一种拟康氏木霉固态发酵的方法及其应用

本发明属于微生物发酵技术领域，具体是一种拟康氏木霉固态发酵的方法及其应用。

背景技术：

中国是白酒生产大国，酒文化及其历史可追溯几千年前，每年产生的白酒酒糟超过1亿吨。目前，国内在对酒糟合理利用方面的研究已取得了一些进展，酒糟资源化利用范围涵盖了生物、医药、化工、农业和食品等多个方面。但是，酿酒厂所产酒糟数量较大，用于饲料、生化产品、食品等方面的酒糟仅占总数量的一部分。另外，由于其加工处理手段不完善，酒糟往往偷运乱倒、露天堆积、随意填埋等现象随处可见，既浪费了资源，又对生态环境造成了污染。因此，酒糟的综合治理和再利用是白酒行业发展面临的关键问题。酒糟中含有氨基酸、有机酸等大量营养物质。另外，酒糟内含有多种生长类物质，对农作物生长具有刺激作用。因此，以酒糟为主要基质制作微生物菌肥具有广阔的应用前景，并且在实现酒糟有效利用的同时，还可代替传统化学肥料和农药发挥促生和提高作物抗性的目的，能够带来较好的社会效益和环境效益。

然而，目前有关利用白酒酒糟为主要基质制作木霉菌肥的例子很少，与其它以粮食等作为主要原料进行木霉的固态发酵相比，采用酒糟作为主要原料具有成本低，减少酒糟乱堆放造成的环境污染，在减少化学肥料用量的同时，促进植物生长，改善土壤环境质量，提升植物品质。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种拟康氏木霉固态发酵的方法及其应用，以解决拟康氏木霉固态发酵产孢量少、成本高、时间长等问题，并提高酒糟、麦麸等工农业废料的再利用率。同时，将本发明拟康氏木霉固态发酵物接种至黄豆，可促进其生长，改善黄豆生理和土壤环境质量。

本发明采用如下技术方案实现发明目的：

一种拟康氏木霉固态发酵的方法，该方法包括如下步骤：

(1)拟康氏木霉液体菌种的制备：在无菌条件下，将拟康氏木霉接种于pda平板培养基上培养，待菌丝长满整个培养皿，菌落表面产生绿色孢子后，用无菌水洗脱培养基上的孢子，无菌水稀释后，得拟康氏木霉液体菌种；

(2)固态发酵基质的制备：将酒糟、麦麸、营养液和水混合后，装于容器中，灭菌，得固态培养基；

(3)拟康氏木霉固态发酵：向固态培养基中接入拟康氏木霉液体菌种，光照培养，发酵结束后搅拌混匀，得拟康氏木霉固态发酵物。

前述的拟康氏木霉固态发酵的方法中，拟康氏木霉购买自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，其生物保藏号为：cgmcc3.3002。

前述的拟康氏木霉固态发酵的方法中，所述步骤(1)是：在无菌条件下，将拟康氏木霉接种于pda平板培养基上，27-29℃恒温培养5-7d后，待菌丝长满整个培养基，菌落表面产生绿色孢子后，用无菌水洗脱培养基上的孢子，用无菌水稀释孢子浓度为1.0×10⁶个/ml，得拟康氏木霉液体菌种。

优选的，所述步骤(1)是：在无菌条件下，将拟康氏木霉接种于pda平板培养基上，28℃恒温培养6d后，待菌丝长满整个培养基，菌落表面产生绿色孢子后，用无菌水洗脱培养基上的孢子，用无菌水稀释孢子浓度为1.0×10⁶个/ml，得拟康氏木霉液体菌种。

前述的拟康氏木霉固态发酵的方法中，所述步骤(2)是：将酒糟、麦麸、营养液和自来水混合后，装于250ml三角瓶中，经121℃高压灭菌20-30min，得固态发酵培养基。

优选的，所述步骤(2)是：将酒糟、麦麸、营养液和自来水混合后，装于250ml三角瓶中，经121℃高压灭菌25min，得固态发酵培养基。

前述的拟康氏木霉固态发酵的方法中，所述步骤(3)是：向固态发酵培养基中接入拟康氏木霉液体菌种1.5ml，28℃光照培养6-7d，发酵结束后搅拌混匀，得拟康氏木霉固态发酵物。

优选的，所述步骤(3)是：向固态发酵培养基中接入拟康氏木霉液体菌种1.5ml，28℃光照培养6d，发酵结束后搅拌混匀，得拟康氏木霉固态发酵物。

前述的拟康氏木霉固态发酵的方法中，所述营养液组成为：(nh4)2so41.4g/l、mgso40.3g/l、kh2po42.0g/l、cacl20.3g/l、feso45.0mg/l、mnso41.6mg/l、znso41.4mg/l和cocl22.0mg/l。

前述的拟康氏木霉固态发酵的方法中，所述酒糟为粉末玉米酒糟，其制作方法是将玉米酒糟经75-85℃烘干至恒重后，用粉碎机粉碎，得粉末玉米酒糟。

优选的，所述酒糟为粉末玉米酒糟，其制作方法是将玉米酒糟经80℃烘干至恒重后，用粉碎机粉碎，得粉末玉米酒糟。

前述的拟康氏木霉固态发酵的方法中，所述固态培养基中酒糟和麦麸的质量百分比为8-12％和14-18％；所述步骤(2)中，营养液和水的加入量是：每10g酒糟和麦麸的混合物中加入营养液1.8-2.2ml、加入自来水20-30ml

优选的，所述固态培养基中酒糟和麦麸的质量百分比为10.81％和16.21％；所述步骤(2)中，营养液和水的加入量是：每10g酒糟和麦麸的混合物中加入营养液2.0ml、加入水25ml。

拟康氏木霉固态发酵的方法的应用，是将拟康氏木霉固态发酵的方法制得的拟康氏木霉固态发酵物用于提高黄豆生长、改善黄豆生理和土壤环境质量。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明是通过利用酒糟、麦麸制备成的固态培养基进行木霉发酵，不仅发酵成本低，来源稳定，且适合拟康氏木霉的生长繁殖，可保证木霉固态发酵的大规模生产。

2、采用本发明的方法无需严格控制生产条件，方法简单易懂，适合大面积推广，便于中小规模的生产。

3、本发明利用酒糟、麦麸等廉价物品对拟康氏木霉进行固态发酵，对酒糟、麦麸等工业下角料实现了资源循环再利用，提升酒糟的利用价值，减少酒糟乱堆放对环境的污染。

4、本发明制得的拟康氏木霉固态发酵物可增加土壤氮元素含量，活化土壤磷等，且对作物生长具有促生作用的同时，改善作物的生理活性。

附图说明

图1为拟康氏木霉菌肥固态发酵的优化图；

图1中a为培养时间对拟康氏木霉固态发酵产孢的影响；b为酒糟与麦麸比例对拟康氏木霉固态发酵产孢的影响；c为培养温度对拟康氏木霉固态发酵产孢的影响；d为初始接菌量对拟康氏木霉固态发酵产孢的影响；e为光照强度对拟康氏木霉固态发酵产孢的影响；f为初始ph对拟康氏木霉固态发酵产孢的影响；g为初始加水量对拟康氏木霉固态发酵产孢的影响；h为不同营养成分对拟康氏木霉固态发酵产孢的影响；

图2为实施例1中拟康氏木霉固态发酵培养6d后的瓶装图；

图3为实施例1中发酵后收集的拟康氏木霉固态发酵物；

图4为实施例1中拟康氏木霉固态发酵物对黄豆促生效果的对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细描述。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有常规方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可得的配料或材料。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1，拟康氏木霉固态发酵方法，按以下步骤进行：

(1)拟康氏木霉液体菌种的制备：挑取pda斜面保存的拟康氏木霉菌种，接种至pda培养皿内，28℃恒温培养箱中培养5～7d后，待菌丝长满整个培养皿，菌落表面长满绿色孢子后，用无菌水洗脱培养基上的孢子，用无菌水稀释孢子浓度为1.0×10⁶个孢子/ml，获得拟康氏木霉液体菌种；

(2)拟康氏木霉固态培养基制作：按质量百分比称取4g的酒糟(10.81％)、6g的麦麸(16.21％)、2ml的营养液(5.41％)、25ml的自来水(67.57％)，搅拌均匀后作为固态培养基，用1％的hcl和1％的naoh调整ph为6，装于250ml三角瓶中，121℃灭菌25min后即得固态培养基；其中，营养液组成为：(nh4)2so41.4g/l，mgso40.3g/l，kh2po42.0g/l，cacl20.3g/l，feso45.0mg/l，mnso41.6mg/l，znso41.4mg/l，cocl22.0mg/l，蒸馏水定容至1000ml；

(3)拟康氏木霉固态发酵：向固态培养基中接入拟康氏木霉液体菌种1.5ml，25℃光照培养6d后，搅拌均匀，得拟康氏木霉固态发酵物。

本实施方式拟康氏木霉固态发酵物作为拟康氏木霉菌肥的应用是将拟康氏木霉菌肥用于提高黄豆生长和改善黄豆生理和土壤环境质量。下面结合试验说明本发明的拟康氏木霉固态发酵物在黄豆上的应用效果。

(1)试验地点：贵州省贵州大学林学院育苗温室。

(2)参与试验的黄豆种子购买自贵州省贵阳市花溪区农贸市场。

(3)试验方法：5月中旬采集马尾松林下土壤(采自贵州大学校园马尾松林下)，经121℃高温高压灭菌2h后备用。将实施方式一中获得的拟康氏木霉固态发酵物与马尾松林下土混合装于育苗盆(高12.5cm，上口径14.5cm，下口径10.2cm)后，每育苗盆播种5粒黄豆种子，拟康氏木霉固态发酵物的加入量为1×10³个孢子/g土壤(jf)。同时开展以添加等量木霉液体菌种的土壤播种黄豆的处理(jy)。以添加等量灭菌的固态培养基的土壤播种黄豆种子的处理作为对照(ck)。以上每个处理25盆，于温室内常规管理60d后进行生长、生理和土壤相关指标的测定。

(4)结果：由表1可知，jf处理对黄豆高度、鲜重、干重、根长、叶面积、根吸收面积均高于jy处理和ck处理，且jf处理与ck处理间达到差异显著水平(p<0.05)。

表1-拟康氏木霉固态发酵物对黄豆生长的影响

由表2可知，拟康氏木霉固态发酵物对黄豆pod活性、cat活性、sod活性、叶绿素含量均有促进作用，且呈现jf>jy>ck的趋势。

表2-拟康氏木霉菌肥对闽楠幼苗生理的影响

由表3可知，黄豆根际土壤的有效磷、速效钾、水解氮几个指标均呈现jf处理最高，jy处理次之，而ck处理最低的现象。且以上指标中jf处理与ck处理相比差异均显著，表明jf物可以提高黄豆土壤的养分情况，对土壤肥力的提升具有积极作用。而对黄豆根际土酶活性的影响显示jy和jf的添加对黄豆根际土脲酶、过氧化氢酶、磷酸酶没有明显影响，三个处理间差异均不显著。而jy和jf的添加对黄豆土壤蔗糖酶具有明显提高，其中jf处理黄豆的土壤蔗糖酶提高最为明显，jf处理土壤蔗糖酶活性分别是jy处理和ck处理蔗糖酶活性的21.90倍和5.47倍。

表3-拟康氏木霉固态发酵物对黄豆根际土壤养分和酶活性的影响

实施例2，一种拟康氏木霉固态发酵的方法，该方法步骤为：

(1)拟康氏木霉液体菌种的制备：在无菌条件下，将拟康氏木霉接种于pda平板培养基上，27℃恒温培养5d后，待菌丝长满整个培养皿，菌落表面产生绿色孢子后，用无菌水洗脱培养基上的孢子，并稀释孢子浓度为1.0×10⁶个/ml。

(2)固态发酵培养基的制备：将酒糟、麦麸、营养液和自来水混合后，分装于250ml三角瓶中，经121℃高压灭菌20min，得固态发酵基质；营养液组成为：(nh4)2so41.4g/l、mgso40.3g/l、kh2po42.0g/l、cacl20.3g/l、feso45.0mg/l、mnso41.6mg/l、znso41.4mg/l和cocl22.0mg/l；所述酒糟为粉末玉米酒糟，粉末玉米酒糟是将玉米酒糟经75-85℃烘干至恒重后，用粉碎机粉碎，得粉末玉米酒糟；固态培养基中酒糟和麦麸的质量百分比为10.81％和16.21％；所述步骤(2)中，营养液和水的加入量是：每10g酒糟和麦麸的混合物中加入营养液2.0ml、加入水25ml；

(3)拟康氏木霉固态发酵：向固态发酵培养基中接入拟康氏木霉液体菌种1.5ml，25℃光照培养5d，发酵结束后搅拌混匀，得拟康氏木霉固态发酵物。

实施例3，一种拟康氏木霉固态发酵的方法，该方法步骤为：

(1)拟康氏木霉液体菌种的制备：在无菌条件下，将拟康氏木霉接种于pda平板培养基上，28℃恒温培养7d后，待菌丝长满整个培养皿，菌落表面产生绿色孢子后，用无菌水洗脱培养基上的孢子，并稀释孢子浓度为1.0×10⁶个/ml。

(2)固态发酵基质的制备：将酒糟、麦麸、营养液和自来水混合后，分装于250ml锥形瓶中，经121℃高压灭菌30min，得固态发酵基质；营养液组成为：(nh4)2so41.4g/l、mgso40.3g/l、kh2po42.0g/l、cacl20.3g/l、feso45.0mg/l、mnso41.6mg/l、znso41.4mg/l和cocl22.0mg/l；所述酒糟为粉末玉米酒糟，粉末玉米酒糟是将玉米酒糟经75-85℃烘干至恒重后，用粉碎机粉碎，得粉末玉米酒糟；固态培养基中酒糟和麦麸的质量百分比为10.81％和16.21％；所述步骤(2)中，营养液和水的加入量是：每10g酒糟和麦麸的混合物中加入营养液2.0ml、加入水25ml；

(3)拟康氏木霉固态发酵：向固态发酵基质中接入拟康氏木霉液体菌种1.5ml，27℃光照培养6d，发酵结束后搅拌混匀，得拟康氏木霉固态发酵物。

实施例4，一种拟康氏木霉固态发酵的方法，该方法步骤为：

(1)拟康氏木霉液体菌种的制备：在无菌条件下，将拟康氏木霉接种于pda平板培养基上，28℃恒温培养6d后，待菌丝长满整个培养皿，菌落表面产生绿色孢子后，用无菌水洗脱培养基上的孢子，并用无菌水稀释使孢子浓度为1.0×10⁶个/ml。

(2)固态发酵基质的制备：将酒糟、麦麸、营养液和自来水混合后，分装于250ml锥形瓶中，经121℃高压灭菌35min，得固态发酵基质；营养液组成为：(nh4)2so41.4g/l、mgso40.3g/l、kh2po42.0g/l、cacl20.3g/l、feso45.0mg/l、mnso41.6mg/l、znso41.4mg/l和cocl22.0mg/l；所述酒糟为粉末玉米酒糟，粉末玉米酒糟是将玉米酒糟经80℃烘干至恒重后，用粉碎机粉碎，得粉末玉米酒糟；固态培养基中酒糟和麦麸的质量百分比为10.81％和16.21％；所述步骤(2)中，营养液和水的加入量是：每10g酒糟和麦麸的混合物中加入营养液2.0ml、加入水25ml；

(3)拟康氏木霉固态发酵：向固态发酵基质中接入拟康氏木霉液体菌种1.5ml，25℃光照培养6d，发酵结束后搅拌混匀，得拟康氏木霉固态发酵物。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。