一种小麦原生质体、细胞质和叶绿体的分离方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小麦原生质体、细胞质和叶绿体的分离方法。


背景技术：

2.研究证明，杂交是产生生殖隔离的重要因素之一，是物种形成和分化的主要驱动力。杂交和多倍化均会造成不同亲本的核基因组融合在一起，但细胞质却仅来自某一亲本。因此，杂交和多倍体物种不仅要应对两套基因组融合的冲突，还要应对细胞核和细胞质中细胞器之间的兼容问题。例如，小麦、棉花、花生等多倍体作物，就是打破原有的的模式，重新建立了一种新的细胞核和细胞器共存的模式，而水稻、大豆中的雄性不育系，则是细胞核与线粒体不兼容导致的。将细胞器(如叶绿体)和细胞质分离并研究相应的机理，可以为作物改良提供新的思路和方法。
3.植物细胞质和叶绿体的分离主要分为高质量的原生质体提取和细胞质与叶绿体分离两部分。目前，高等植物的原生质体提取方法比较成熟，但仍然存在一定的问题，例如需要的起始量较大，得到的原生质体易碎等，这对下一步的工作会造成很大的困难。而细胞质与叶绿体分离的技术几乎没有，仅仅有一些叶绿体相关的提取方法，但这些方法通常不会考虑细胞质组分。因此，提供一种将小麦叶片中细胞质和叶绿体分离的技术，不仅为研究小麦起源与进化提供新的角度，更为小麦的种质创新提供了新的技术。


技术实现要素：

4.本发明的目的是分离小麦的细胞质、叶绿体和原生质体。
5.本发明首先保护一种分离小麦细胞质和/或叶绿体的方法，可包括如下步骤：
6.(a1)取切碎的小麦叶片，置于0.3
‑
0.5m甘露醇溶液(如0.3
‑
0.4m甘露醇溶液、0.4
‑
0.5m甘露醇溶液、0.3m甘露醇溶液、0.4m甘露醇溶液、0.5m甘露醇溶液)，黑暗条件下静置5
‑
15min(如5
‑
10min、10
‑
15min、5min、10min或15min)；
7.(a2)完成步骤(a1)后，过滤，收集沉淀；之后加入酶解液，避光，酶解；
8.所述酶解液的溶质及其浓度为15
‑
25mm(如15
‑
20mm、20
‑
25mm、15mm、20mm或25mm)mes、0.2
‑
0.6m(如0.2
‑
0.4m、0.4
‑
0.6m、0.2m、0.4m或0.6m)甘露醇、10
‑
30mm(如10
‑
20mm、20
‑
30mm、10mm、20mm或30mm)kcl、1％
‑
2％(如1％
‑
1.5％、1.5％
‑
2％、1％、1.5％或2％)纤维素酶、0.5％
‑
1％(如0.5％
‑
0.75％、0.75％
‑
1％、0.5％、0.75％或1％)离析酶、5
‑
15mm(如5
‑
10mm、10
‑
15mm、5mm、10mm或15mm)cacl2、0.1％
‑
0.5％(如0.1％
‑
0.3％、0.3％
‑
0.5％、0.1％、0.3％或0.5％)bsa，3
‑
8mm(如3
‑
5mm、5
‑
8mm、3mm、5mm或8mm)β
‑
巯基乙醇，溶剂为水，ph值自然；
9.(a3)完成步骤(a2)后，加入w5洗液，26
‑
30℃(如26
‑
28℃、28
‑
30℃、26℃、28℃或30℃)、60
‑
80rpm(如60
‑
70rpm、70
‑
80rpm、60rpm、70rpm或80rpm)避光处理5
‑
15min(如5
‑
10min、10
‑
15min、5min、10min或15min)；
10.所述w5洗液的溶质及其浓度为100
‑
200mm(如100
‑
154mm、154
‑
200mm、100mm、154mm或200mm)nacl、100
‑
150mm(如100
‑
125mm、125
‑
150mm、100mm、125mm或150mm)cacl2、2
‑
8mm(如2
‑
5mm、5
‑
8mm、2mm、5mm或8mm)kcl、1
‑
4mm(如1
‑
2mm、2
‑
4mm、1mm、2mm或4mm)mes，溶剂为水，ph值5.7
‑
6.0(如5.7、5.8、5.9或6.0)；
11.(a4)完成步骤(a3)后，过滤，收集滤液；之后离心，收集沉淀；沉淀用所述w5洗液洗涤3次以上；
12.(a5)完成步骤(a4)后，加入fma溶液、fmb溶液和fmc溶液，离心，收集fmb溶液和fmc溶液界面间的液体，即小麦原生质体；
13.所述fma溶液的溶质及其浓度为0.3
‑
0.6m(如0.3
‑
0.5m、0.5
‑
0.6m、0.3m、0.5m或0.6m)蔗糖、0.8
‑
1.2mm(如0.8
‑
1.0mm、1.0
‑
1.2mm、0.8mm、1.0mm或1.2mm)mgcl2、ph7.0、3
‑
7mm(如3
‑
5mm、5
‑
7mm、3mm、5mm或7mm)hepes，溶剂为水，ph值自然；
14.所述fmb溶液的溶质及其浓度为0.2
‑
0.5m(如0.2
‑
0.4m、0.4
‑
0.5m、0.2m、0.4m或0.5m)蔗糖、0.8
‑
1.2mm(如0.8
‑
1.0mm、1.0
‑
1.2mm、0.8mm、1.0mm或1.2mm)mgcl2、ph7.0、3
‑
7mm(如3
‑
5mm、5
‑
7mm、3mm、5mm或7mm)hepes、0.05
‑
0.15m(如0.05
‑
0.10m、0.10
‑
0.15m、0.05m、0.10m或0.15m)山梨醇，溶剂为水，ph值自然；
15.所述fmc溶液的溶质及其浓度为0.8
‑
1.2mm(如0.8
‑
1.0mm、1.0
‑
1.2mm、0.8mm、1.0mm或1.2mm)mgcl2、ph7.0、3
‑
7mm(如3
‑
5mm、5
‑
7mm、3mm、5mm或7mm)hepes、0.3
‑
0.8m(如0.3
‑
0.5m、0.5
‑
0.8m、0.3m、0.5m或0.8m)山梨醇，溶剂为水，ph值自然；
16.(a6)完成步骤(a5)后，向小麦原生质体中加入wh溶液，避光，3
‑
6℃(如3
‑
4℃、4
‑
6℃、3℃、4℃或6℃)过夜；
17.所述wh溶液的溶质及其浓度为0.3
‑
0.8m(如0.3
‑
0.5m、0.5
‑
0.8m、0.3m、0.5m或0.8m)甘露醇、10
‑
30mm(如10
‑
20mm、20
‑
30mm、10mm、20mm或30mm)kcl、2
‑
6mm(如2
‑
4mm、4
‑
6mm、2mm、4mm或6mm)mes，溶剂为水，ph值5.7；
18.(a7)完成步骤(a6)后，收集沉淀并加入homogenization缓冲液，混匀；
19.所述homogenization缓冲液的溶质及其浓度为0.3
‑
0.5m(如0.3
‑
0.4m、0.4
‑
0.5m、0.3m、0.4m或0.5m)蔗糖、2
‑
4mm(如2
‑
3mm、3
‑
4mm、2mm、3mm或4mm)edta、40
‑
60mm(如40
‑
50mm、50
‑
60mm、40mm、50mm或60mm)tris
‑
hcl、1.5
‑
2.5m(如1.5
‑
2.0m、2.0
‑
2.5m、1.5m、2.0m或2.5m)dtt，溶剂为水，ph值自然；
20.(a8)完成步骤(a7)后，进行破碎，离心，收集沉淀；沉淀即为小麦叶绿体；
21.(a9)完成步骤(a7)后，进行破碎，离心，收集上清液；上清液即为小麦细胞质。
22.所述步骤(a1)中，小麦叶片可为生长至3叶期的小麦叶片(如生长至第16天的小麦叶片)。
23.所述步骤(a1)中，切碎可为将所述小麦叶片置于放在冰上的培养皿中切碎至细丝状，得到碎叶。
24.所述步骤(a2)或步骤(a4)中，过滤可采用神奇滤布过滤。
25.所述步骤(a4)中，离心参数可为室温条件下、80g离心5min。
26.所述步骤(a6)中，小麦原生质体和wh溶液的体积比可为1:3
‑
5(如1:3
‑
4、1:4
‑
5、1:3、1:4或1:5)。
27.所述步骤(a7)中，沉淀和homogenization缓冲液的比例可为2.0g小麦叶片获得的
沉淀：1
‑
3ml(如1ml、2ml或3ml)homogenization缓冲液。
28.所述步骤(a8)中，进行破碎可为50
‑
60次(如50
‑
55次、55
‑
60次、50次、55次或60次)研磨。离心为3
‑
5℃(如3
‑
4℃、4
‑
5℃、3℃、4℃或5℃)、600
‑
1000g(如600
‑
800g、800
‑
1000g、600g、800g或1000g)离心10
‑
20min(如10
‑
15min、15
‑
20min、10min、15min或20min)。
29.所述步骤(a8)或所述步骤(a9)中，进行破碎可为在冰上使用预冷的glass/teflon potter elvehjem homogenizers进行破碎。
30.所述步骤(a9)中，进行破碎可为4
‑
10次(如4
‑
5次、5
‑
10次、4次、5次或10次)研磨。离心可为2次以上离心。第1次离心可为3
‑
5℃(如3
‑
4℃、4
‑
5℃、3℃、4℃或5℃)、600
‑
1000g(如600
‑
800g、800
‑
1000g、600g、800g或1000g)离心10
‑
20min(如10
‑
15min、15
‑
20min、10min、15min或20min)，收集上清液。第2次以上离心为3
‑
5℃(如3
‑
4℃、4
‑
5℃、3℃、4℃或5℃)、8000
‑
12000g(如8000
‑
10000g、10000
‑
12000g、8000g、10000g或12000g)离心10
‑
40min(如10
‑
20min、20
‑
40min、10min、20min、30min或40min)，收集上清液。
31.本发明还保护一种分离小麦原生质体的方法，包括如下步骤：
32.(b1)取切碎的小麦叶片，置于上述任一所述甘露醇溶液，黑暗条件下静置5
‑
15min(如5
‑
10min、10
‑
15min、5min、10min或15min)；
33.(b2)完成步骤(b1)后，过滤，收集沉淀；之后加入上述任一所述酶解液，避光，酶解；
34.(b3)完成步骤(b2)后，加入上述任一所述w5洗液，26
‑
30℃(如26
‑
28℃、28
‑
30℃、26℃、28℃或30℃)、60
‑
80rpm(如60
‑
70rpm、70
‑
80rpm、60rpm、70rpm或80rpm)避光处理5
‑
15min(如5
‑
10min、10
‑
15min、5min、10min或15min)；
35.(b4)完成步骤(b3)后，过滤，收集滤液；之后离心，收集沉淀；沉淀用上述任一所述w5洗液洗涤3次以上；
36.(b5)完成步骤(b4)后，加入上述任一所述fma溶液、上述任一所述fmb溶液和上述任一所述fmc溶液，离心，收集fmb溶液和fmc溶液界面间的液体，即小麦原生质体。
37.所述步骤(a2)或所述步骤(b2)中，沉淀和酶解液的比例可为2.0g小麦叶片获得的沉淀：30
‑
50ml(如30
‑
40ml、40
‑
50ml、30ml、40ml或50ml)酶解液。酶解的参数可为26
‑
30℃(如26
‑
28℃、28
‑
30℃、26℃、28℃或30℃)、60
‑
80rpm(如60
‑
70rpm、70
‑
80rpm、60rpm、70rpm或80rpm)处理3
‑
5h(如3
‑
4h、4
‑
5h、3h、4h或5h)。
38.所述步骤(a3)或所述步骤(b3)中，w5洗液和酶解液的体积比可为1:0.5
‑
1.5(如1:0.5
‑
1.0、1:1.0
‑
1.5、1:0.5、1:1.0、1:1.5)。
39.所述步骤(a5)或所述步骤(b5)中，沉淀、fma溶液、fmb溶液和fmc溶液的比例具体可为2.0g小麦叶片获得的沉淀：15ml fma溶液：7.5ml fmb溶液：3ml fmc溶液。
40.上述任一所述甘露醇溶液可为甘露醇水溶液。
41.上述任一所述水可为ro水。
42.本发明还保护试剂盒甲或试剂盒乙。
43.所述试剂盒甲，包括上述任一所述酶解液、上述任一所述w5洗液、上述任一所述fma溶液、上述任一所述fmb溶液、上述任一所述fmc溶液、上述任一所述wh溶液和上述任一所述homogenization缓冲液。
44.所述试剂盒甲具体可由上述任一所述酶解液、上述任一所述w5洗液、上述任一所
述fma溶液、上述任一所述fmb溶液、上述任一所述fmc溶液、上述任一所述wh溶液和上述任一所述homogenization缓冲液组成。
45.所述试剂盒乙，包括上述任一所述酶解液、上述任一所述w5洗液、上述任一所述fma溶液、上述任一所述fmb溶液和上述任一所述fmc溶液。
46.所述试剂盒乙具体可由上述任一所述酶解液、上述任一所述w5洗液、上述任一所述fma溶液、上述任一所述fmb溶液和上述任一所述fmc溶液组成。
47.本发明还保护a1)
‑
a6)中的至少一种。
48.a1)上述任一所述的方法在分离小麦细胞质和/或叶绿体中的应用。
49.a2)上述任一所述的方法在小麦细胞质和/或叶绿体基因组或蛋白提取中的应用。
50.a3)上述任一所述的方法在分离小麦原生质体中的应用。
51.a4)上述任一所述的方法在小麦原生质体基因组或蛋白提取中的应用。
52.a5)上述任一所述试剂盒甲在分离小麦细胞质和/或叶绿体中的应用。
53.a6)上述任一所述试剂盒乙在分离小麦原生质体中的应用。
54.本发明具有如下的优点：
55.1)现有提取原生质体的方法容易造成原生质体破碎且需要的原材料用量比较大，而本发明提供的方法可以对已破碎的原生质体进行进一步纯化，从而得到大量完整的原生质体；
56.2)目前已有的叶绿体提取技术只针对叶绿体这一细胞器进行提取，不考虑细胞质的情况，而本发明提供的方法可以对叶绿体和细胞质进行分离，细胞质极少受到叶绿体的污染。
57.3)本发明可以有效得到高质量的叶绿体和细胞质，提取的叶绿体和细胞质适用于蛋白提取、蛋白质谱以及蛋白定量等试验。
58.本发明具有重要的应用价值。
附图说明
59.图1为提取小麦原生质体的过程。
60.图2为蔗糖密度梯度离心法纯化小麦原生质体。
61.图3为纯化前的小麦原生质体和纯化后的小麦原生质体显微镜下的状态。
62.图4为叶绿体浓缩蛋白、细胞质浓缩蛋白和原生质体浓缩蛋白的western blot检测结果。
具体实施方式
63.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
64.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
65.纤维素酶r
‑
10(以下简称纤维素酶)为yakult honsha公司的产品，产品目录号为
l0012
‑
10g。纤维素酶的比活力>10000u/g。
66.纤维素酶酶活力定义为：1g酶粉(或1ml酶液)于50℃、ph4.8条件下，1min水解底物(滤纸、cmc、脱脂棉或水杨素)产生1μg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。
67.离析酶r
‑
10(以下简称离析酶)为yakult honsha公司的产品，产品目录号为l0021
‑
10g。离析酶的比活力>3000u/g。
68.离析酶酶活力定义为：1g酶粉(或1ml酶液)在50℃、ph 3.5条件下，1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为1个酶活力单位。
69.普通小麦taa10即天然六倍体taa10，记载于如下文献中：朱博.普通小麦bbaa亚基因组在异源六倍体轨迹中转录组的进化研究[d].2014年，东北师范大学博士学位论文.在下文中，普通小麦taa10简称小麦。
[0070]
下述实施例涉及的溶液的组成如下：
[0071]
酶解液的溶质及其浓度为20mm mes(吗啉乙磺酸)、0.4m甘露醇、20mm kcl、1.5％纤维素酶、0.75％离析酶、10mm cacl2、0.1％bsa(牛血清白蛋白)，5mmβ
‑
巯基乙醇，溶剂为水，ph值自然。
[0072]
w5洗液的溶质及其浓度为154mm nacl、125mm cacl2、5mm kcl、2mm mes，溶剂为水，ph值5.7
‑
6.0。
[0073]
fma溶液的溶质及其浓度为0.5m蔗糖、1.0mm mgcl2、5mm hepes(ph7.0)，溶剂为水，ph值自然。
[0074]
fmb溶液的溶质及其浓度为0.4m蔗糖、1.0mm mgcl2、5mm hepes(ph 7.0)、0.1m山梨醇，溶剂为水，ph值自然。
[0075]
fmc溶液的溶质及其浓度为1.0mm mgcl2、5.0mm hepes(ph7.0)、0.5m山梨醇，溶剂为水，ph值自然。
[0076]
wh溶液的溶质及其浓度为0.5m甘露醇、20mm kcl、4mm mes，溶剂为水，ph值5.7(用naoh调节)。
[0077]
homogenization缓冲液的溶质及其浓度为0.4m蔗糖、3mm edta、50mm tris
‑
hcl、2mm dtt，溶剂为水，ph值自然。需要说明的是，其中dtt为使用前加入。
[0078]
ip裂解缓冲液的溶质及其浓度为100mm tris
‑
hcl、150mm nacl、5mm egta、5mm edta、2mm dtt、0.5％triton x
‑
100、10％cocktail，溶剂为水，ph值自然。
[0079]
实施例1、小麦原生质体、细胞质和叶绿体的分离方法的建立
[0080]
本发明的发明人经过大量实验，建立了一种小麦原生质体、细胞质和叶绿体的分离方法。具体步骤如下：
[0081]
小麦原生质体的提取过程见图1。
[0082]
1、取正常生长至第16天的小麦叶片2.0g，置于放在冰上的培养皿中切碎至细丝状，得到碎叶。
[0083]
2、完成步骤1后，将碎叶置于0.4m甘露醇水溶液，黑暗条件下静置10min。
[0084]
3、完成步骤2后，将碎叶用神奇滤布过滤，然后放入装有40ml酶解液的三角瓶中，用锡纸将三角瓶包裹起来，放入28℃、70rpm的摇床中缓慢摇动4h(目的为进行酶解)。
[0085]
4、完成步骤3后，向三角瓶中加入等体积的w5洗液，用锡纸包好后放回摇床28℃、70rpm的条件下缓慢摇动10min，得到混合溶液。
[0086]
5、完成步骤4后，用神奇滤布过滤步骤(4)得到的混合溶液，收集滤液并转移至锡纸包裹的50ml离心管中，室温条件下、80g离心5min，收集沉淀并用15ml w5洗液重悬，得到重悬液1；将重悬液1室温条件下、80g离心5min，收集沉淀并用15ml w5洗液重悬，得到重悬液2；将重悬液2室温条件下、80g离心5min，收集沉淀。该沉淀为纯化前的小麦原生质体。
[0087]
6、完成步骤5后，向所述沉淀缓慢加入15ml fma溶液，随后依次用注射器(不需要针头)缓慢加入7.5ml fmb溶液和3ml fmc溶液；4℃条件下、250g离心5min(见图2)；使用注射器(不锈钢平口针头)收集液体(fmb溶液和fmc溶液界面间深色条带)至新的15ml离心管，该液体即为纯化后的小麦原生质体。
[0088]
在显微镜下观察纯化前的小麦原生质体和纯化后的小麦原生质体。
[0089]
结果见图3。
[0090]
7、完成步骤6后，向所述离心管(含小麦原生质体)缓慢加入4倍体积wh溶液，锡纸包裹后4℃过夜，使原生质体自然沉降。
[0091]
8、完成步骤7后，将上清液吸出，保留沉淀，加入2ml homogenization缓冲液，缓慢摇匀后随机分为两份，分明命名为悬浮液a(用于细胞质的提取)和悬浮液b(用于叶绿体的提取)。
[0092]
9、完成步骤8后，在冰上使用预冷的glass/teflon potter elvehjem homogenizers对悬浮液a进行破碎(研磨次数设定为55次)，得到混合溶液；将该混合溶液转移至新的2ml离心管，4℃条件下、800g离心15min，收集沉淀，沉淀即为小麦叶绿体。
[0093]
10、完成步骤8后，在冰上使用预冷的glass/teflon potter elvehjem homogenizers对悬浮液b进行破碎(研磨次数设定为5次)，得到混合溶液；将该混合溶液转移至新的2ml离心管，4℃条件下、800g离心15min，收集上清液1。
[0094]
11、完成步骤10后，将上清液1转移至超速离心管中，放入超速离心机，4℃条件下、10000g离心15min，收集上清液2；将上清液2转移至新的超速离心管中，放入超速离心机，4℃条件下、10000g离心30min，收集上清液3。上清液3即为小麦细胞质。
[0095]
实施例2、实施例1提取的小麦叶绿体和小麦细胞质的验证
[0096]
1、取实施例1中步骤9提取的小麦叶绿体，加入200ul ip裂解缓冲液，充分裂解后，4℃条件下、12000rpm离心15min，收集上清液，即叶绿体蛋白上清液。
[0097]
2、将叶绿体蛋白上清液转移至3kda ultrafree离心过滤浓缩装置，4℃条件下、4000g离心30min，得到叶绿体浓缩蛋白。
[0098]
3、取实施例1中步骤11提取的小麦细胞质，加入200ul ip裂解缓冲液，充分裂解后，4℃条件下、12000rpm离心15min，收集上清液，即细胞质蛋白上清液。
[0099]
4、将细胞质蛋白上清液转移至3kda ultrafree离心过滤浓缩装置，4℃条件下、4000g离心30min，得到细胞质浓缩蛋白。
[0100]
5、取实施例1中步骤6提取的纯化后的小麦原生质体，加入200ul ip裂解缓冲液，充分裂解后，4℃条件下、12000rpm离心15min，收集上清液，即原生质体蛋白上清液。
[0101]
6、将原生质体蛋白上清液转移至3kda ultrafree离心过滤浓缩装置，4℃条件下、4000g离心30min，得到原生质体浓缩蛋白。
[0102]
7、将蛋白(叶绿体浓缩蛋白、细胞质浓缩蛋白或原生质体浓缩蛋白)进行western blot，采用特异性抗体cfbpase(agrisera公司的产品，产品目录号为as04043)作为一抗检
测细胞质，采用特异性抗体rbcl(agrisera公司的产品，产品目录号为as03037a)作为一抗检测叶绿体。
[0103]
检测结果见图4。结果表明，叶绿体浓缩蛋白和细胞质浓缩蛋白的纯度较高，没有明显的相互污染；即实施例1提取的小麦叶绿体和小麦细胞质较纯，没有污染。
[0104]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。