针对sars‑cov‑2的抗体及其用途
技术领域：
：1.本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是sars‑cov‑2的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及抗sars‑cov‑2的单克隆抗体，以及包含所述抗体的组合物(例如，诊断剂和治疗剂)。此外，本发明还涉及所述抗体的用途。本发明的抗体可用于诊断、预防和/或治疗sars‑cov‑2感染和/或由所述感染引起的疾病(例如，covid‑19)。
背景技术：
：：2.冠状病毒(coronavirus)感染可导致人类发生呼吸系统疾病，轻症冠状病毒感染可导致流感样症状，重症感染则可发展为严重病毒性肺炎，威胁人类生命健康。冠状病毒可同时感染人类与动物，一些动物源冠状病毒如果突破宿主屏障感染人类，可能在人群中快速扩散并导致严重疾病。3.目前，尚无批准用于预防或治疗sars‑cov‑2感染的特效药物。应对sars‑cov‑2感染引起的肺炎患者仅给予一般的支持性治疗，氧疗措施和抗病毒治疗，如α‑干扰素、洛匹那韦/利托那韦、磷酸氯喹等，这些措施带来的临床效果有限。研究发现，在新冠肺炎的恢复者体内通常伴随着较高水平的sars‑cov‑2中和抗体产生。在国家卫健委发布的新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)中，对病情进展较快、重型和危重型患者推荐进行康复者血浆治疗。有研究数据表明，对确证患有covid‑19并同时伴有严重呼吸窘迫综合征(ards)的危重症患者使用含有中和抗体的康复期血浆治疗后，病人体内的病毒载量迅速降低，患者的临床症状得到有效改善。这些研究表明了体液免疫在sars‑cov‑2中的重要性，且表明了除了疫苗研发外，应当研制一种能够高效和特异性中和sars‑cov‑2的单克隆抗体，用于covid‑19的短期预防和有效治疗，这对我国乃至全球防治covid‑19具有重要意义。技术实现要素：4.在本技术中，发明人首先开发了具有优良性质的兔源抗体，其特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的受体结合区(rbd)。在此基础上，发明人又付出了大量的创造性劳动，对该兔源抗体进行了深入的研究和改造，从而开发了该兔源抗体的人源化抗体。本发明的抗体能够中和sars‑cov‑2，阻断或抑制sars‑cov‑2与受体ace2的结合。因此，本发明的抗体具有用于预防和/或治疗sars‑cov‑2感染或由sars‑cov‑2感染所导致的疾病的潜力，具有重大的临床价值。5.本发明的抗体6.在一个方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的受体结合区(rbd)，所述抗体或其抗原结合片段包含：7.(a)包含下述3个根据kabat编号系统定义的互补决定区(cdrs)的重链可变区(vh)：8.(i)vhcdr1，其由下述序列组成：seqidno:3，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，9.(ii)vhcdr2，其由下述序列组成：seqidno:4，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和10.(iii)vhcdr3，其由下述序列组成：seqidno:5，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；11.和/或，12.(b)包含下述3个根据kabat编号系统定义的互补决定区(cdrs)的轻链可变区(vl)：13.(iv)vlcdr1，其由下述序列组成：seqidno:6，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，14.(v)vlcdr2，其由下述序列组成：seqidno:7，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和15.(vi)vlcdr3，其由下述序列组成：seqidno:8，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。16.在某些实施方案中，(i)‑(vi)任一项中所述的置换为保守置换。17.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如下3个根据kabat编号系统定义的重链cdrs：序列为seqidno：3的vhcdr1，序列为seqidno：4的vhcdr2，序列为seqidno：5的vhcdr3；和/或，如下3个根据kabat编号系统定义的轻链cdrs：序列为seqidno：6的vlcdr1，序列为seqidno：7的vlcdr2，序列为seqidno：8的vlcdr3。18.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：19.(a)包含下述3个根据imgt编号系统定义的互补决定区(cdrs)的重链可变区(vh)：20.(i)vhcdr1，其由下述序列组成：seqidno:9，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，21.(ii)vhcdr2，其由下述序列组成：seqidno:10，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和22.(iii)vhcdr3，其由下述序列组成：seqidno:11，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；23.和/或，24.(b)包含下述3个根据imgt编号系统定义的互补决定区(cdrs)的轻链可变区(vl)：25.(iv)vlcdr1，其由下述序列组成：seqidno:12，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，26.(v)vlcdr2，其由下述序列组成：seqidno:13，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和27.(vi)vlcdr3，其由下述序列组成：seqidno:14，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。28.在某些实施方案中，(i)‑(vi)任一项中所述的置换为保守置换。29.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如下3个根据imgt编号系统定义的重链cdrs：序列为seqidno：9的vhcdr1，序列为seqidno：10的vhcdr2，序列为seqidno：11的vhcdr3；和/或，如下3个根据imgt编号系统定义的轻链cdrs：序列为seqidno：12的vlcdr1，序列为seqidno：13的vlcdr2，序列为seqidno：14的vlcdr3。30.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如seqidno:1所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seqidno:2所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr。在某些实施方案中，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义。31.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：32.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：33.(i)seqidno：1所示的序列；34.(ii)与seqidno：1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或35.(iii)与seqidno：1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；36.和37.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：38.(iv)seqidno：2所示的序列；39.(v)与seqidno：2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或40.(vi)与seqidno：2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。41.在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。42.在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seqidno:1所示的序列的vh和包含如seqidno:2所示的序列的vl。43.在某些实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段可以是人源化的，以减少对人的免疫原性。对非人抗体进行人源化的方法是本领域已知的，例如可以使用本领域已知的方法将本发明抗体或其抗原结合片段的cdr区移植入人源框架序列。44.在某些实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段可以包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列，所述框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至相应的兔源残基的回复突变。45.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列(即，人重链胚系基因所编码的氨基酸序列)的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列(即，人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列)的轻链框架区序列，所述重链框架区和/或轻链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至相应的兔源残基的回复突变。46.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的vh包含：来源于重链胚系序列ighv3‑53*04的重链框架区fr1、fr2和fr3，以及来源于重链胚系序列ighj1*01的重链框架区fr4；和，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：来源于轻链胚系序列igkv1‑5*01的轻链框架区fr1、fr2和fr3，以及来源于轻链胚系序列igkj2*02的轻链框架区fr4。所述重链框架区和/或轻链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至相应的兔源残基的回复突变。47.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：48.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：49.(i)seqidnos：15‑18任一项所示的序列；50.(ii)与seqidnos：15‑18任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或51.(iii)与seqidnos：15‑18任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；52.和53.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：54.(iv)seqidno：19所示的序列；55.(v)与seqidno：19所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或56.(vi)与seqidno：19所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。57.在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。58.在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：59.(1)包含如seqidno:15所示的序列的vh和包含如seqidno:19所示的序列的vl；60.(2)包含如seqidno:16所示的序列的vh和包含如seqidno:19所示的序列的vl；61.(3)包含如seqidno:17所示的序列的vh和包含如seqidno:19所示的序列的vl；或62.(4)包含如seqidno:18所示的序列的vh和包含如seqidno:19所示的序列的vl。63.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以进一步包含来源于哺乳动物(例如，兔或人)免疫球蛋白的恒定区序列或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加。64.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链包含人免疫球蛋白的重链恒定区(ch)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和/或，65.本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链恒定区(cl)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。66.在一些实施方案中，所述重链恒定区(ch)的变体与其所源自的序列相比可以具有一个或多个氨基酸的保守置换。在此类实施方案中，所述重链恒定区(ch)的变体与其所源自的野生型序列相比可以具有相同或基本相同的效应子功能。67.在另一些实施方案中，所述重链恒定区(ch)的变体可以包含一个或多个氨基酸突变以改变本发明抗体的下列中的一个或更多个特性：fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能等。可以通过将抗体恒定区中的至少一个氨基酸残基替换为不同残基，产生功能改变，例如，改变抗体对效应子配体(如fcr或补体c1q)的亲和力，从而改变效应子功能(例如降低)。抗体的fc区介导几种重要的效应子功能，例如adcc、吞噬作用、cdc等。68.在某些实施方案中，所述重链恒定区是igg重链恒定区，例如igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。在某些实施方案中，所述重链恒定区是兔igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。在某些实施方案中，所述重链恒定区是人igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。69.在某些实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。在某些实施方案中，所述轻链恒定区是兔κ轻链恒定区。在某些实施方案中，所述轻链恒定区是人κ轻链恒定区。70.在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含seqidno:20所示的重链恒定区(ch)；和/或，seqidno:21所示的轻链恒定区(cl)。71.在某些实施方案中，所述抗原结合片段选自fab、fab’、(fab’)2、fv、二硫键连接的fv、scfv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdab)。72.在某些实施方案中，所述抗体为兔源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。73.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的1项、2项、3项、4项、5项、6项或全部7项：74.(1)特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的rbd；75.(2)以小于约100nm，例如小于约50nm、40nm、30nm、20nm、10nm或更低的kd结合sars‑cov‑2的s蛋白的rbd；优选地，所述kd通过表面等离子共振技术(例如biacore)测定；76.(3)以小于约100ng/ml，例如小于约50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml、15ng/ml或更小的ec50结合sars‑cov‑2的s蛋白的rbd；优选地，所述ec50可以通过间接elisa法测定；77.(4)阻断或抑制sars‑cov‑2对ace2受体的结合，和/或阻断或抑制sars‑cov‑2对细胞的感染；78.(5)不影响或基本上不影响sars‑cov‑1对ace2受体的结合；79.(6)在体外或受试者(例如人)体内中和sars‑cov‑2；80.(7)预防和/或治疗sars‑cov‑2感染或由sars‑cov‑2感染所导致的疾病(例如covid‑19)。81.在本文中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体或其抗原结合片段的上述生物学功能。82.抗体的制备83.本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或pcr扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的dna分子。将所得dna分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。84.本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见morimotoetal.,j.biochem.biophys.methods24:107‑117(1992)andbrennanetal.,science229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewedinhudson,curr.opin.immunol.11:548‑557(1999)；littleetal.,immunol.today,21:364‑370(2000))。比如，fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将fab’片段化学偶联形成f(ab’)2片段(carteretal.,bio/technology,10:163‑167(1992))。另外，fv、fab或f(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。85.因此，在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。86.在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含如上所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。87.在某些实施方案中，所述载体包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一核苷酸序列，和/或编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二核苷酸序列；其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的载体上。88.在某些实施方案中，所述载体包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链的第一核苷酸序列，和/或编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链的第二核苷酸序列；其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的载体上。89.在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如cho(例如cho‑k1、cho‑s、chodg44)。90.在另一个方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。91.药物组合物及治疗用途92.本发明的抗体或其抗原结合片段可用于体外或在受试者体内中和sars‑cov‑2，阻断或抑制sars‑cov‑2对细胞的感染，从而达到预防和/或治疗受试者的sars‑cov‑2感染或与sars‑cov‑2感染相关的疾病的目的。93.因此，在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。94.在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂，例如另外的抗病毒剂(例如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)。95.在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。96.在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。97.在另一个方面，本发明提供了用于中和sars‑cov‑2的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。所述方法可用于在体外或受试者(例如人)体内中和sars‑cov‑2。98.在某些实施方案中，所述方法用于中和样品中sars‑cov‑2的毒力。在某些实施方案中，所述方法包括：将包含sars‑cov‑2的样品与本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物接触。99.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。100.在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的sars‑cov‑2感染或与sars‑cov‑2病毒感染相关的疾病(例如covid‑19)的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物。101.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。102.在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：103.(1)在体外或受试者(例如人)体内中和sars‑cov‑2；和/或104.(2)用于预防和/或治疗受试者的sars‑cov‑2感染或与sars‑cov‑2感染相关的疾病(例如covid‑19)。105.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。106.本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。107.本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物通过静脉注射或推注给予。108.本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。109.在本文中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。110.在本文中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。111.缀合物112.本发明的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对sars‑cov‑2的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(peg)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。113.因此，在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测标记。114.在本文中，本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β‑半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3h、125i、35s、14c或32p)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(tritc)、藻红蛋白(pe)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物如三联吡啶钌)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。115.在某些实施方案中，所述可检测的标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，所述可检测的标记可以选自酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β‑半乳糖苷酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白，如fitc、tritc或pe)、放射性核素或生物素。116.在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。117.试剂盒及检测用途118.本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的rbd，从而可用于检测sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd，以及任选地根据上述检测结果来诊断受试者是否感染了sars‑cov‑2。119.因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的缀合物。120.在一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明的缀合物。121.在另一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不包含可检测的标记。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段的第二抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。122.在某些实施方案中，所述第二抗体对本发明的抗体或其抗原结合片段所包含的恒定区所来自的物种(例如兔或人)的抗体是特异的。123.在某些实施方案中，所述第二抗体是抗‑免疫球蛋白(例如人或兔的免疫球蛋白)抗体，例如抗igg抗体。在某些实施方案中，所述第二抗体是抗兔igg抗体或抗人igg抗体。124.在某些实施方案中，本发明的试剂盒可以进一步包含用于使相应可检测的标记被检测到的试剂。例如，当所述可检测的标记为酶时，所述试剂盒还可以包含相应酶的显色底物，例如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(opd)、四甲基联苯胺(tmb)、abts或鲁米诺类化合物，或用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p‑npp)或amppd。例如当所述可检测的标记为化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)时，所述试剂盒还可以包含用于化学发光的预激发液和/或激发液。125.在另一个方面，本发明提供了检测sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd、或被sars‑cov‑2感染的细胞在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段。126.在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。127.在一些实施方案中，所述方法包括使用本发明的缀合物。128.在另一些实施方案中，所述方法包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不包含可检测的标记。在某些实施方案中，所述方法还包括使用带有可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段。129.在某些实施方案中，所述第二抗体对本发明的抗体或其抗原结合片段所包含的恒定区所来自的物种(例如兔或人)的抗体是特异的。130.在某些实施方案中，所述第二抗体是抗‑免疫球蛋白(例如人或兔的免疫球蛋白)抗体，例如抗igg抗体。在某些实施方案中，所述第二抗体是抗兔igg抗体或抗人igg抗体。131.在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测抗原‑抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在sars‑cov‑2或被sars‑cov‑2感染的细胞。132.在某些实施方案中，所述方法可以用于诊断目的，例如可以根据sars‑cov‑2在样品中的存在或其水平来诊断受试者是否感染了sars‑cov‑2。在此类实施方案中，所述样品可以为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。133.在某些实施方案中，所述方法可以用于非诊断目的，例如所述样品并非来自受试者的样品，例如疫苗样品。134.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。135.在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd、或被sars‑cov‑2感染的细胞在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了sars‑cov‑2。136.在某些实施方案中，所述方法是免疫学测定，例如酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。137.在某些实施方案中，所述试剂盒通过如上所述的检测方法来检测sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd、或被sars‑cov‑2感染的细胞在样品中的存在或其水平，以及任选地根据所述检测结果诊断受试者是否感染了sars‑cov‑2。138.在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。139.术语定义140.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、核酸化学、免疫学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。141.如本文中所使用的，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，sars‑cov‑2)”，旧称为“新型冠状病毒”或“2019‑ncov”，属于其β冠状病毒属，为含包膜的单链正义rna病毒。sars‑cov‑2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如genbank：mn908947.3。sars‑cov‑2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(s)、整合膜蛋白(m)和膜蛋白(e)。sars‑cov‑2的受体与sars‑cov一样，均是通过s蛋白上的受体结合结构域(receptorbindingdomain,rbd)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ace2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。142.如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“covid‑19”是指，因sars‑cov‑2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。143.如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(lc)和一条重链(hc))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循kabat,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901‑917；chothia等人(1989)nature342:878‑883的定义。144.如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个cdr，命名为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991)、chothia编号系统(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901‑917；chothia等人(1989)nature342:878‑883)或imgt编号系统(lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55‑77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55‑77,2003)。145.在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr优选地通过kabat、chothia或imgt编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr优选地通过kabat编号系统确定。146.如本文中所使用的，术语“构架区”或“fr”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的cdr残基以外的那些氨基酸残基。147.术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。148.如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv、互补决定区(cdr)片段、scfv、双抗体(diabody)、单域抗体(singledomainantibody)、嵌合抗体、线性抗体(linearantibody)、纳米抗体(技术来自domantis)、、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于holliger等,2005；natbiotechnol,23:1126‑1136中。149.如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在n端到c端的方向上由重链可变区(vh)、重链恒定区ch1结构域、铰链区(hr)、重链恒定区ch2结构域、重链恒定区ch3结构域组成；并且，当所述全长抗体为ige同种型时，任选地还包括重链恒定区ch4结构域。优选地，“全长重链”是在n端到c端方向上由vh、ch1、hr、ch2和ch3组成的多肽链。“全长轻链”是在n端到c端方向上由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在cl和ch1之间的二硫键和两条全长重链的hr之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由vh和vl对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。150.如本文中所使用的，术语“fd”意指由vh和ch1结构域组成的抗体片段；术语“dab片段”意指由vh结构域组成的抗体片段(ward等人,nature341:544546(1989))；术语“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1结构域组成的抗体片段；术语“f(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段；术语“fab’片段”意指还原连接f(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的fd片段(由vh和ch1结构域组成)组成。151.如本文中所使用的，术语“fv”意指由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段。fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个cdr赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的cdr)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。152.如本文中所使用的，术语“fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。153.如本文中所使用的，术语“scfv”是指，包含vl和vh结构域的单个多肽链，其中所述vl和vh通过接头(linker)相连(参见，例如,bird等人,science242:423‑426(1988)；huston等人,proc.natl.acad.sci.usa85:5879‑5883(1988)；和pluckthun，thepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，roseburg和moore编，springer‑verlag，纽约，第269‑315页(1994))。此类scfv分子可具有一般结构：nh2‑vl‑接头‑vh‑cooh或nh2‑vh‑接头‑vl‑cooh。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接头，但也可使用其变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444‑6448)。可用于本发明的其他接头由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725‑731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94‑106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055‑3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41‑56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。在一些情况下，scfv的vh与vl之间还可以存在二硫键。在本发明的某些实施方案中，scfv可形成di‑scfv，其指的是两个或两个以上单个scfv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中，scfv可形成(scfv)2，其指的是两个或两个以上单个scfv并联而形成抗体。154.如本文中所使用的，术语“双抗体”意指，其vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,holligerp.等人,proc.natl.acad.sci.usa90:6444‑6448(1993)，和poljakr.j.等人,structure2:1121‑1123(1994))。155.如本文中所使用的，术语“单域抗体(single‑domainantibody,sdab)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。156.上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。157.可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。158.在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。159.如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(chimericantibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(u.s.p4,816,567tocabillyetal.；morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:68516855(1984))。在某些实施方案中，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人抗体)。160.如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分cdr区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非cdr区(例如，可变区fr和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。典型地，人源化抗体的至少一个或两个但通常所有三个(重和/或轻免疫球蛋白链的)受体cdr被供体cdr替换。提供cdr的免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，供体免疫球蛋白是非人源(例如兔)抗体，受体框架可以天然存在的人框架，或与其相比具有约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异sequence)”，由重链胚系基因所编码的氨基酸序列称为重链胚系序列，由轻链胚系基因所编码的氨基酸序列称为轻链胚系序列。胚系抗体基因或胚系抗体基因片段及其相应的胚系序列是本领域技术人员熟知的，并且可从专业数据库(例如，imgt、unswig、ncbi或vbase2)获得或查询。166.如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(kd)表示。在本发明中，术语“kd”是指特定抗体‑抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体‑抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定，例如使用表面等离子体共振术(spr)在biacore仪中测定。167.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。168.如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或人细胞等的动物细胞。169.如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443‑453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11‑17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444‑453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。170.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180‑1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879‑884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412‑417(1997)，其通过引用并入本文)。171.本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，immunology‑asynthesis(2ndedition,e.s.golubandd.r.gren,eds.,sinauerassociates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。172.如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween‑80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2‑苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，spga，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。173.如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，sars‑cov‑2感染)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。174.如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，所述受试者(例如人)患有sars‑cov‑2感染或与sars‑cov‑2感染相关的疾病(例如covid‑19)，或者，具有患有上述疾病的风险。175.如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如sars‑cov‑2感染)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如sars‑cov‑2感染)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。176.如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。177.发明的有益效果178.本发明的抗体能够特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的受体结合区(rbd)，中和sars‑cov‑2，阻断sars‑cov‑2与ace2受体的结合，从而阻断sars‑cov‑2对细胞的感染。因此，本发明的抗体具有用于预防和/或治疗sars‑cov‑2感染或由sars‑cov‑2感染所导致的疾病(例如covid‑19)的潜力。此外，本发明的抗体还能够用于特异性检测sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd，对sars‑cov‑2感染的诊断具有重要临床价值。179.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。附图说明180.图1显示了重组蛋白rbd‑mfc、rbd‑mgam和rbd‑his的sds‑page电泳图。181.图2显示了sars‑cov‑2恢复期病人血清对重组蛋白rbd‑mfc和rbd‑his结合活性的elisa检测结果。182.图3显示了兔抗血清中的rbd抗体滴度测定结果。183.图4显示了兔抗血清对rbd‑his结合活性的westernblot检测结果。184.图5显示了兔源单克隆抗体3f4对rbd‑mfc的结合活性的elisa检测结果。185.图6显示了兔源单克隆抗体3f4对于rbd‑his的亲和力测定(biacore)结果。186.图7显示了兔源单克隆抗体3f4对细胞上表达的sars‑cov‑2刺突蛋白s的结合活性检测结果。187.图8显示了兔源单克隆抗体3f4在sars‑cov2vsvpp假病毒感染模型中的中和活性测定结果。188.图9显示了兔源单克隆抗体3f4对sars‑cov‑2和sars‑cov‑1的交叉阻断能力测定结果。189.图10显示了3f4人源化抗体对rbd‑his的结合活性的elisa检测结果。190.图11显示了3f4人源化抗体在sars‑cov2vsvpp假病毒感染模型中的中和活性测定结果，其中r3f4为兔源单克隆抗体3f4。191.图12显示了3f4人源化抗体对sars‑cov‑2的阻断能力测定结果，其中r3f4为兔源单克隆抗体3f4。192.序列信息193.本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。194.表1：序列的描述195.196.197.具体实施方式198.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。199.除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons,inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。200.实施例1：抗sars‑cov‑2受体结合区rbd蛋白的兔源单克隆抗体的制备201.1.1sars‑cov‑2受体结合区rbd蛋白的制备及活性鉴定：202.sars‑cov‑2受体结合区rbd‑mfc购自北京义翘神州科技股份有限公司，sars‑cov‑2受体结合区rbd‑his蛋白的rbd基因从ncbi数据库获得(genbankid：mn908947.3)，在c端融合his标签。参考sars‑cov2‑2全基因序列(mn908947.3)将sars‑cov2‑2spike蛋白膜外区全长序列(对应病毒spike基因aa316‑aa550)氨基酸序列按人类偏好密码子进行优化获得其优化编码核酸序列。在rbd核酸序列的n端连接上信号肽编码序列，c端连接上绿色荧光蛋白mgamillus(简称mgam)的优化编码核酸序列，融合多肽的c端连接上便于亲和层析纯化的多聚组氨酸多肽(6×his或8×his)，最终获得rbd‑mgam蛋白。将sars‑cov2‑rbg的编码序列连接到适合真核表达的质粒载体，把构建好的重组质粒转染至expicho细胞(购自thermofisher公司)或其他cho细胞进行表达纯化。采用同样的序列构建并表达rbd‑his蛋白，即在rbd序列c端连接上多聚组氨酸多肽(6×his或8×his)。sds‑page电泳结果显示rbd‑mfc、rbd‑mgam和rbd‑his的纯度较高(图1)。通过elisa检测上述蛋白与sars‑cov‑2恢复期病人血清的反应活性，结果如图2所示，所获得的rbd‑mfc、rbd‑mgam和rbd‑his蛋白与sars‑cov‑2恢复期病人血清有反应活性。203.1.2新西兰兔：204.10周龄雌性新西兰兔采购自上海市松江区松联实验动物场。205.1.3实验兔的免疫：206.使用标准的体内免疫方式，详细方法参见edharlowetal.,“antibodiesalaboratorymanual”,coldspringharborlaboratory1988.简要过程如下：207.使用sars‑cov‑2受体结合区rbd‑mfc蛋白300μg与弗氏完全佐剂(cfa)等体积混合乳化成2ml，经颈部及背部多点注射实验兔。首次免疫后第8天，使用sars‑cov‑2受体结合区rbd‑mgam蛋白500μg与弗式非完全佐剂(ifa)等体积混合乳化成2ml，经颈部及背部多点注射实验兔。在首次免疫后第11天通过兔耳中央动脉采集全血，分离血清，进行rbd抗体滴度测定，结果显示血清效价为10^4(图3)；westernblot检测显示兔抗血清能够与rbd‑his抗原反应(图4)。208.1.4兔外周血单核细胞(pbmc)的制备：209.使用无血清rpmi1640培养基按1:1比例稀释兔全血，使用ficoll试剂进行密度梯度离心分离外周血单核细胞，加入兔全血1.5倍体积的ficoll溶液于离心管底层，再缓慢加入兔全血稀释液，800g，30min，4℃，进行缓慢升降速离心，离心完成后收集ficoll与rpmi1640培养基交界处的悬浮细胞即为pbmc，再第二次离心收集pbmc细胞，1500rpm，5min，4℃离心。210.1.5抗sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd的特异性b细胞筛选：211.用100μl无菌pbs溶液重悬分离获得的兔pbmc，按照3ml兔全血pbmc加入1μg生物素标记的rbd‑mfc蛋白的标准添加相应量的rbd蛋白，轻柔吹吸混匀，4℃孵育30min。1500rpm3min4℃离心，弃去上清保留细胞，使用pbs重悬细胞洗涤2～3次，每管加入100μl如下所示的染色体系。置于4℃避光孵育30min。[0212][0213]分选rbd特异性的记忆b细胞到每孔含有25μl裂解液的96孔板中，每孔一个细胞。完成后吸取含有单个细胞的20μl裂解液到pcr板中，进行反转录，随后进行巢氏pcr分别扩增抗体轻重链可变区序列。[0214]挑取重链和轻链配对的pcr产物，使用凝胶回收试剂盒回收，送测序，将测序结果在imgt数据库进行比对，判断得到的基因是否为抗体基因、基因是否完整、是否能够成功编码抗体，确定抗体基因(v区和j区)所属家族。对克隆载体进行酶切，重链表达质粒载体酶切位点为ecori/bamhi，轻链表达质粒载体酶切位点为nhei/sali。采用gibson装配方法将轻重链可变区基因构建到相应真核表达载体prvrch(seqidno:28)、prvrcl(seqidno:29)，其中，prvrch包含编码兔单克隆抗体重链恒定区的核酸序列，prvrcl包含编码兔单克隆抗体轻链恒定区的核酸序列。[0215]表达载体构建完成后，脂质体法瞬时转染hek293t细胞，进行抗sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd单克隆抗体的表达。转染前12小时，将10^4细胞接种到96孔细胞培养板中；a管：10μlopti‑mem中加入0.2μgigh质粒和0.2μgigk质粒；b管：10μlopti‑mem中加入0.4μl诺唯赞公司exfect2000transfectionreagent；将a、b管分别轻柔混匀，室温静置5min，再将稀释好的质粒滴加至稀释的转染试剂中，轻柔混匀，室温孵育10min；将质粒‑转染试剂复合物滴加至细胞中，置于细胞培养箱中培养；48h后，收集细胞上清，并离心，3000rpm5min4℃，取上清，弃去细胞碎片沉淀。通过间接elisa法(可参见实施例2)筛选与rbd具有特异反应性的阳性单克隆抗体。[0216]1.6抗sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd阳性单克隆抗体的序列测定[0217]通过上述方法获得1株sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd特异性的兔源单克隆抗体3f4。经测序，确定3f4的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示。还使用kabat编号系统(kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版，publichealthservice，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647‑669页)、以及imgt编号系统(http://www.imgt.org/imgt_vquest/analysis)，确定了cdr序列。[0218]表2：3f4的可变区序列[0219][0220]1.7真核表达抗体的纯化与制备[0221]进行3f4的大量表达，准备处于对数生长期的悬浮细胞293f，置于100rpm37℃5％co2细胞摇床进行培养至密度为1.5×106/ml，细胞活率>95％，取400ml细胞置于新的细胞培养瓶中为一个转染体系。a管：20ml悬浮细胞培养基中分别加入600μg轻重链质粒，振荡混匀；b管：20ml悬浮细胞培养基中加入1.2mgpei转染试剂，振荡混匀；将b管溶液加入a管中，振荡混匀并室温孵育15min，再将混合液体加入400ml的细胞培养体系中；置于100rpm37℃5％co2细胞摇床进行抗体表达6天；培养完成后，收集细胞上清，4℃4000rpm10min。[0222]用0.22μm滤器过滤上述细胞上清；打开akta仪器，先分别用a液(200mm十二水合磷酸氢二钠)和b液(100mm一水柠檬酸)冲洗a管道和b管道，装上proteina柱子；用a液以8ml/min的流速平衡proteina柱子15min以上，待仪器检测的uv值、ph值和电导率稳定后进行下一步；以6‑10ml/min流速上样，随后uv值会上升，该峰为穿透峰，并继续用a液洗柱，同时收集穿透峰样品待检测。待ph值不再变化后用b液以6‑10ml/min流速进液，随后ph值下降，uv值上升，该峰为洗脱峰，抗体主要存在于洗脱峰中，并收取洗脱峰样品待检测；用a液平衡柱子，再用20％乙醇充满管道和proteina柱子，取下柱子，4℃保存。对收集的穿透峰和洗脱峰样品进行sds‑page鉴定。纯化的单克隆抗体用20mmpbs缓冲液透析过夜，并采用紫外分光或者bca测取浓度分装至1.5ml管中，存放于‑20℃备用。[0223]实施例2：抗sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd兔源单克隆抗体与sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd反应活性[0224]2.1反应板的制备[0225]将sars‑cov2‑rbd(mfc标签)蛋白用ph9.6的50mmcb缓冲液(nahco3/na2co3缓冲液，终浓度为50mm，ph值为9.6)稀释，终浓度为2μg/ml；在96孔酶标板每孔中加入100μl的包被液，2～8℃包被16～24小时后再37℃包被2小时；用pbst洗涤液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的ph值为7.4的20mmna2hpo4/nah2po4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2‑8℃保存备用。[0226]2.2rbd兔源单克隆抗体3f4的elisa检测[0227]取实施例1中获得的单克隆抗体3f4，以20mmpbs缓冲液从10μg/ml为起始浓度开始3倍梯度稀释，共稀释7个梯度。取已包被sars‑cov2‑rbd蛋白的酶标板，每孔加入100μl已稀释的样品，置于37℃温箱反应60分钟。将酶标板用pbst洗液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤5遍，每孔加入100μlhrp标记的羊抗兔igg反应液，置于37℃温箱反应30分钟。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用pbst洗液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤5遍，每孔加入tmb显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μl，置于37℃温箱反应15分钟。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μl，并于酶标仪上检测各孔的od450/630值。[0228]结果如图5所示，兔源单克隆抗体3f4与rbd‑mfc的ec50数值为14.36ng/ml，具有良好的结合活性。[0229]实施例3：抗sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd兔源单克隆抗体与sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd亲和力常数检测[0230]使用biacore8k系统对单克隆抗体和抗原进行结合的动力学分析，所有步骤都在pbs缓冲液下进行，采用该公司配套的proteina芯片捕获稀释为5μg/ml的单克隆抗体，使用sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd‑his作为检测抗原，检测时抗原分别稀释为100nm、50nm、25nm、12.5nm、6.75nm五个梯度，检测按照下述程序进行：捕获(captue)60s，分析(analyte)300s，解离(dissociation)600s，再生(regeneration)60s。采用仪器配套数据采集和分析软件进行亲和力平衡解离常数的计算。[0231]结果如图6所示，3f4对于sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd‑his的平衡解离常数(kd)为8.79nm。[0232]实施例4：抗sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd兔源单克隆抗体用于检测细胞中表达的sars‑cov‑2‑s[0233](1)将mdck接种到10cm细胞培养板中，待细胞汇合率达到60～80％时进行转染。[0234](2)a管：2mlopti‑mem中加入30ug含sars‑cov‑2刺突蛋白s基因的哺乳动物表达质粒；[0235](3)b管：2mlopti‑mem中加入60μl诺唯赞公司exfect2000transfectionreagent；[0236](4)将a、b管分别轻柔混匀，室温静置5min，再将稀释好的质粒滴加至稀释的转染试剂中，轻柔混匀，室温孵育10min；[0237](5)将质粒‑转染试剂复合物滴加至细胞中，置于细胞培养箱中培养；[0238](6)转染36h后，用胰酶消化细胞，按照10^4细胞每孔的比例接种到96孔细胞培养板，置于细胞培养箱培养；[0239](7)接种至96孔细胞培养板12h后，弃去细胞上清，每孔中加入100μl20mmpbs洗涤一次，每孔加入100μl20mmpbs配制的4％多聚甲醛，避光固定细胞15min，每孔中加入100μl20mmpbs洗涤三次；[0240](8)每孔加入100μl超纯水配制的3‰tritonx‑100，通透处理细胞15min，每孔中加入100μl20mmpbs洗涤三次；[0241](9)单克隆抗体使用20mmpbs配制的2％bsa稀释至1μg/ml，按照每孔100μl加入96孔细胞培养板中，室温孵育30min，每孔中加入100μl20mmpbs洗涤三次；[0242](10)荧光二抗anti‑rabbitigg(h+l),cftm647antibodyproducedingoat使用20mmpbs配制的2％bsa稀释至1μg/ml，按照每孔100μl加入96孔细胞培养板中，室温孵育30min，每孔中加入100μl20mmpbs洗涤三次；[0243](11)细胞核染料dapi使用20mmpbs配制的2％bsa按照1:2000比例稀释，每孔加入50μl，室温孵育5min，每孔中加入100μl20mmpbs洗涤三次；[0244](12)将96孔细胞培养板置于荧光显微镜观察并拍摄结果。[0245]结果如图7所示，荧光在表达刺突蛋白s的mdck细胞的细胞膜和细胞质都有分布，以上结果表明3f4对细胞上表达的sars‑cov‑2刺突蛋白s有特异结合活性，对于阴性mdck细胞无非特异性反应。[0246]实施例5：抗sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd兔源单克隆抗体在sars‑cov2vsvpp假病毒感染模型中和能力分析[0247]sars‑cov2‑vsvpp假病毒中和方法参考文献方法进行(doi:https://doi.org/10.1101/2020.04.08.026948)。主要实验过程简述如下，为构建携带sars‑cov‑2spike蛋白的vsv假病毒，将sars‑cov‑2的spike基因(序列来源genbank：mn908947.3)的c末端截短18个氨基酸的sars‑cov‑2的spike基因克隆到真核表达载体pcag中，获得pcag‑ncovsde18。将质粒pcag‑ncovsde18转染到vero‑e6中。转染48小时后，将vsvdg‑egfp‑g(addgene，31842)病毒接种到表达sars‑cov‑2sde18截短蛋白的细胞中，孵育1小时。然后去除上清液中的vsvdg‑egfp‑g病毒，并加入抗vsv‑g大鼠血清以阻断残留的vsvdg‑egfp‑g的感染。子代病毒将携带sars‑cov‑2sde18截短蛋白，获得假病毒vsv‑sars‑cov2vsvpp。vsvdg‑egfp‑g感染后24小时后，收集细胞上清，然后离心并过滤(孔径为0.45‑μm，millipore，slhp033rb)以去除细胞碎片，并在‑80℃下保存备用。通过梯度稀释的上清感染bhk21‑hace2后gfp阳性细胞的数目来确定病毒滴度。通过piggybac转座子系统在bhk21细胞中整合hace2的基因。将含有hace2基因的转座子载体(sbisystembiosciences，pb514b‑2)和转座酶质粒共转染到bhk21细胞中，通过嘌呤霉素抗性和红色荧光进行筛选，获得稳定表达hace2的细胞bhk21‑hace2。[0248]将抗体3f4稀释到2ug/ml作为梯度1，3倍往下梯度稀释，共6个梯度，梯度稀释的抗体与稀释的sars‑cov2vsvpp病毒(moi＝0.05)混合，并在37℃孵育1h。所有样品和病毒均用10％fbs‑dmem稀释。将80μl混合物加入预先铺板的bhk21‑hace2细胞中。孵育12小时后，采用基于转盘共聚焦的高内涵成像系统(operaphenix或operettacls，购自perkinelmer公司)对感染后细胞进行荧光成像。完成后采用columbus图像管理分析软件对所获荧光图像进行定量分析检测绿色荧光阳性细胞数量。计算出与未处理的对照孔相比，抗体处理组的gfp阳性细胞数量减少(％)，计算抑制率。[0249]结果如图8所示，兔源单克隆抗体3f4的ic50为1.95ng/ml，具有较强中和效果。[0250]实施例6：抗sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd兔源单克隆抗体交叉阻断能力分析[0251]参考sars‑cov2‑2全基因序列(mn908947.3)将sars‑cov2‑2spike蛋白膜外区全长序列(对应病毒spike基因aa316‑aa550)氨基酸序列按人类偏好密码子进行优化获得其优化编码核酸序列。在rbd核酸序列的n端连接上信号肽编码序列，c端连接上绿色荧光蛋白mgamillus(简称mgam)的优化编码核酸序列，融合多肽的c端连接上便于亲和层析纯化的多聚组氨酸多肽(6×his或8×his)，最终获得rbd融合荧光蛋白探针rbd‑mgam(简称sars‑cov2‑rbg)。将sars‑cov2‑rbg的编码序列连接到适合真核表达的质粒载体，把构建好的重组质粒转染至expicho细胞(购自thermofisher公司)或其他cho细胞进行表达纯化。[0252]参考genebank上已经公布的病毒基因组序列sars‑cov‑1(aap13567.1)，将其rbd序列参考sars‑cov2‑rbg的方法构建rbd与mgamillus的融合荧光蛋白探针，简称为sars‑cov1‑rbg。将sars‑cov1‑rbg的编码序列连接到适合真核表达的质粒载体，把构建好的重组质粒转染至expicho细胞(购自thermofisher公司)或其他cho细胞进行表达纯化。[0253]在ace2基因(nm_021804.1)的c端融合表达红色荧光蛋白mruby3(中间以柔性氨基酸linker连接)，获得序列hace2‑mruby3(简称为hace2mrb3)，将该序列克隆至本室构建的piggybac(pb)转座子载体mihip‑cmvmie载体，获得mihip‑cmvmie‑hace2mrb3载体，该载体可在细胞内表达hace2mrb3蛋白。使用lipofectamine3000转染试剂(购自thermofisher公司)将mihip‑cmvmie‑hace2mrb3质粒与superpiggybactransposase表达质粒(购自systembiosciences公司)共同转染至293t细胞中(按照质量比4：1)，转染4小时后换液，继续培养24小时后将细胞传代至10cm细胞培养皿，并更换为含有2μg/ml嘌呤霉素(购自invivogen公司)加压筛选，每24小时更换含杀伤抗性培养液。含嘌呤霉素培养液6‑7天后，存活的细胞经过显微镜观察确认为mruby3红色荧光蛋白阳性，表明成功整合。稳转细胞株命名为293t‑ace2irb3。[0254]将293t‑ace2irb3细胞按照15000细胞/孔的密度铺板至黑色玻璃底，培养12‑24小时，待其贴壁备用。将sars‑cov2‑rbg探针稀释至合适浓度(20‑30nm)，与不同稀释倍数的抗体稀释液混合，使抗体终浓度以50nm为梯度1，2倍梯度稀释，共10个梯度。移去原细胞培养板中的50μl培养基，将制备好的混合液，50μl加入细胞培养板中，37℃孵育60分钟。不经洗涤直接使用operaphenix共聚焦型高内涵系统进行成像分析，成像荧光通道包括ex488/em510(绿色荧光蛋白检测通道，探针信号)、ex561/em592(红色荧光蛋白检测通道，ace2)、ex641/em670(近红外荧光蛋irfp670成像通道，细胞核)，使用20倍或者40倍水浸镜头至少拍摄25个视野(共聚焦模式)。完成后将数据上传至columbus图像管理分析软件，并使用该软件进行定量图像分析。分析参数包括：细胞核irfp670阳性细胞数(n，要求>1000个)、细胞膜红色荧光(ace2‑mruby3，用于质细胞孔间差异)信号强度(均值)、细胞质绿色荧光信号强度(均值、sd，反映被细胞结合并摄入的蛋白探针的量)。[0255]结果如图9所示，抗体3f4可阻断sars‑cov‑2受体结合区rbd蛋白对ace2受体的结合，但不阻断sars‑cov‑1受体结合区rbd蛋白对ace2受体的结合。[0256]实施例7：3f4人源化抗体的制备[0257]7.1单克隆兔源抗体3f4人源化设计[0258]根据combinedcdrs的方法(zhangyf,hom.humanizationofrabbitmonoclonalantibodiesviagraftingcombinedkabat/imgt/paratomecomplementarity‑determiningregions:rationaleandexamples.mabs.2017；9(3):419–429.doi:10.1080/19420862.2017.1289302)进行兔源单抗3f4的人源化设计。[0259]首先通过kabat方法(kabatea；wutt，perryhm，gottesmanks，coe11erk.sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，u.sdepartmentofhealthandhumanservice，phs，nih，bethesda，1991)和imgt方法确定兔源抗体3f4的互补决定区(complementarydeterminantregion，cdr)，具体序列如上文中表2所示。[0260]通过combinedcdrs的方法对imgt法和kabat法确定的cdr区进行组合，最终确定用于cdr移植的cdr区如表3所示。[0261]表3：兔源单克隆抗体3f4的combinedcdrs[0262][0263][0264]通过imgt搜索基因数据库，首先找出与兔源抗体3f4的fr区同源性最高的人胚系基因可变区序列。经同源性分析，确定ighv3‑53*04及igkv1‑5*01胚系基因序列分别作为人源化抗体的重链和轻链改造模板，同时由于胚系基因不包含改造部分所需的fr4，因此fr4部分需要单独比对，最终确定ighj1*01及igkj2*02胚系基因序列分别作为人源化抗体的重链和轻链fr4的改造模板。将兔抗3f4的重链和轻链cdr区分别移植到人源模板vh和vk的fr框架上，同时将兔抗与胚系基因的fr区进行序列比对，对差异氨基酸进行选择性的回复突变，最终设计4条人源化重链和1条人源化轻链，共4株人源化抗体，可变区序列如下表所示。[0265]表4：人源化抗体可变区序列[0266][0267]7.2抗体表达重组质粒构建[0268]采用重叠延伸pcr(splicingoverlappingextension‑pcr,soe‑pcr)方法获得3f4人源化抗体轻重链可变区基因。分别将重链和轻链可变区基因拆分为大小约80bp的寡核苷酸序列，片段之间重叠约20bp。通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，并用dna纯化回收试剂盒(tiangen,dp118‑02)回收纯化pcr产物。采用gibson装配方法，将重链可变区片段构建到含有重链恒定区(seqidno:20)编码序列的ptt5‑h载体(酶切位点agei/sali)，将轻链可变区片段构建到含有轻链恒定区(seqidno:21)编码序列的ptt5‑k载体(酶切位点agei/bsiwi)。将重组载体转化入dh5α感受态细胞(深圳康体)，在氨苄抗性的lb板上生长12h后挑取单克隆，送测序(上海生工)。利用无内毒素质粒大提试剂盒(tiangen,dp117)大量提取测序正确的重组质粒。[0269]7.3抗体的真核表达及纯化[0270]利用双质粒瞬时转染293f细胞表达3f4人源化抗体。准备活率高于95％的293f细胞，以4×106的密度取200ml接种于1l细胞培养瓶中。取各0.5mg轻重链质粒,混合后的1mg轻重链质粒与2mgpei混合，剧烈震荡8s后静置8min，将混合物加入200ml细胞中。4h后补充200mlfreestyle培养基，置于5％co2培养箱37℃表达7天。收集细胞上清，10000rpm离心30min。取上清并进行后续的纯化，纯化方法如实施例1.7所述。[0271]实施例8：3f4人源化抗体对sars‑cov‑2的elisa结合活性[0272]8.1反应板的制备[0273]将sars‑cov2‑rbd(his标签)蛋白用ph9.6的50mmcb缓冲液(nahco3/na2co3缓冲液，终浓度为50mm，ph值为9.6)稀释，终浓度为2μg/ml；在96孔酶标板每孔中加入100μl的包被液，2～8℃包被16～24小时后再37℃包被2小时；用pbst洗涤液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的ph值为7.4的20mmna2hpo4/nah2po4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2‑8℃保存备用。[0274]8.23f4人源化抗体的elisa检测[0275]取实施例8中获得的3f4人源化抗体，以20mmpbs缓冲液从10ug/ml为起始浓度开始梯度稀释，共稀释7个梯度。取已包被sars‑cov2‑rbd蛋白的酶标板，每孔加入100μl已稀释的样品，置于37℃温箱反应60分钟。将酶标板用pbst洗液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤5遍，每孔加入100μlhrp标记的羊抗人igg反应液，置于37℃温箱反应30分钟。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用pbst洗液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤5遍，每孔加入tmb显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μl，置于37℃温箱反应15分钟。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μl，并于酶标仪上检测各孔的od450/630值。3f4人源化抗体与sars‑cov2‑rbd的反应性判定：根据反应后的读值进行判定。结果如图10所示，3f4人源化抗体对rbd‑his具有良好的结合活性。[0276]实施例9：3f4人源化抗体在sars‑cov2vsvpp假病毒感染模型中的中和活性测定[0277]sars‑cov2‑vsvpp假病毒中和方法参考文献方法进行(doi:https://doi.org/10.1101/2020.04.08.026948)。主要实验过程简述如下，为构建携带sars‑cov‑2spike蛋白的vsv假病毒，将sars‑cov‑2的spike基因(序列来源genbank：mn908947.3)的c末端截短18个氨基酸的sars‑cov‑2的spike基因克隆到真核表达载体pcag中，获得pcag‑ncovsde18。将质粒pcag‑ncovsde18转染到vero‑e6中。转染48小时后，将vsvdg‑egfp‑g(addgene，318421)病毒接种到表达sars‑cov‑2sde18截短蛋白的细胞中，孵育1小时。然后去除上清液中的vsvdg‑egfp‑g病毒，并加入抗vsv‑g大鼠血清以阻断残留的vsvdg‑egfp‑g的感染。子代病毒将携带sars‑cov‑2sde18截短蛋白，获得假病毒vsv‑sars‑cov2vsvpp。vsvdg‑egfp‑g感染后24小时后，收集细胞上清，然后离心并过滤(孔径为0.45‑μm，millipore，slhp033rb)以去除细胞碎片，并在‑80℃下保存备用。通过梯度稀释的上清感染bhk21‑hace2后gfp阳性细胞的数目来确定病毒滴度。通过piggybac转座子系统在bhk21细胞中整合hace2的基因。将含有hace2基因的转座子载体(sbisystembiosciences，pb514b‑2)和转座酶质粒共转染到bhk21细胞中，通过嘌呤霉素抗性和红色荧光进行筛选，获得稳定表达hace2的细胞bhk21‑hace2。[0278]将3f4人源化抗体分别稀释到13.33nm作为梯度1，3倍往下梯度稀释，共10个梯度，梯度稀释的抗体与稀释的sars‑cov2vsvpp病毒(moi＝0.05)混合，并在37℃孵育1h。所有样品和病毒均用10％fbs‑dmem稀释。将80μl混合物加入预先铺板的bhk21‑hace2细胞中。孵育12小时后，采用基于转盘共聚焦的高内涵成像系统(operaphenix或operettacls，购自perkinelmer公司)对感染后细胞进行荧光成像。完成后采用columbus图像管理分析软件对所获荧光图像进行定量分析检测绿色荧光阳性细胞数量。计算出与未处理的对照孔相比，抗体处理组的gfp阳性细胞数量减少(％)，计算抑制率。利用非线性回归分析计算抗体的ic50。如图11所示，3f4人源化抗体能阻断假病毒对细胞的感染。[0279]实施例10：3f4人源化抗体阻断sars‑cov‑2s三聚体蛋白结合ace2能力分析[0280]参考sars‑cov2‑2全基因序列(mn908947.3)将sars‑cov2‑2spike蛋白膜外区全长序列(对应病毒spike基因aa16‑aa1207，简称为sars‑cov2‑secd)氨基酸序列按人类偏号密码子进行优化获得其优化编码核酸序列。在sars‑cov2‑secd核酸序列的n端连接上信号肽编码序列，c端连接上三聚化结构域编码序列(简称为tfd)，再进一步连接柔性(flexiblelinker)氨基酸连接肽编码序列和绿色荧光蛋白mgamillus(简称mgam)以及便于亲和层析纯化的多聚组氨酸多肽(6×his或8×his)，最终获得spike蛋白膜外区三聚体融合荧光蛋白探针strimer‑mgam(简称sars‑cov2‑stg)。[0281]在ace2基因(nm_021804.1)的c端融合表达红色荧光蛋白mruby3(中间以柔性氨基酸linker连接)，获得序列hace2‑mruby3(简称为hace2mrb3)，将该序列克隆至本室构建的piggybac(pb)转座子载体mihip‑cmvmie载体，获得mihip‑cmvmie‑hace2mrb3载体，该载体可在细胞内表达hace2mrb3蛋白。使用lipofectamine3000转染试剂(购自thermofisher公司)将mihip‑cmvmie‑hace2mrb3质粒与superpiggybactransposase表达质粒(购自systembiosciences公司)共同转染至293t细胞中(按照质量比4：1)，转染4小时后换液，继续培养24小时后将细胞传代至10cm细胞培养皿，并更换为含有2μg/ml嘌呤霉素(购自invivogen公司)加压筛选，每24小时更换含杀伤抗性培养液。含嘌呤霉素培养液6‑7天后，存活的细胞经过显微镜观察确认为mruby3红色荧光蛋白阳性，表明成功整合。稳转细胞株命名为293t‑ace2irb3。[0282]将293t‑ace2irb3细胞按照15000细胞/孔的密度铺板至黑色玻璃底，培养12‑24小时，待其贴壁备用。将sars‑cov2‑stg探针稀释至合适浓度(2‑4nm)，与不同稀释倍数的抗体稀释液混合，使抗体终浓度以50nm为梯度1，2倍梯度稀释，共10个梯度。移去原细胞培养板中的50μl培养基，将制备好的混合液，50μl加入细胞培养板中，37℃孵育60分钟。不经洗涤直接使用operaphenix共聚焦型高内涵系统进行成像分析，成像荧光通道包括ex488/em510(绿色荧光蛋白检测通道，探针信号)、ex561/em592(红色荧光蛋白检测通道，ace2)、ex641/em670(近红外荧光蛋irfp670成像通道，细胞核)，使用20倍或者40倍水浸镜头至少拍摄25个视野(共聚焦模式)。完成后将数据上传至columbus图像管理分析软件，并使用该软件进行定量图像分析。分析参数包括：细胞核irfp670阳性细胞数(n，要求>1000个)、细胞膜红色荧光(ace2‑mruby3，用于质细胞孔间差异)信号强度(均值)、细胞质绿色荧光信号强度(均值、sd，反映被细胞结合并摄入的蛋白探针的量)。不同测试孔的细胞质绿色荧光信号平均强度与阳性对照孔的差值/阳性对照孔荧光平均强度×100％(抑制率)。如图12所示，3f4人源化抗体可阻断sars‑cov‑2受体结合区rbd蛋白对ace2受体的结合。[0283]尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页12当前第1页12