一种胶原蛋白基葡萄糖荧光敏感膜的制备方法

本发明属于荧光生物传感器及制备技术领域，特别是涉及一种胶原蛋白基葡萄糖荧光敏感膜的制备方法。

背景技术：

糖尿病、高血压、高脂血等非传染慢性疾病是人类主要面临的健康威胁，特别是由胰岛素分泌缺陷、胰岛素作用受损导致的糖尿病，其对人体的危害度仅次于癌症。糖尿病患者临床症状表现为持续高血糖，这种状态将对眼睛、肾脏、心脏、血管和神经系统产生慢性损害，导致心脑血管疾病、肾功能衰竭、神经病变、酮症酸中毒等并发症出现，患者将面临双目失明、残废截肢以及死亡的风险。由于糖尿病的发病机理尚不明确，胰岛细胞功能无法恢复正常，因此糖尿病是不可治愈的。将血糖浓度长期维持在正常水平是提高糖尿病患者生存率的最佳手段，全球每年有数以百万计的人由于没有良好地控制血糖浓度而丧生，连续且准确的个体和临床评估至关重要。

基于电化学的家用型血糖仪由于其高灵敏度、低检测限、微采血量、快速响应等优点被广泛地使用。然而糖尿病患者一天需要检测5-8次血糖浓度，频繁地刺破手指不仅会导致组织损伤，还存在感染风险。每天繁琐的检测次数和生理上的物理疼痛感使患者产生抵触心理，大大降低了患者的监测主动性。此外，该仪器属于点检测，无法进行连续血糖浓度检测，也无法预测高血糖和低血糖的发生，不利于血糖的长期监测。

据众多研究所报道，汗液、泪液、唾液以及间质液等体液中均含有葡萄糖分子且与血液中的葡萄糖浓度具有正相关的关系。检测汗液中葡萄糖浓度的可穿戴传感器是血糖监测领域的研究热点与发展方向，而生物相容性好、生物毒性低的生物材料是制作可穿戴传感器的最佳选择。此外，光学检测技术不仅可解决电化学信号漂移、组织损伤、生物刺激的问题，还可兼具高选择性、高灵敏度、长期稳定等优点。

技术实现要素：

本发明的目的是提出一种胶原蛋白基葡萄糖荧光敏感膜的制备方法。胶原蛋白是一种三螺旋纤维结构的生物基底，具有良好的相容性和降解性，可沉积荧光染料，其表面的羧基、羟基、氨基等丰富的官能团，能够将酶有效地交联固定在胶原蛋白上，同时保持酶的活性。此外，胶原蛋白可从家畜残留废物中提取获得并制成可贴皮肤的穿戴物，因此本发明在生物体血糖监测领域具有良好的应用前景与发展潜力。

本发明涉及一种基于酶固定化技术的胶原蛋白基葡萄糖荧光敏感膜的制备方法，其制备过程包括以下步骤：

s1：配置有机染料罗丹明6g溶液，将染料分子沉积在小片胶原蛋白基底材料上，得到胶原蛋白基荧光膜；

s2：配置戊二醛交联剂，将胶原蛋白基荧光膜浸入交联剂中以活化膜表面的基团；

s3：配置葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶的混合酶溶液，并多次以滴加的形式交联在已活化的荧光膜表面；

进一步地，步骤s1中，先在烧杯中配置一定浓度的罗丹明6g溶液，将小片胶原蛋白基底材料置于烧杯中一段时间后取出，并用去离子水冲洗干净。

进一步地，罗丹明6g溶液的浓度为0.05～0.20mg/ml，胶原蛋白基底材料的尺寸约为5mm*5mm～15mm*15mm，染料分子沉积时间为10～90分钟。

进一步地，步骤s2中，所用交联剂戊二醛的质量百分比为0.1％～5％，活化时间为12～48小时。

进一步地，步骤s3中，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶每毫升的酶活量为400～2000u，每次均用移液器取20～200μl的混合酶溶液，滴加至已活化的荧光膜表面。

进一步地，每隔4～8小时取一次酶溶液，32～64小时后得到所需的敏感膜。

优选地，选用有机溶液乙二醇作为所述罗丹明6g溶液的溶剂。

优选地，使用磷酸盐缓冲液作为所示混合酶溶液的溶剂。

优选地，所述交联过程在4℃冰箱中进行，所述混合酶溶液、酶固定化的荧光膜均保存在4℃冰箱中。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明首先通过将有机染料罗丹明6g沉积在胶原蛋白基底材料上，再将葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶交联到材料上，具有原料成本低，制备方法简单，生物毒性低，生物相容性好等特点，有望应用于可穿戴葡萄糖生物传感器领域；

(2)本发明工艺设备简单，制备工序少，制备成本低，制备过程安全可靠，这对于推广应用来说尤其重要。

(3)本发明可以按照需求制备各种不同形状，不同尺寸的敏感膜，可根据实际应用情况弹性调节。

(4)本发明利用有机胶原蛋白作为基底材料替代了目前常用的无机基底，不仅有效增强了染料沉积效果，提高了固定化酶的负载量，同时还循环利用了家畜残留废物，保护了环境。

附图说明

图1为本发明的制备步骤示意图。

图2为胶原蛋白基底材料的扫描电子显微表面形貌。在图2中，标尺为10μm。

图3为本发明实施例1所得膜的扫描电子显微表面形貌。在图3中，标尺为10μm。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

配置酶活量分别为800u/ml和1600u/ml的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混合酶溶液，置于4℃冰箱中保存；

将胶原蛋白基裁剪成10mm*10mm的小片后浸入到浓度为0.05mg/ml的罗丹明6g溶液中，浸泡80分钟后取出，用去离子水将荧光膜表面残留的罗丹明6g溶液冲洗干净，室温下烘干待用；

将荧光膜浸入到质量百分比为1％的戊二醛溶液中，浸泡12小时后取出；

将活化后的荧光膜置于干净的玻片表面，使用移液器吸取150μl的混合酶溶液，滴加至荧光膜的表面，交联5小时后再次滴加150μl的混合酶溶液，整个交联过程重复10次。

实施例2

配置酶活量分别为1000u/ml和2000u/ml的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混合酶溶液，置于4℃冰箱中保存；

将胶原蛋白基裁剪成12mm*12mm的小片后浸入到浓度为0.08mg/ml的罗丹明6g溶液中，浸泡70分钟后取出，用去离子水将荧光膜表面残留的罗丹明6g溶液冲洗干净，室温下烘干待用；

将荧光膜浸入到质量百分比为0.5％的戊二醛溶液中，浸泡21小时后取出；

将活化后的荧光膜置于干净的玻片表面，使用移液器吸取120μl的混合酶溶液，滴加至荧光膜的表面，交联6小时后再次滴加120μl的混合酶溶液，整个交联过程重复8次。

实施例3

配置酶活量分别为1200u/ml和2400u/ml的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混合酶溶液，置于4℃冰箱中保存；

将胶原蛋白基裁剪成13mm*13mm的小片后浸入到浓度为0.09mg/ml的罗丹明6g溶液中，浸泡60分钟后取出，用去离子水将荧光膜表面残留的罗丹明6g溶液冲洗干净，室温下烘干待用；

将荧光膜浸入到质量百分比为0.2％的戊二醛溶液中，浸泡24小时后取出；

将活化后的荧光膜置于干净的玻片表面，使用移液器吸取100μl的混合酶溶液，滴加至荧光膜的表面，交联8小时后再次滴加100μl的混合酶溶液，整个交联过程重复6次。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。