用贻贝制备牛磺酸的方法

本发明涉及牛磺酸的制备方法，特别涉及用贻贝制备牛磺酸的方法。

背景技术：

牛磺酸，又称为牛胆素和牛胆碱，是一种非蛋白质氨基酸。牛磺酸具有消炎、解热镇痛和促进大脑发育、增强视力、调节神经传导及促进吸收，不仅参与维持机体内环境稳定，而且对中枢、消化、生殖、心血管、免疫和内分泌等系统生理功能的正常发挥具有重要调节作用，因此，被广泛应用于食品工业、饲料工业和医药工业等诸多领城。

牛磺酸广泛分布于动物各组织细胞液中，在水产动物尤其是海洋动物体内含量极为丰富。研究表明，海洋生物贻贝的含有较高含量的牛磺酸，贻贝中牛磺酸的含量约占总氨基酸的3.9％。牛磺酸绝大部分分布在细胞内，各种组织细胞内外牛磺酸浓度从100:1到50000:1。因此，细胞膜充分破裂有助于更完全地释放出牛磺酸，从而提高牛磺酸的提取率。提取牛磺酸采用何种细胞破碎技术是直接影响到牛磺酸得率的第一关键因素。

然而，贻贝在我国虽有极丰富的资源，但由于加工技术落后，被认为是一种低值海产品，90％的贻贝用于生鲜、冷冻制品的销售，附加值低下，资源浪费严重。关于如何利用贻贝制备牛磺酸的研究较少。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有的天然牛磺酸提取方法提取成本高、提取率低的问题。利用细胞破碎技术，提供一种提取率高，提取工艺简单，提取成本低的从贻贝粉中提取牛磺酸的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用贻贝制备牛磺酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)冷冻干燥：取新鲜贻贝数只，将肉挖出，称重，放入-20℃冰箱冷冻4小时或者放入液氮中1-3分钟，取出后放入已经预冷的冷冻干燥机，干燥后取出。

(2)研磨、过筛：将冷冻干燥后的贻贝肉用小型万能粉碎机粉碎，得冻干贻贝粉，经筛网过筛。

(3)提取：加入纯化水，置于恒温水浴锅中，加热提取，冷却至室温，用4层纱布进行过滤，滤液浓缩至其体积的约1/6倍。

(4)除蛋白：在浓缩液中缓慢加入6mol/l盐酸溶液，调节ph至3.00，离心去除酸性蛋白，取上清液；在上清液中缓慢加入5mol/lnaoh，调节ph至10.00，离心去除碱性蛋白，取上清液；上清液再次用6mol/l盐酸溶液调节ph至4.00，离心去除酸性蛋白。

(5)纯化：取适量浓缩提取液，使其经过强酸性阳离子交换树脂，用超纯水洗脱，试管收集洗脱液，每管约10ml，对收集到的洗脱液进行电导率测定，记录流出液的电导率的变化，并收集电导率从开始下降至稳定期间的洗脱液，即为牛磺酸含量较高的洗脱液。

(6)浓缩：将收集到的洗脱液用旋转蒸发仪进行浓缩，至原体积的1/10。

(7)重结晶：在浓缩洗脱液中加入无水乙醇，放入4℃冰箱，即可析出粗品牛磺酸，粗品牛磺酸加适量水溶解，再加入无水乙醇，反复多次可得到纯度较高的牛磺酸晶体。

其中所述6mol/l盐酸溶液为水与质量浓度为37％的浓盐酸按1:1的体积比混合而得。

牛磺酸提取率计算方法如下，以冷冻干燥前贻贝鲜肉质量计算：

式中：

c1为洗脱液中牛磺酸的浓度，mg/ml；

v1为洗脱液体积，ml；

w1为贻贝鲜肉的质量，g。

进一步的，步骤(1)中放入冷冻干燥机中干燥，干燥时间为48h。

进一步的，步骤(2)中过筛目数为80目。

进一步的，步骤(3)中加入纯化水的料液比为1:20，水浴温度为60℃，加热提取时间为2h。

进一步的，步骤(4)中，三次离心转速均为5000rpm，时间均为15min。

进一步的，步骤(5)中，强酸性阳离子交换树脂为732#强阳离子树脂。

进一步的，步骤(5)中，洗脱速度为5ml/min，即每秒一滴。

进一步的，步骤(7)中，浓缩液与无水乙醇的体积比为1:3，在冰箱中的放置时间为12h。

本发明具有如下技术效果：

利用细胞破碎技术，将贻贝鲜肉冷冻干燥，然后机械研磨得到冻干贻贝粉，用水提法提取得到天然牛磺酸，收率比用新鲜贻贝直接提取提高50.80％。

通过冷冻干燥技术使贻贝细胞失水，细胞内盐分浓度增大，细胞渗透性发生变化，且冷冻干燥后的贻贝疏松、多孔、易粉碎，对其进行机械研磨，加工成贻贝冻干粉末，可以进一步对贻贝细胞进行破碎。然后利用水对干燥细胞进行处理，细胞膜发生破坏，细胞内的牛磺酸被释放出来。

冻干贻贝粉生产工艺简单，运输方便，储存成本较低。此加工方法不仅能够突破从天然产物中提取牛磺酸的技术瓶颈，为天然牛磺酸分离提取工艺的产业化提供理论依据，并且有助于解决贻贝滞销问题。

附图说明

图1是冷冻干燥后贻贝肉过80目后的扫描电镜照片，放大倍数为100倍。

图2是冷冻干燥后贻贝肉过80目后的扫描电镜照片，放大倍数为5000倍。

具体实施例

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。

实施例1

(1)冷冻干燥：取贻贝鲜肉适量，称重，放入-20℃冰箱冷冻4h，取出后放入已经预冷的冷冻干燥机，干燥48h后取出。冷冻干燥机型号：fd-1a-50。冷冻干燥条件：-50℃以下，真空度1000pa以下。

(2)研磨：将冷冻干燥后的贻贝肉用小型万能粉碎机粉碎，过80目筛，得冻干贻贝粉，称重，计算得干重比约为1:4，即1g贻贝粉相当于4g贻贝鲜肉的质量，贻贝粉放在4℃冰箱保存。

(3)提取：取冻干贻贝粉25g约相当于100g贻贝鲜肉，按料液比为1:20的比例加入纯化水，置于60℃恒温水浴锅中，加热提取2h，冷却至室温，用4层纱布进行过滤，滤液浓缩至其体积的约1/6倍。

(4)除蛋白：在浓缩液中缓慢加入6mol/l盐酸溶液，调节ph至3.00，5000rpm离心15min去除酸性蛋白，取上清液；在上清液中缓慢加入5mol/lnaoh，调节ph至10.00，5000rpm离心15min去除碱性蛋白，取上清液；上清液再次用6mol/l盐酸溶液调节ph至4.00，5000rpm离心15min，离心去除酸性蛋白，待上柱。

(5)纯化：取浓缩提取液上柱，用超纯水洗脱，洗脱速度为5ml/min即每秒一滴，试管收集洗脱液，每管约10ml，对收集到的洗脱液进行电导率测定，记录流出液的电导率的变化，并收集电导率从开始下降至稳定期间的洗脱液，即为牛磺酸含量较高的洗脱液。普通玻璃层析离子交换柱，型号为上海琪特分析仪器公司，26×500mm。因为电导率因牛磺酸的浓度不同而不同，没法确定具体的电导率收集区间，所以根据电导率的变化趋势来收集。

(6)提取量的测定：精密量取1.0mol/l醋酸钠溶液10ml，乙酰丙酮0.4ml，甲醛1ml于25ml容量瓶中，用蒸馏水定容，得显色剂。精密量取1ml洗脱液置于10ml容量瓶中，加入1ml显色剂后用蒸馏水定容，置于100℃恒温水浴锅中，加热20min，冷却至室温，即得样品溶液。所得样品溶液在400nm波长处有最大吸收波长，与牛磺酸标准谱图对照，有相同的最大吸收峰，因此与牛磺酸标准品一致，确定提取的为牛磺酸。用分光光度法测定牛磺酸标准品得到牛磺酸标准曲线后，测定贻贝冻干粉牛磺酸提取量为0.9030mg/g。

(7)浓缩：将收集到的洗脱液用旋转蒸发仪进行浓缩，至原体积的1/10。

(8)重结晶：在浓缩洗脱液中加入无水乙醇，放入4℃冰箱，即可析出粗品牛磺酸，粗品牛磺酸加适量水溶解，再加入无水乙醇，反复多次可得到纯度较高的牛磺酸晶体，牛磺酸纯度经hplc分析为95.2％。在一个具体的方案中，在浓缩洗脱液中加三倍体积无水乙醇，放入4℃冰箱，可得牛磺酸粗品。加入适量水使牛磺酸粗品正好溶解，再加入无水乙醇，使乙醇浓度达到75％，反复多次可得到纯度较高的牛磺酸晶体。

实施例2

(1)匀浆：称取贻贝鲜肉100g，放入组织匀浆机中匀浆

(2)提取：将匀浆液按料液比为1：5的比例加入纯化水，置于60℃恒温水浴锅中，加热提取2h，冷却至室温，用4层纱布进行过滤，滤液浓缩至其体积的约1/6倍。

后续除蛋白、纯化、提取量的测定、浓缩、重结晶等步骤与实施例1中第(3)至第(8)步一致，所得样品溶液在400nm波长处有最大吸收波长，与牛磺酸标准品一致。用分光光度法测定牛磺酸标准品得到牛磺酸标准曲线后，测定贻贝鲜肉牛磺酸提取量为0.5988mg/g。重结晶后得到牛磺酸晶体，纯度经hplc分析为92.7％。

实施例3

与实施例1操作步骤相同，在料液比分别为1:5，1:20，1:100，1:150条件下，得到牛磺酸提取率分别为0.7243mg/g，0.9030mg/g，0.8876mg/g，0.7901mg/g。因此本试验较适宜的料液比为1:20。

实施例4

与实施例1操作步骤相同，在温度分别为40℃，60℃，80℃，90℃条件下，得到牛磺酸提取率分别为0.3498mg/g，0.9030mg/g，0.8476mg/g，0.7811mg/g。因此本试验较适宜的料液比为60℃。

实施例5

与实施例1操作步骤相同，将冷冻干燥后的贻贝肉用小型万能粉碎机粉碎，分别过10目、50目、80目、120目筛，得到牛磺酸提取率分别为0.7451mg/g，0.8359mg/g，0.9030mg/g，0.9062mg/g。考虑到粉碎目数超过80目，提取率增加不明显，且粉碎能耗会增加，因此本试验较适宜的粉碎目数为80目。冷冻干燥后贻贝肉过80目后的扫描电镜照片，其中，图1是放大100倍的照片，图2是放大5000倍的照片。