一种鸡源假长双歧杆菌培养方法及其应用与流程

1.本发明涉及微生物菌株技术领域，具体涉及一种鸡源假长双歧杆菌培养方法及其应用。


背景技术：

2.假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)和婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)、动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)一样同属双歧杆菌属，目前国内关于假长双歧杆菌直接应用于食品、益生菌添加剂或者药物的研究很少，少数文献是关于假长双歧杆菌分离的报道。1998年，杨增岐等从健康鸡嗉囊和盲肠内容物成功分离出一株假长双歧杆菌，2011年，郭世奎等应用实时荧光定量pcr技术研究辣木复合肠内营养和普通肠内营养对艾滋病患者肠道双歧杆菌的影响时发现假长双歧杆菌、双双歧杆菌以及短双歧杆菌数量明显增多，揭示辣木复合肠内营养对艾滋病患者肠道微生态有显著改善作用，暗示假长双歧杆菌可能对肠道微生态稳定有一定作用。
3.国外已经有大量关于假长双歧杆菌作为益生菌应用于畜牧业、宠物的研究。2013年，波兰学者ewelina patyra等提到假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)是欧盟允许使用的饲料益生菌添加剂之一。1995年，abe等将假长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌作为益生菌应用于哺乳期仔猪，发现具有生长促进作用。2013年，esther ramalho afonso等发现商业化益生菌产品proba能显著提高奶猪平均体重并能清除鼠伤寒沙门氏菌，其成分包括假长双歧杆菌(1.5
×
109cfu/g)和瑞特乳杆菌(1.5
×
109cfu/g)。2004年，boileau等发明欧洲专利“canine probiotic bifidobacteria pseudolongum”，将假长双歧杆菌作为益生菌应用于宠物，具有调节肠道菌群，预防胃肠道疾病。2008年，thomas william等发明美国专利“canine probiotic bifidobacterium globosum”,将假长双歧杆菌亚种球双歧杆菌作为益生菌应用于犬，预防疾病促进健康。2009年，nadia vasquez等研究发现，假长双歧杆菌菌株patronus能通过降低肠道内蛋白氧化敏感性达到减少氧化性损伤的作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种能够降低切换频次，减少培养基损耗的鸡源假长双歧杆菌培养方法及其应用。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种鸡源假长双歧杆菌培养方法，其创新点在于：假长双歧杆菌是从健康鸡肠道中分离获得，经bm固体培养基37℃厌氧培养36～48h后，形成中到大菌落，圆形，呈白色、水样半透明或不透明状，边缘整齐，中央隆起，表面光滑的鸡源假长双歧杆菌。
6.进一步的，所述bm固体培养基配方为：酵母浸出粉10g/l，示蛋白胨5g/l，胰蛋白胨5g/l，葡萄糖10g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，微量盐40ml/l，琼脂粉20g/l，调ph至7.4。
7.进一步的，所述微量盐配方：氯化钙0.2g/l，硫酸镁0.48g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，碳酸氢钠10.0g/l，磷酸氢二钾1.0g/l，氯化钠2.0g/l。
8.本发明还提供了通过上述方法获得的鸡源假长双歧杆菌在促进spf鸡生长方面应用。
9.本发明有益效果为：
10.本发明培养方法简单有效，所获得的鸡源假长双歧杆菌细胞呈棒状、杆状或分叉为v型、y型；革兰氏染色反应为阳性，所培养的鸡源假长双歧杆菌能够对spf鸡有促生长作用，而且菌株安全无害，不会损伤肠粘膜。
附图说明
11.图1为实施例1假长双歧杆菌b456株革兰氏染色图。
具体实施方式
12.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
13.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
14.实施例1
15.一种鸡源假长双歧杆菌培养方法，其创新点在于：假长双歧杆菌是从健康鸡肠道中分离获得，经bm固体培养基37℃厌氧培养36～48h后，形成中到大菌落，圆形，呈白色、水样半透明或不透明状，边缘整齐，中央隆起，表面光滑的鸡源假长双歧杆菌；bm固体培养基配方为：酵母浸出粉10g/l，示蛋白胨5g/l，胰蛋白胨5g/l，葡萄糖10g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，微量盐40ml/l，琼脂粉20g/l，调ph至7.4；微量盐配方：氯化钙0.2g/l，硫酸镁0.48g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，碳酸氢钠10.0g/l，磷酸氢二钾1.0g/l，氯化钠2.0g/l。
16.根据上述方法所获得的鸡源假长双歧杆菌的菌株编号为b456，且革兰氏染色图见图1，且获得的菌株b456生化特性见表1：
17.表1：双歧杆菌糖发酵特性及生化鉴定结果
18.[0019][0020]
注：符号表示：-为阴性或不生长；+为阳性或生长
[0021]
抑菌特性见表2：
[0022]
表2:抑菌试验结果
[0023]
菌株编号鸡白痢沙门氏菌(mm)a大肠杆菌(mm)ab45623.70
±
0.3716.03
±
0.04
[0024]
注：a,抑菌圈直径为20mm以上，表示抑菌效果在75％～100％之间；15mm～20mm表示抑菌效果在50％～75％之间；10mm～14mm表示抑菌效果在25％～50％之间；10mm以下，表示抑菌效果在0％～25％之间；0mm表示无抑菌效果。
[0025]
耐酸耐胆盐特性见表3-4：
[0026]
表3：人工胃液处理结果
[0027][0028]
表4：人工肠液(含胆盐)处理结果
[0029][0030][0031]
基因特性：
[0032]
假长双歧杆菌b456株16s rdna pcr
[0033]
测序后碱基序列：
[0034]
aatgcgtagctacttagacggctccccccacaaaggttaggccaccgtcttcgggtgctgcccactttcatgacttgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgcattcaccgcggcgttgctgatccgcgattactagcgactccaccttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaccggttttcagggatccgccccacgtcaccgtgtcgcaccccgttgtaccggccattgtagcatgcgtgaagccctggacgtaaggggcatgatgatctgacgtcatccccaccttcctccgagttaaccccggcggtcccacgtgagttcccggcatgacccgctggcaacacgcggcgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccatgcaccacctgtgaaccggccccgaagggaacccgcgtctccgcgggcgtccggcacatgtcaagcccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccgcatgctccgccgcttgtgcgggcccccgtcaatttctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcgggatgcttaacgcgttagctccgacacaggacccggaaaaagggccccacatccagcatccaccgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtaacggcccagagacctgccttcgccattggtgttcttcccgatatctacacattccaccgttacaccgggaattccagtctcccctaccgcactcaagcccgcccgtacccggcgcggatccaccgttaagcgatggactttcacaccggacgcgacgaaccgcctacgagccctttacgcccaataaatccggataacgcttgcaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgcttattcgaacaatccactcaacacggccaaagaccgtgccttgcccttgaacaaaagcggtttacaacccgaaggcctccatcccgcacgcggcgtcgctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtatctcagtcccaatgtggccggtcgccctctcaggccggctacccgtcaacgccttggtaggccgttaccccaccaacaagctgataggacgcgaccccatcccatgccgcaaaaagcctttcccacactcgcatgcgctcatgtggaacatccggcattaccacccgtttccaggagctattccggtgcatggggcaggtcggtcacgcattactcacccgttcgccactctcaccccggcagcaagctgccagggatcccgttcgacttgcatggtaagcaccccgccaggtaaca。
[0035]
实施例2
[0036]
鸡源假长双歧杆菌的安全性以及在促进spf鸡生长方面应用：
[0037]
一、表1为鸡源假长双歧杆菌应用于spf鸡日增重分析表：
[0038][0039]
上表表明假长双歧杆菌对spf鸡有促生长作用。
[0040]
二、动物组织病理学分析
[0041]
假长双歧杆菌以单剂量和超剂量灌胃spf鸡，对肠粘膜厚度进行分析，结果发现对照组和实验组无病理学差异，表明该菌株对spf鸡无毒副作用，见表2：
[0042]
表2为鸡肠粘膜厚度(μm,n＝3)
[0043]
组别十二指肠空肠回肠单剂量组2048
±
732001
±
232117
±
52超剂量组2094
±
521945
±
422100
±
56对照组2083
±
351960
±
172098
±
62
[0044]
注：“*”表示差异显著(p《0.05),“**”表示差异极显著(p《0.01)
[0045]
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。