一种载体系统、制备猪成纤维细胞和基因编辑猪的方法

1.本发明涉及基因编辑领域，具体涉及一种载体系统、制备猪成纤维细胞和 基因编辑猪的方法。


背景技术：

2.猪生殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs) 是由猪生殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，prrsv)引起的以猪厌食、发热，妊娠母猪早产、晚期流产、死胎、弱胎 和木乃伊胎等繁殖障碍及仔猪和生长猪的呼吸系统疾病和高度死亡性为主要特 征的一种高度接触性传染病。因该病在临床上表现为耳部皮肤紫绀，所以又被 称为“蓝耳病”。
3.prrsv在体内主要感染分化良好的猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolarmacrophages，pam)。prrsv侵染靶细胞的先决条件是与宿主细胞吸附，而宿 主细胞表面的受体是完成这种吸附过程必不可少的。研究发现，硫酸乙酰肝素 (heparin sulphate,hs)、唾液酸粘附素(sialoadhesin,sn)和cd163(cluster ofdifferentiation 163)分子是pam上存在的能与prrsv结合的三个重要受体分子。 其中，cd163是一种富含半胱氨酸的清道夫受体，是典型的ⅰ型糖基化蛋白， 也是一种巨噬细胞分化的抗原，分子大小是130kd，固又被称为m130蛋白。 cd163起初是作为巨噬细胞和单核细胞的特异性鉴别蛋白质被认识的，在肺、 脾脏、肝脏、淋巴集结和胸腺组织的巨噬细胞中都有表达。有研究表明，在prrsv 非易感细胞系(如bhk
‑
21和pk
‑
15)中转染表达cd163分子可以使这些细胞系感 染prrsv并在细胞内产生子代病毒粒子，抗人cd163的抗体可以阻断prrsv 的感染，表明cd163是该病毒的必需受体。cd163蛋白结构域srcr5是病毒 感染细胞所必需的，而氨基端的4个srcr和胞质尾部是非必需的，其中srcr5 结构域正是由cd163第7外显子所编码。因此，研究cd163基因修饰猪可以为 cd163受体是否是prrsv感染过程中的重要角色提供必要证据。
4.本发明的另一方面涉及到猪的肌肉产量。肌肉的生长受到多种因素的调控， 其中肌生成抑制素起着主要的负调控作用。肌生成抑制素(myostatin，mstn) 或生长分化因子
‑
8(gdf
‑
8)，属于转化生长因子
‑
β(tgf
‑
β)超家族，是肌肉 的主要负调控因子。敲除肌生成抑制素基因的小鼠肌纤维发生广泛性的增生和 肥大，骨骼肌量显著增加，平均体重超过正常小鼠的261％，但不存在其他表型 差异。而且肌生成抑制素基因敲除小鼠肌量增加的表型可终生维持，年老的肌 生成抑制素基因敲除鼠比对照鼠肌肉量与肌力都增加。
5.在养猪业中，产肉率提升和抗病性能提升都是产业的重要需求，这些性状 也是传统选择性育种的难点之一。本发明采用基因工程改造技术对种猪相关性 状的对应基因位点进行定向修饰，建立一种快速简易的多基因同时编辑方案， 一次性地赋予动物多方面的表型，为建立优势种猪育种材料提供便捷方案，对 养殖业具有积极推动作用。
6.基于此，本发明建立一种可以快速、准确、有效地同时敲除猪cd163基因 和mstn基因的方法，获取敲除猪cd163基因和mstn基因的猪成纤维细胞 或猪在研究提升猪蓝耳病抗性、提高猪的瘦肉率以及猪的新品种培育具有重要 的意义。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是：提供一种可以快速、准确、有效地同时敲 除猪cd163基因和mstn基因的载体系统、制备同时敲除猪cd163基因和 mstn基因的猪成纤维细胞的方法和基因编辑猪的方法。
8.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种用于同时敲 除cd163基因和mstn基因的载体系统，所述载体系统包括cd163基因敲除 载体和mstn基因敲除载体，其中：
9.所述cd163基因敲除载体包括载体骨架以及连接到该载体骨架上的第一 dna片段，所述第一dna片段的核苷酸序列如seq id no：1所示；
10.所述mstn基因敲除载体包括载体骨架以及连接到该载体骨架上的第二 dna片段，所述第二dna片段的核苷酸序列如seq id no：2所示；
11.所述cd163基因敲除载体与所述mstn基因敲除载体中的载体骨架均为 crispr/cas9。
12.优选的，上述用于同时敲除cd163基因和mstn基因的载体系统中，所述 crispr/cas9为px330。
13.本发明提供的另一技术方案为：提供一种制备同时敲除cd163基因和 mstn基因的猪成纤维细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
14.(1)构建如上述的用于同时敲除cd163基因和mstn基因的载体系统；
15.(2)将载体系统转入猪成纤维细胞中，通过筛选和鉴定获得纯合敲除 cd163基因和mstn基因的单克隆细胞。
16.优选的，上述制备同时敲除cd163基因和mstn基因的猪成纤维细胞的方 法中，所述猪成纤维细胞为猪胎儿成纤维细胞。
17.优选的，上述制备同时敲除cd163基因和mstn基因的猪成纤维细胞的方 法中，所述步骤(1)具体为：
18.将互补的寡核苷酸单链退火形成双链，与经过酶切的载体骨架连接，筛选 获得阳性克隆即得cd163基因敲除载体，所述互补的寡核苷酸单链的序列如 seq id no：3
‑
4所示；
19.将互补的寡核苷酸单链退火形成双链，与经过酶切的载体骨架连接，筛选 获得阳性克隆即得mstn基因敲除载体，所述互补的寡核苷酸单链的序列如 seq idno：5
‑
6所示；
20.得到包括cd163基因敲除载体和mstn基因敲除载体的载体系统。
21.优选的，上述制备同时敲除cd163基因和mstn基因的猪成纤维细胞的方 法中，所述步骤(2)具体为：将步骤(1)所得cd163基因敲除载体和mstn 基因敲除载体通过电转染的方式转入猪成纤维细胞，通过有限稀释法筛选得单 克隆细胞，并鉴定所述单克隆细胞是否为cd163基因和mstn基因纯合敲除的 阳性单克隆细胞，得到纯合敲除cd163基因和mstn基因的单克隆细胞。
22.优选的，上述制备同时敲除cd163基因和mstn基因的猪成纤维细胞的方 法中，所述步骤(2)中的鉴定具体为：提取纯合敲除cd163基因和mstn基 因的单克隆细胞的基因组dna，分别使用如seqidno：7
‑
8和seqidno：9
‑
10 所示引物进行pcr扩增，并对扩增产物进行测序，根据测序结果判定所述单克 隆细胞是否为cd163基因和mstn基因纯合敲除的阳性单克隆细胞。
23.优选的，上述制备同时敲除cd163基因和mstn基因的猪成纤维细胞的方 法中，所述步骤(2)的鉴定中，使用seqidno：7
‑
8为引物的pcr扩增的退 火温度为57～59℃，循环数为32～38；使用seq id no：9
‑
10为引物的pcr扩 增的退火温度为60～62℃，循环数为32～36。进一步的，所述步骤(2)的鉴定 中，使用seqidno：7
‑
8为引物的pcr扩增的退火温度为58℃，循环数为34； 使用seq id no：9
‑
10为引物的pcr扩增的退火温度为60℃，循环数为34。
24.本发明提供的又一技术方案为：提供一种上述方法制备而成的同时敲除 cd163基因和mstn基因的猪成纤维细胞。
25.本发明提供的又一技术方案为：提供一种基因编辑猪的方法，包括如下步 骤：
26.将权利要求上述猪成纤维细胞作为核移植供体细胞，将其细胞核移植入去 核的卵母细胞，制备重组克隆胚胎并移植入母体内经妊娠获得同时敲除cd163 基因和mstn基因的基因编辑猪。
27.本发明的有益效果在于：本发明提供了同时敲除猪cd163基因和mstn基 因的载体系统、制备同时敲除猪cd163基因和mstn基因的猪成纤维细胞和基 因编辑猪的方法。传统的基因敲除系统主要以同源重组系统为基础，对于猪等 需基于成纤维细胞进行基因操作的物种来讲其效率太低，难以有效对目的基因 位点进行编辑操作，需要通过复杂的操作以及花费大量精力才能将靶基因敲除。 本发明载体系统和方法具有降低基因操作难度、提高敲除效率，在短时间内快 速将cd163基因和mstn基因敲除的优点。本发明采用了双质粒共转染的方案， 再以低密度单克隆培养，获得双基因同时编辑的单细胞克隆，该方案无需药物 筛选，不带有外源筛选标记，具有较为简便的细胞筛选流程。同时双基因敲除 的效率在可接受的范围，可以一次性获得双基因缺失的细胞系，大大缩短了双/ 多基因编辑动物的制备流程。在性状上，该细胞即缺失cd163(具有prrsv抗 性)又缺失mstn(增加肌肉产量)，同时具有两种优良经济性状，其生产的克隆 猪是优良的种猪育种材料，如产业化应用可带来显著提升的经济效益。
附图说明
28.图1为本发明施例1的px330载体骨架图；
29.图2为本发明施例2的基因打靶系统的效果分析图；
30.图3为本发明施例2的筛选获得双基因敲除的细胞照片；
31.图4为本发明施例2的mstn和cd163靶位点pcr扩增示意图；
32.图5为本发明施例2的经鉴定部分细胞克隆的cd163或mstn敲除基因型 示意图；
33.图6为本发明施例2的dko14细胞在cd163编辑靶点处pcr示意图；
34.图7为本发明施例2的dko14细胞在mstn编辑靶点处pcr示意图。
具体实施方式
35.为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并 配合附图予以说明。
36.下述实施例中的猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast，pef)按照 如下方法制备：将大白猪35日龄胚胎，去除胎儿的头、尾、四肢、内脏和骨头， 并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿5min保证充分剪碎，将剪碎的 胎儿组织用剪头的大号枪
头吸取到15ml离心管中，加入5ml完全培养基，离 心沉降细胞和组织块，去除上清培养液后，在下层细胞组织块中加入含15％胎 牛血清和2％双抗的dmem培养液吹散细胞和组织块，平铺于5个10cm培养皿 中培养，并补充培养液至5ml。6
‑
8h细胞贴壁后添加培养液至10ml继续培养。 每天换液1次，待细胞长满培养皿后冻存备用。其中，大白猪为温氏集团种猪 场提供。
37.实施例1靶向cd163基因和mstn基因的crispr/cas9打靶载体的构建
38.1、首先锁定编码猪cd163基因的外显子和mstn基因的外显子为打靶区 域，利用软件分别设计多个针对cd163和mstn的grna，即打靶位点。其中， 针对cd163的打靶位点为cd163
‑
grna：ggtcgtgttgaagtacaaca(seqid no：1)；针对mstn的打靶位点为mstn
‑
grna： gtcgagtccaaaatctctcc(seq id no：2)。
39.2、根据上述grna序列合成互补配对的寡聚核苷酸，如下表1所示，表1 为与grna序列互补配对的寡核苷酸，小写字母为匹配载体酶切位点序列。
40.表1
41.名称序列5
′‑3′
cd163
‑
grna
‑
f
‑
1(seq id no：3)caccggtcgtgttgaagtacaacacd163
‑
grna
‑
r
‑
1(seq id no：4)aaactgttgtacttcaacacgaccmstn
‑
grna
‑
f
‑
1(seq id no：5)cacc gtcgagtccaaaatctctccmstn
‑
grna
‑
r
‑
1(seq id no：6)aaac ggagagattttggactcgac
42.3、构建靶向cd163基因和mstn基因的crispr/cas9打靶载体，
43.px330载体骨架如图1所示。具体构建方法如下：
44.(1)将表1合成的2对寡聚核苷酸分别在98℃条件下处理5min，自然冷却至 室温后进行退火；
45.(2)用限制性内切酶bbsi对含有cas9序列的px330骨架载体在37℃条件下 酶切2h，切胶回收线性化片段；
46.(3)之后，将线性化片段与退火后的寡聚核苷酸在16℃连接1h，随后转化 top10或dh5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的lb平板生长；
47.(4)挑取单菌落扩大培养并测序，测序引物为u6
‑
fwd。经比对序列正确后， 对菌液进行扩大培养；
48.(5)用质粒去内毒素大提试剂盒(endofreeplasmidmaxikit)提供的方法，提取 质粒，所提的质粒用于细胞的转染。
49.实施例2同时敲除cd163基因和mstn基因的大白猪胎儿成纤维细胞系的 建立
50.1、细胞转染实施例1所得质粒
51.转染前一天将原代大白猪胎儿成纤维细胞复苏至6cm平皿中，当细胞达到 70
‑
80％汇合度时即可进行细胞转染。转染步骤严格按照 basicprimaryfibroblastsnucleofectorkit(lonza)试剂盒说明书进行操作。
52.2、打靶效率的检测
53.电转染后的细胞培养一部分低密度铺板形成单细胞克隆，另一部分全部混 合培养以鉴定载体的基因编辑效率。混合培养部分细胞48h后收集，提取细胞 基因组，进行pcr扩增，并以t7e1鉴定打靶效率。结果表明：cd163基因grna 的打靶效率约为40％；mstn基因
grna的打靶效率约为17％。
54.请参阅图2，图2为本发明设计的基因打靶系统的效果分析。其中：1为 dna ladder；2为mstn敲除质粒的t7e1效果分析；3为mstn未酶切对照； 4为cd163敲除质粒的t7e1效果分析，5为cd163未酶切对照。
55.以提取的细胞基因组为模板，用premixtaqdna聚合酶进行pcr，所述pcr 扩增引物如下所示：
56.其中cd163基因的扩增引物为cd163
‑
f：5
’‑
gaattgtctccagggaagga
‑3’
(seq idno：7)和cd163
‑
r：5
’‑
agcccagatctgtccacttc
‑3’
(seq id no：8)。扩增条件为95℃， 5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；34个循环，2％琼脂 糖凝胶电泳观察条带。
57.其中mstn基因的扩增引物为mstn
‑
f:5
’‑
tagggtaggaaagtgattcagg
‑3’
(seqidno：9)和mstn
‑
r:5
’‑
tggagacatctttgtgggagta
‑3’
(seqid no：10)。扩增条件为95℃， 5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；34个循环，2％琼 脂糖凝胶电泳观察条带。
58.3、阳性单克隆细胞系的筛选
59.低密度培养部分细胞每3天更换一次培养液(dmem+15％fbs)。铺板后 的细胞大约培养10天左右，可以观察到合适大小的细胞克隆团形成。挑取单克 隆细胞进行扩大培养，同时取部分细胞用于提取基因组鉴定基因型。
60.请参阅图3，图3为筛选获得的双基因敲除细胞照片，其为双基因敲除效果 较好的两个细胞编号，分别命名为dko13细胞和dko14细胞，表2为筛选获得 细胞基因型分析统计结果。
61.表2
62.基因型比例cd163纯合8/72＝11.1％cd163杂合20/72＝27.8％cd163野生44/72＝61.1％mstn纯合5/72＝7％mstn杂合18/72＝25％mstn野生49/72＝68％双基因等位缺失(dko)4/72＝5.6％
63.4、阳性单克隆细胞系的鉴定
64.对所挑取的细胞单克隆进行鉴定：以提取的细胞基因组为模板，用premixtaq dna聚合酶进行pcr。
65.其中cd163基因的扩增片段为300bp，引物为cd163
‑
f： 5
’‑
gaattgtctccagggaagga
‑3’
(seq id no：7)和cd163
‑
r： 5
’‑
agcccagatctgtccacttc
‑3’
(seq id no：8)。扩增条件为95℃，5min；95℃，30s； 58℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；34个循环。
66.mstn基因扩增出的目的片段为300bp，引物为 mstn
‑
f:5
’‑
tagggtaggaaagtgattcagg
‑3’
(seqid no：9)和 mstn
‑
r:5
’‑
tggagacatctttgtgggagta
‑3’
(seqid no：10)。扩增条件为95℃，5min； 95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；34个循环。
67.1％琼脂糖凝胶电泳观察条带，pcr产物送华大基因公司测序，根据测序结 果，筛
选双基因同时发生移码突变的细胞系用作核移植时的供体细胞。
68.请参阅图4，图4为mstn和cd163靶位点pcr扩增示意图。所有单细胞 克隆逐一进行pcr检测，并进行sanger测序鉴定基因型。
69.请参阅图5，经鉴定部分细胞克隆的cd163或mstn敲除基因型示意图。
70.请参阅图6，图6为dko14细胞在cd163编辑靶点处pcr示意图。
71.请参阅图7，图7为dko14细胞在mstn编辑靶点处pcr示意图。
72.5、实验结果
73.测序结果显示，成功的获得了多株cd163基因和mstn基因都敲除的猪胎 儿成纤维细胞系，所获得细胞在cd163和mstn位点处产生纯合移码突变，可 完全消除这两个基因的表达。
74.实施例3基因组编辑猪的方法
75.以实施例2获得的纯合敲除的阳性细胞作为核移植供体细胞，以体外成熟 40h的青年猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入去核的卵母细 胞，经电融合与激活，构建成重组克隆胚胎，挑选发育状态良好的克隆重组胚 胎用手术法移入自然发情的经产大白母猪子宫内进行妊娠。手术法胚胎移植步 骤为呼吸机麻醉，并伴有2％的水合氯醛维持麻醉，在手术架上仰卧保定,腹中 线做一个长约10cm的手术切口,曝露卵巢、输卵管及子宫,用胚胎移植玻璃管沿 输卵管伞部进入约5cm，将发育状态良好克隆重组胚胎移植到输卵管壶腹部
‑
峡 部结合处。胚胎移植后，技术人员注意观察其返情情况，定期用b型超声波检 查受体母猪妊娠情况。生产的子代为cd163基因和mstn基因都敲除的基因组 编辑猪。
76.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利 用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术 领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。