处理步骤将间充质干细胞经接种培养后，于能够保持细胞存活且不超过12℃的温度下饥饿培养至可提取状态，以提高间充质干细胞外泌体的分泌量；
8.所述提纯步骤将预处理步骤所得可提取状态间充质干细胞分离提纯，得到间充质干细胞外泌体。
9.作为一种改进方案，所述低温条件为2℃～8℃，优选4℃～6℃。
10.作为一种改进方案，所述低温条件饥饿培养时间为12h～24h。
11.作为一种改进方案，所述脐带间充质干细胞为传代培养至第4-6代的脐带间充质干细胞，培养条件为37℃、5％co2、饱和湿度环境中恒温培养。
12.作为一种改进方案，所述脐带间充质干细胞是将脐带剥离脐动脉和脐静脉后，置于无血清完全培养基中，剪成组织块进行培养；待间充质干细胞(mscs)从组织块爬出且融合度达到80％时，用胰酶消化得到所述脐带间充质干细胞。
13.作为一种改进方案，所述提纯步骤先进行低速离心再进行高速离心；
14.所述低速离心将预处理所得上清液于2000-10000g转速下离心10-40min，弃沉淀物，收集上清液，以去除死细胞、大碎片、细胞器及小颗粒；
15.所述高速离心将上清液于110,000g转速下离心70-140min，弃上清液，得到的沉淀即为外泌体；
16.所述低速离心再和高速离心在2-6℃环境下进行，优选4℃。
17.前述方法制备得到的间充质干细胞外泌体，所述外泌体表达标志性蛋白cd63和alix，且所述外泌体粒径为92
±
34.1nm。
18.前述间充质干细胞外泌体在治疗肺部疾病药物方面的应用，优选治疗慢性阻塞性肺疾病药物方面的应用。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
20.1)本发明的适间充质干细胞外泌体的制备方法，通过对间充质干细胞的低温饥饿处理，可在较短时间内取得高纯度、高密度的具有生物学活性的外泌体；根据电镜下观察得，相比现有技术产量显著提升。
21.2)制备过程中，离心提取步骤的离心温度为2-10摄氏度，提高了提取过程中外泌体的生物学活性稳定性。
22.3)原代培养方法为组织块贴壁法，与酶消化法相比较操作简单、细胞纯度高、避免了消化酶对细胞对损伤、细胞活力高。细胞培养过程中采用无血清培养基，避免了血清中外泌体的干扰，提高了外泌体使用的安全性。
23.4)本发明间充质干细胞外泌体对慢性阻塞性肺损伤大鼠肺组织明显降低mda含量，增强了sod活性作用，明显降低il-1β、tnf-α含量，对大鼠慢性阻塞性肺疾病具一定的治疗作用。
附图说明
24.图1为本发明实施例的间充质干细胞(mscs)100
×
倒置显微镜观察图。
25.图2为本发明实施例的间充质干细胞(mscs)流式表型特征鉴定结果。
26.图3为本发明实施例的间充质干细胞成脂诱导分化鉴定结果。
27.图4为本发明实施例的间充质干细胞成骨诱导分化鉴定结果。
28.图5为本发明实施例的间充质干细胞成软骨诱导分化鉴定结果。
29.图6为本发明实施例的间充质干细胞外泌体对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的影响图。
30.图7为本发明实施例的间充质干细胞外泌体对慢性阻塞性肺疾病大鼠细胞因子的影响图。
31.图8为用western-blot法分析两种外泌体的标志性蛋白结果图。
32.图9为外泌体的形态透射电镜图。
33.图10为外泌体粒径检测结果图。
具体实施方式
34.现结合附图说明与实施例对本发明进一步说明：
35.实施案例1：
36.步骤1)分离培养人脐带间充质干细胞(mscs)：
37.经产妇知情同意，采集正常足月妊娠剖宫产胎儿的脐带。脐带采集之前产妇需经过严格的病原体检测，包括梅毒螺旋体、艾滋病病毒、巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和支原体等微生物，确认安全后使用。
38.剪取近胎盘端脐带20-30cm，置于4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液(pbs)中保存，4小时内使用。在生物安全柜内，将脐带剪成5cm左右的小段，用pbs洗净脐带表面残余的血液；75％酒精消毒30s；剥离脐动脉和脐静脉后，加入无血清完全培养基3-5ml，用手术剪刀剪成
1-3mm3左右的组织块；剪碎后的组织块均匀平铺于25cm2培养瓶，30-60组织块/25cm2培养瓶；在37℃、5％co2培养箱中培养；d1天、d4天补液：4ml/25cm2培养瓶；之后每2-3天换液；待间充质干细胞(mscs)从组织块爬出且融合度达到80％时(10-16天)，用0.25％胰酶消化，传代至175cm2培养瓶中继续扩增培养，并记为第1代。以后每三到四天换液或消化后传代培养，每传代一次记为一代。
39.原代培养方法为组织块贴壁法，与酶消化法相比较操作简单、细胞纯度高、避免了消化酶对细胞对损伤、细胞活力高。细胞培养过程中采用无血清培养基，避免了血清中外泌体的干扰，提高了外泌体使用的安全性。
40.步骤2)低温饥饿处理mscs
41.取第4-6代的mscs接种于175cm2培养瓶中，37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养，待细胞融合达到60-70％时，培养瓶转入2℃条件下培养，处理12小时。待细胞变圆，由贴壁状态转变为悬浮状态时，用pbs清洗细胞两次，无菌收集培养上清备用。
42.步骤3)间充质干细胞外泌体(msc-exo)的提取
43.收集mscs的细胞培养上清于500ml无菌离心瓶或50ml聚丙烯离心管中，
44.于4℃、2000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片。
45.小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4℃、10,000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒。
46.小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4℃、110,000g超速离心70分钟，
47.小心弃去上清，再加注射用生理盐水清洗一次，于4℃、110,000g超速离心70分钟，得到的沉淀即为外泌体。
48.根据电镜观察结果，外泌体分泌量为跳过低温饥饿处理，直接培育提取的对照组外泌体分泌量的120％。
49.根据最初收集的培养基的体积不同，酌情加入小体积的注射用生理盐水重悬，用bradford试剂盒检测总蛋白浓度后，-80℃分装保存。
50.实施案例2：
51.与实施案例1的区别在于步骤2)更改为培养瓶转入2℃条件下培养，处理24小时。
52.根据电镜观察结果，外泌体分泌量为跳过低温饥饿处理，直接培育提取的对照组外泌体分泌量的150％。
53.实施案例3：
54.与实施案例1的区别在于步骤2)更改为培养瓶转入4℃条件下培养，处理12小时。
55.根据电镜观察结果，外泌体分泌量为跳过低温饥饿处理，直接培育提取的对照组外泌体分泌量的250％。
56.实施案例4：
57.与实施案例1的区别在于步骤2)更改为培养瓶转入4℃条件下培养，处理24小时。
58.根据电镜观察结果，外泌体分泌量为跳过低温饥饿处理，直接培育提取的对照组外泌体分泌量的450％。
59.实施案例5：
60.与实施案例1的区别在于步骤2)更改为培养瓶转入8℃条件下培养，处理12小时。
61.根据电镜观察结果，外泌体分泌量为跳过低温饥饿处理，直接培育提取的对照组
外泌体分泌量的180％。
62.实施案例6：
63.与实施案例1的区别在于步骤2)更改为培养瓶转入8℃条件下培养，处理24小时。
64.根据电镜观察结果，外泌体分泌量为跳过低温饥饿处理，直接培育提取的对照组外泌体分泌量的350％。
65.验证例：人脐带间充质干细胞及其外泌体的鉴定
66.1)msc-exo的标志蛋白鉴定
67.用western-blot法分析两种外泌体的标志性蛋白：加适量的蛋白裂解液裂解外泌体沉淀，充分漩涡震荡；测定蛋白质浓度后，每个样取20μg，加5
×
sds上样缓冲液，99℃金属浴中加热10-15分钟；12,000g离心5分钟；上样，做10％sds-page；100v转膜70分钟，5％脱脂牛奶封闭1小时；分别加入抗cd63和alix的一抗(用tbs按1:500稀释)，4℃孵育过夜；tbst洗膜5分钟
×
4次，加相应二抗，室温孵育1.5小时；tbst洗膜5分钟
×
4次，加ecl发光液，通过化学发光凝胶成像系统成像拍照。结果如图8所示，cd63和alix在mscs外泌体中均有表达。
68.2)用透射电镜观察两种外泌体的形态
69.将外泌体充分混匀，吸取20μl滴到直径2mm的载样铜网上，室温静置5分钟，用滤纸小心吸掉多余液体。滴加醋酸双氧铀负染2分钟，用滤纸吸掉多余液体，在白炽灯下烘干；透射电镜80-120kv成像并拍照。结果如图9所示，可见直径为100nm左右的圆形囊泡状结构。
70.3)外泌体粒径检测：将外泌体送公司检测粒径分布，所用仪器是qnano。结果如图10所示，msc-exo的粒径为92
±
34.1nm。
71.该实施例结果说明，用差速离心法成功获取mscs来源的外泌体，它们都表达标志性蛋白cd63和alix，平均直径在100nm左右，透射电镜下观察到的形态符合外泌体的特征。
72.4)mscs表型及分化功能鉴定
73.取上述培养的mscs进行表型鉴定。在倒置显微镜下观察mscs的形态及贴壁性，如图1所示，mscs贴壁生长，呈长梭形，涡旋状排列。收集mscs，用pbs洗两次，分成每管1
×
106个细胞，分别加入抗人cd73-fitc、cd90-pe、cd105-pe、cd14-pe、cd19-pe、cd34-apc、cd45-pe和hla-dr-pe抗体，以及fitc-mouse-igg1、pe-mouse-igg1和apc-mouse-igg1同型对照抗体，4℃避光孵育30分钟，pbs洗两次，流式细胞术检测细胞表面标志。如图2所示，mscs阳性表达cd73、cd90和cd105，阴性表达cd14、cd19、cd34、cd45和hla-dr。mscs的成骨和成脂分化鉴定采用gibco公司的成骨和成脂分化试剂盒，货号分别是a10072-01和a10070-01，实验操作按说明书进行。实验结果如图3、4、5所示，成骨细胞被茜素红染成红棕色，脂肪细胞被油红o染成橘黄色，软骨细胞被阿辛蓝染色为浅蓝色，证明mscs具备成骨、成脂和成软骨分化能力。
74.5)慢性阻塞性肺疾病动物模型的疗效观察
75.(1)材料
76.1.1受试药：发明中分离到的间充质干细胞外泌体(msc-exo)；
77.1.2对照药：生理盐水
78.1.3动物：sd大鼠60只，雄性，体重180～200g，清洁级。
79.1.4仪器：香烟，焦油量11mg，烟气烟碱量0.7mg；powerlab16/35生物信号采集系统。
80.(2)实验方法
81.60只sd大鼠随机分为6组，分别为正常对照组、模型对照组、生理盐水组、本发明msc-exo高、中、低剂量组，5
×
106、3
×
106、1
×
106msc-exo/只。lps以无菌生理盐水配制成1mg/ml。于第1、第14天10％水合氯醛0.35g/kg腹腔注射麻醉大鼠，颈部正中切口2cm，分离气管，微量注射器由气管向肺方向滴注lps(200μg/200μl)，第2～30天(第14天除外)将大鼠放入5％香烟(红旗牌)烟雾中熏1h/d复制copd模型。对照组：不做任何干预为空白对照。msc-exo各剂量组，实验对照组(生理盐水)第1天起按5ml/只剂量雾化给药，每周1次，共30d。末次给药30min后，10％水合氯醛0.35g/kg麻醉大鼠取材。
82.(3)检测指标
83.3.1肺功能检测
84.将大鼠用10％水合氯醛0.35g/kg麻醉，于颈部正中行气管切开，插入连接有三通开关的气管插管，仰卧位放置，测定第0.3秒用力呼气容量(fev0.3)、用力肺活量(fvc)、最大呼气中段流量(mmf)与呼气峰流速(pef)等参数值。
85.3.2细胞因子测定mpo和sod、mda、tnf-a及il-1β
86.各组动物处死后，迅速打开胸腔，取出右肺中叶放入液氮中待处理。肺组织称重，以0.1g肺组织加生理盐水1ml，用玻璃匀浆器匀浆，4℃低温离心(3000r/min)，取上清液-80℃冻存，按试剂盒说明方法检测。
87.(4)统计方法
88.数据取每组10只大鼠数据平均数。
89.(5)实验结果
90.5.1本发明msc-exo对慢性阻塞性肺损伤大鼠肺功能的影响
91.模型组fvc、fev0.3、fev0.3/fvc较正常组明显下降，表明造模成功。本发明msc-exo高、中、低剂量组fvc、fev0.3、fev0.3/fvc、pef较模型组与生理盐水组有明显改善。结果见附图6。
92.5.2本发明msc-exo对慢性阻塞性肺损伤大鼠肺组织sod、mda、il-1β、tnf-α、含量的影响
93.结果如附图7所示，模型组与正常对照组相比，血清mda含量明显上升，sod活性明显下降。本发明msc-exo高剂量组、中剂量组、低剂量组明显降低mda含量，增强了sod活性作用。
94.模型组与正常对照组相比，肺组织il-1β、tnf-α含量明显升高。本发明msc-exo高剂量组、中剂量组、低剂量组明显降低il-1β、tnf-α含量。结果见附图7。
95.本研究结果表明本发明msc-exo对大鼠慢性阻塞性肺疾病具一定的治疗作用，其初步的作用机制可能与改善肺功能、提高抗氧化应激能力及下调炎症反应有关。
96.综上，本领域的普通技术人员阅读本发明文件后，根据本发明的技术方案和技术构思无需创造性脑力劳动而作出其他各种相应的变换方案，均属于本发明所保护的范围。