一种假型化病毒载体颗粒的制作方法

1.本发明属于肿瘤免疫治疗领域。涉及一种具体涉及用突变体galv糖蛋白提高慢病毒滴度。


背景技术：

2.包膜蛋白env(envelop)是一种病毒外壳蛋白，它能够介导病毒颗粒附着在宿主细胞表面，进而与宿主细胞膜表面受体融合，在病毒感染宿主细胞过程中发挥重要作用。本发明的主要研究对象是长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemia virus,galv)的包膜蛋白(galvenv)，长臂猿白血病病毒是一种逆转录病毒。
3.逆转录病毒的包膜蛋白由胞外区、跨膜区、胞内区组成。胞外区可以和宿主细胞表面受体融合，融合后病毒遗传物质进入宿主细胞中。跨膜区由很短的21个氨基酸组成。当病毒颗粒附着在细胞膜表面时，病毒自身编码的蛋白酶会将胞内区部分约16个氨基酸(r肽)剪切，提高包膜蛋白融合能力，活化的包膜蛋白能够与宿主细胞表面受体融合，病毒遗传物质进入宿主细胞中从而开启了病毒的复制和组装。
4.有报道修饰狒狒内源性逆转录病毒(baev)包膜蛋白的胞质尾结构域使其缺乏抑制性r肽，修饰后的baev包膜蛋白包装慢病毒后滴度没有明显变化，然而他们是在野生型baev包膜蛋白基础上修改的，野生型baev包膜蛋白的胞内区不是病毒编码蛋白酶的天然识别序列。galv包膜蛋白是工业界普遍使用的包膜蛋白，广泛的应用于基础科研和病毒液gmp生产，是基因治疗和细胞治疗的重要工具之一。通过修饰galv的包膜蛋白，使其胞外区和跨膜区与胞内区病毒编码蛋白酶的天然识别序列融合，并使其缺乏抑制性r肽，能进一步提高病毒产量和滴度，既能够为基础科研应用提供强有力且高效的工具，又能为病毒液工业化生产带来规模化经济效益。有鉴于此，本领域急需改造和优化galv 的包膜蛋白，提高病毒产量。


技术实现要素：

5.一方面，本发明提供了用于将生物材料转移到细胞中的假型化病毒载体颗粒，其中所述载体颗粒至少包含：
[0006]-嵌合包膜糖蛋白，其包含或由长臂猿白血病病毒(galv)包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(mlv)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体组成,其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性r肽；或
[0007]-修饰的galv包膜糖蛋白，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性r肽。
[0008]
一方面，本发明提供了使用本发明的假型化病毒载体颗粒，治疗造血功能障碍或免疫治疗血液瘤和实体瘤的方法。
[0009]
另一方面，本发明提供了包含作为活性成分的根据本发明的假型化病毒载体颗粒的药物。
[0010]
另外，本发明还涉及根据本发明的假型化病毒载体颗粒用于将生物材料离体转移
到造血细胞或免疫淋巴细胞中的用途。
[0011]
最后，本发明还涉及产生如上述定义的假型化病毒载体颗粒的稳定病毒包装细胞系。
[0012]
发明详述
[0013]
假型化病毒载体颗粒
[0014]
本发明涉及用于将生物材料转移到细胞中的假型化病毒载体颗粒，其中所述载体颗粒至少包含：
[0015]-嵌合包膜糖蛋白，包含或由长臂猿白血病病毒(galv)包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(mlv)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体组成；或
[0016]-修饰的galv包膜糖蛋白，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性r肽。
[0017]
在逆转录病毒重组包装时使用来自逆转录病毒的核心蛋白gag和pol基因编码的蛋白。gag基因编码由逆转录病毒蛋白酶进一步加工成包含核心的结构蛋白的多蛋白。pol基因编码逆转录病毒蛋白酶、逆转录酶和整合酶，本发明使用的gag和pol都是来源于mlv，当gag和pol中的蛋白酶识别包膜蛋白胞内区后剪切包膜蛋白使其具有融合能力。galv的包膜蛋白胞外区和跨膜区与mlv包膜蛋白胞内区融合后会提高蛋白酶识别剪切的效率。
[0018]
如本文所预期，术语“载体颗粒”是指易于在其表面显示嵌合包膜糖蛋白或修饰的galv包膜糖蛋白并可逆地结合生物材料的任何颗粒。优选的是，此类载体颗粒是病毒载体颗粒，特别是逆转录病毒载体颗粒。优选地，所述逆转录病毒载体颗粒选自癌病毒载体颗粒，包括鼠白血病病毒(mlv)、禽白血病病毒(alv)、呼吸道合胞病毒(rsv)或mason-pfizer猴病毒(mpmv)载体颗粒；慢病毒载体颗粒，诸如人免疫缺陷病毒(hiv)，例如hiv-1或hiv-2、猴免疫缺陷病毒(siv)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、马感染性贫血病毒(eiav)和山羊关节炎脑炎病毒(caev)载体颗粒；和泡沫病毒载体颗粒，诸如人泡沫病毒(hfv)载体颗粒。
[0019]
慢病毒载体颗粒是本领域技术人员众所周知的，且特别在naldini等人(2000)adv.virus.res.55： 599-609和negre等人(2002)biochimie84：1161-1171中描述。通常，根据本发明的慢病毒载体颗粒至少包含以下组分：(i)包膜组分，其由与包膜蛋白结合的磷脂双分子层构成，其中所述包膜蛋白至少包含上述定义的嵌合或修饰的糖蛋白，所述包膜环绕(ii)由gag蛋白结合构成的核心组分，所述核心本身环绕(iii)通常由核糖核酸(rna)构成的基因组组分和(iv)酶组分(pol)。所述生物材料可以存在于包膜内、核心内和/或基因组组分内。
[0020]
慢病毒载体颗粒可以容易地由本领域技术人员，例如，通过遵循由sandrin等人(2002)blood100： 823-832提供的通用指导来制备。简而言之，慢病毒载体颗粒可通过在所谓生产细胞(例如293t人胚胎肾细胞)中表达包装元件(即核心和酶组分)、基因组组分和包膜组分来生成。通常可以采用3 至4种质粒，但数目可以根据慢病毒组分被分解成单独单元的程度而更多。
[0021]
如本文中所使用，术语“假型化病毒载体”是指包含外来病毒包膜糖蛋白的病毒载体。通常，根据本发明的病毒载体用上文定义的嵌合或修饰的糖蛋白假型化。
[0022]
在本发明的上下文中，术语“galv包膜糖蛋白”是指galv包膜糖蛋白的野生型形式。如技术人员已知的，galv包膜糖蛋白由胞质尾结构域、跨膜结构域和胞外结构域构成。包膜糖蛋白序列中对应于胞质尾结构域、跨膜结构域和胞外结构域的区域可以由技术人员
容易地确定。通常，胞质尾结构域位于野生型galv包膜糖蛋白的氨基酸530至564之间。优选地，galv包膜糖蛋白的野生型胞质尾结构域包含或由氨基酸序列seq id no：3组成。
[0023]
在本发明的上下文中，术语“mlv包膜糖蛋白”是指mlv包膜糖蛋白的野生型形式.包膜糖蛋白序列中对应于胞质尾结构域的区域可以由技术人员容易地确定。通常，mlv包膜糖蛋白的胞质尾结构域位于野生型mlv包膜糖蛋白的氨基酸622至654之间。因此，在一个特别优选的实施方案中，包含或由galv包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与mlv包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体组成的嵌合包膜糖蛋白的胞内区包含或由氨基酸序列seq id no：10组成。优选地，它由核酸序列seq idno：13编码。此类嵌合包膜糖蛋白在下文中称为“galv-tr”。
[0024]
在本发明的特定实施方案中，galv包膜糖蛋白的胞质尾结构域缺乏融合抑制性r肽。在本发明的上下文中，术语“融合抑制性r肽”是指包膜糖蛋白的胞质尾结构域的c-末端部分，其携带酪氨酸内吞信号-yxxl，并在病毒颗粒成熟过程中被病毒蛋白酶裂解，从而增强包膜糖蛋白的膜融合。galv 包膜糖蛋白的融合抑制性r肽通常位于野生型galv包膜糖蛋白的氨基酸671和687之间。因此，在一个特别优选的实施方案中，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性r肽的修饰的galv包膜糖蛋白包含或由氨基酸序列seq id no：11组成,它由核酸序列seq id no：14编码。此类修饰的galv包膜糖蛋白在下文中称为“galv-trd”。
[0025]
在另一个特定实施方案中，galv包膜糖蛋白的胞质尾结构域被病毒编码的蛋白酶的识别和剪切氨基酸序列替代，形成了胞质尾结构域缺乏融合抑制性r肽的修饰的galv包膜糖蛋白包含或由氨基酸序列seq id no：12组成,它由核酸序列seq id no：15编码。此类修饰的galv包膜糖蛋白在下文中称为“galv-trd-v1”。
[0026]
本发明证明了galv-trd和galv-trd-v1糖蛋白比野生型galv糖蛋白包装慢病毒后产生的病毒滴度高。
[0027]
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的假型化病毒载体颗粒通过本文以下部分“用于产生假型化病毒载体颗粒的方法”中描述的方法可获得或获得。
[0028]
本发明的假型化病毒载体颗粒对于将生物材料转移入细胞、特别是造血细胞、免疫淋巴细胞等是特别感兴趣的。因此，在一个优选的实施方案中，如上定义的假型化病毒载体颗粒进一步包含生物材料。如本文中所预期，表述“生物材料”涉及易于改变细胞的结构和/或功能的一种或多种化合物。在本发明的上下文中，优选的是，所述生物材料是一种或多种核酸，在慢病毒载体颗粒的情况下，其可以包含在载体颗粒的基因组内。基因组通常包含一种或多种核酸，其优选连接至对于其在靶细胞中表达所需的基因元件，诸如启动子和终止子，侧翼为对于在核心元件中包括基因组、其逆转录成脱氧核糖核酸(dna)、逆转录的基因组输入靶细胞的核和逆转录的基因组整合在靶细胞的基因组内所需的顺式作用元件。目标核酸的实例包括球蛋白基因，造血生长因子，其包括促红细胞生成素(epo)；白细胞介素(特别是白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-6、白细胞介素12等)和细胞集落刺激因子(诸如粒细胞集落刺激因子，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子，或干细胞集落刺激因子)；血小板特异性整合素αiibβ；多药耐药基因；患有慢性肉芽肿病(cgd)的患者中缺陷的gp91 或gp47基因；使细胞耐受病原体诸如人免疫缺陷病毒感染的抗病毒基因；编码以下的基因：在血友病患者中突变的凝血因子viii或ix、参与t细胞介导的免疫应答的配体诸如t细胞抗原受体、b细胞抗原受体(免疫球蛋白)、白细胞介素受体常见γ链、单
独的t和b细胞抗原受体的组合和/或t 和b细胞抗原受体与单链抗体(scfv)的组合、il2、il12、tnf、γ干扰素、ctla4、b7等；肿瘤细胞中表达的基因，诸如melana、mage基因(诸如mage-1、mage-3)、p198、p1a、gp100等。
[0029]
如本文所预期，“转移”涉及载体颗粒在结合靶细胞后初始将生物材料递送至靶细胞的膜或细胞质的能力。递送后，生物材料可以被转运至细胞的其它隔室。
[0030]
如本文中所预期，待转移生物材料的受体细胞或靶细胞涉及易于被上述定义的载体颗粒结合的任何细胞。当载体颗粒是慢病毒载体颗粒时，靶细胞涉及易于被载体颗粒转导的任何细胞。
[0031]
如本文中所使用，术语“造血细胞”通常是指血细胞，来自髓样和淋巴样谱系两者。特别地，术语“造血细胞”包括未分化或分化不良的细胞，诸如造血干细胞和祖细胞，和分化细胞，诸如t淋巴细胞、b 淋巴细胞或树突状细胞。优选地，造血细胞选自造血干细胞，cd34+祖细胞，特别是外周血cd34+细胞，非常早期cd34+祖细胞，b细胞cd19+祖细胞，髓样cd13+祖细胞，t淋巴细胞，b淋巴细胞，单核细胞，树突状细胞，肿瘤b细胞，特别是b细胞慢性淋巴细胞性白血病(bcll)细胞和边缘区淋巴瘤(mzl)b细胞和胸腺细胞。
[0032]
用于产生假型化病毒载体颗粒的方法
[0033]
本发明还涉及用于产生假型化病毒载体颗粒的方法，其包括：
[0034]
a)用以下物质转染细胞以得到生产细胞：
[0035]
(i)至少一种第一核酸序列，包含具有包装能力的逆转录病毒衍生的基因组；
[0036]
(ii)至少一种第二核酸序列，包含编码来自所述逆转录病毒的核心蛋白的cdna；
[0037]
和
[0038]
(iii)至少一种第三核酸序列，包含编码以下的cdna：
[0039]-嵌合包膜糖蛋白，包含或由狒狒内源性逆转录病毒(galv)包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(mlv)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体组成，如上所定义；或
[0040]-修饰的galv包膜糖蛋白，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性r肽，如上所定义；
[0041]
b)将生产细胞在培养物中维持足够时间，以允许表达cdna以产生编码蛋白；和
[0042]
c)允许编码蛋白形成本发明的病毒载体颗粒。
[0043]“逆转录病毒”是指基因组由rna分子组成且包含逆转录酶的病毒，即逆转录病毒科的成员。逆转录病毒分为癌病毒、慢病毒和泡沫病毒。优选地，所述逆转录病毒是癌病毒，例如， mlv、alv、rsv或mpmv；慢病毒，例如hiv-1、hiv-2、siv、eiav或caev；或泡沫病毒，诸如hfv。这些逆转录病毒的基因组容易从数据库中获得。更优选地，所述逆转录病毒是慢病毒，特别是hiv-1、hiv-2或siv。
[0044]
在本发明的上下文中，“包含具有包装能力的逆转录病毒衍生的基因组的核酸序列”是指包含被称为“顺式作用”序列的逆转录病毒核酸序列的序列。这些包括用于控制转录和整合的长末端重复序列(ltr)，对于衣壳化(encapsidation)所需的psi序列，和对于逆转录病毒基因组的逆转录所需的引物结合位点(pbs)和多聚嘌呤追踪(polypurinetrack，ppt)序列。有利地，所述包含具有包装能力的逆转录病毒衍生的基因组的核酸序列进一步包含转基因。
[0045]
在不存在任何反式互补功能的情况下，所述逆转录病毒基因组可以是复制缺陷型
或具有复制能力的。具有复制能力的基因组可以进一步包含gag、pol和env逆转录病毒基因。在复制缺陷型基因组中，病毒基因gag、pol和env缺失。然而，本发明的病毒载体颗粒的装配可以通过反式提供另一种编码gag、pol和/或env糖蛋白、但对于“顺式”序列有缺陷的质粒来实现。它们的表达允许转基因的衣壳化，不包括对于病毒基因组的增殖和完整病毒颗粒的形成所必需的基因。
[0046]“来自逆转录病毒的核心蛋白”是指gag和pol基因编码的蛋白。gag基因编码由逆转录病毒蛋白酶进一步加工成包含核心的结构蛋白的多蛋白。pol基因编码逆转录病毒蛋白酶、逆转录酶和整合酶。
[0047]
出于转染的目的，所述第一、第二和第三核酸序列可以在相同载体或在两种或三种分开的载体上携带。通常，一种质粒编码病毒载体颗粒的核心逆转录病毒组分。gag和pol基因的来源为病毒载体颗粒给出了其名称。例如，表述“hiv-1衍生的载体颗粒”通常表明载体颗粒的gag和pol基因是hiv-1 的gag和pol基因。
[0048]
术语“转染”是指将外来核酸(dna、cdna或rna)引入细胞，使得宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生所需物质，通常是由引入的基因或序列编码的蛋白。引入的基因可以包括调节或控制序列，诸如由细胞的遗传机制使用的启动、终止、启动子、信号、分泌或其它序列。接受并表达引入的dna或rna的宿主细胞已经被“转染”。
[0049]
为了产生载体颗粒，可以采用与慢病毒gag和pol基因的表达相容的任何细胞，或可工程化为支持此类表述的任何细胞。例如，可以使用生产细胞，诸如293t细胞和昆虫细胞(特别是对于hiv衍生的载体)、te671和ht1080细胞(特别是对于mlv衍生的载体)。
[0050]
本发明还涉及包含作为活性成分的如上所定义的假型化病毒载体颗粒(特别是进一步包含优选是一种或多种核酸的生物材料的如上所定义的假型化病毒载体颗粒)的药物。
[0051]
其还涉及包含如上所定义的假型化病毒载体颗粒(特别是进一步包含优选是一种或多种核酸的生物材料的如上所定义的假型化病毒载体颗粒)和药学可接受的载体的药物组合物。
[0052]
本发明还涉及一种用于治疗需要其的受试者的方法，其包括向需要其的受试者施用治疗有效量的如上所定义的假型化病毒载体颗粒(特别是进一步包含优选是一种或多种核酸的生物材料的如上所定义的假型化病毒载体颗粒)。
[0053]
在本发明的上下文中，“受试者”是指人或非人哺乳动物，诸如啮齿类动物(大鼠、小鼠、兔)，灵长类动物(黑猩猩)，猫科动物(猫)，犬科动物(狗)。优选地，受试者是人。
[0054]
如本文中所使用，术语“药学可接受的载体”是指可以与本发明的病毒载体一起向患者施用且不破坏其药理活性的载体，并且当以足以递送药学有效量的病毒载体的剂量施用时，所述载体是无毒的。
[0055]
可用于本发明的药物组合物中的药学可接受的载体和媒介物可包括，但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送系统(sedds)诸如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、药物剂型中使用的表面活性剂诸如吐温或其他类似的聚合物递送基质、血清蛋白诸如人血清白蛋白、缓冲物质诸如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠，磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲
基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。环糊精诸如α-、β-和γ-环糊精，或化学修饰的衍生物诸如羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-β-环糊精，或者其他溶解的衍生物也可有利地用于增强根据本发明的组合物的递送。
[0056]
可以使用本领域技术人员已知的任何合适的施用方法。特别地，根据本发明的假型化病毒载体颗粒可例如通过口服途径或通过肠胃外途径(特别是通过静脉内注射和股骨(骨髓腔)内注射)而施用。当选择肠胃外途径时，假型化病毒载体颗粒可以是在安瓿或烧瓶中条件化的可注射溶液和悬浮液形式。用于肠胃外递送的形式通过将根据本发明的假型化病毒载体颗粒与缓冲剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂和浆化剂混合而常规获得。然后根据已知技术，将这些混合物灭菌且以静脉内注射剂的形式条件化。本领域技术人员可使用基于有机磷酸盐的缓冲剂作为缓冲剂。浆化剂的实例包括甲基纤维素、阿拉伯胶和羧甲基纤维素钠。稳定剂的实例包括亚硫酸钠和偏亚硫酸钠，以及防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸钠、山梨酸、甲酚和氯甲酚。
[0057]“治疗有效量”是指病毒载体赋予治疗的受试者治疗效果的量。治疗效果可以是客观的(即，可通过一些测试或标记测量)或主观的(即，受试者给出效果的指示或感觉效果)。如技术人员已知，有效剂量将取决于施用途径、受试者的大小和/或重量以及与其他试剂共同使用的可能性而变化。
[0058]
当假型化病毒载体颗粒被用作药物并在治疗方法中向受试者施用时，优选通过静脉内途径或通过髓状途径、特别是股骨或肱骨髓状途径施用。对于静脉内施用，可以使用如上所定义的约5.108至约 109个假型化病毒载体颗粒的单位剂量，而对于髓状施用，可以使用如上所定义的约108至约5*108个假型化病毒载体颗粒的单位剂量。
[0059]
在一个特定实施方案中，本发明的假型化病毒载体颗粒用于治疗造血功能障碍或自身免疫性疾病。
[0060]
本发明还涉及如上所定义的假型化病毒载体颗粒用于制备意欲用于治疗造血功能障碍或自身免疫性疾病的药物的用途。其还涉及用于治疗受试者的造血功能障碍或自身免疫性疾病的方法，其包括向需要其的受试者施用治疗有效量的本发明的假型化病毒载体颗粒。
[0061]
转导方法
[0062]
本发明还涉及如上所定义的假型化病毒载体颗粒用于将上述“生物材料”部分中所定义的生物材料离体转移入造血细胞或免疫淋巴细胞的用途。
[0063]
如本文所预期，“转移”或“转导”涉及载体颗粒在结合靶细胞后初始将生物材料递送至靶细胞的膜或细胞质的能力。递送后，生物材料可以被转运至细胞的其它隔室。实现转导靶细胞的条件是技术人员众所周知的，并且通常包括优选以1、5、10或100的moi、优选在无血清培养基中将待转导的细胞(优选在用纤维连接蛋白包被的烧瓶、板或皿中培养，并且任选用细胞因子鸡尾酒预刺激)与本发明的假型化病毒载体颗粒孵育。
[0064]
本发明还涉及稳定的病毒包装细胞系，其产生如上所定义的假型化病毒载体颗粒，所述假型化病毒载体颗粒包含至少一种嵌合包膜糖蛋白，所述嵌合包膜糖蛋白包含或由galv包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与mlv包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体组成。
[0065]
事实上，本发明人证明了galv/tr糖蛋白对293t生产细胞没有细胞毒性。
[0066]
在本发明的上下文中，稳定的病毒包装细胞系是指稳定表达本发明的假型化病毒
载体颗粒的不同组分的细胞系。通常，将编码本发明的假型化病毒载体颗粒的不同组分的核酸整合到细胞系的基因组中。特别地，此类稳定的病毒包装细胞系可以是与慢病毒gag和pol基因的表达相容的任何细胞，或可工程化为支持此类表达的任何细胞。例如，它们可以是293t细胞和昆虫细胞(特别是对于hiv衍生的载体)，可以使用te671和ht1080细胞(特别是对于mlv衍生的载体)。
[0067]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
[0068]
本发明将通过以下附图和实施例来进一步说明。
附图说明
[0069]
图1显示野生型mlv的野生型糖蛋白mlv env，野生型galvenv，通过化学合成和分子克隆的方式将galvenv的胞内区替换成mlv env的胞内区，成为galv-tr。删除galv-tr的胞质尾r肽成为突变体galv-trd。将galv-trd胞内区的酶切位点附近氨基酸序列通过化学合成和分子克隆的方式进一步替换成病毒编码水解酶的天然识别氨基酸序列，成为galv-trd-v1。
[0070]
图2显示293t细胞感染检测慢病毒滴度，用流式细胞检测病毒载体gfp阳性率，按照如下公式计算病毒感染滴度：每孔滴度titer(tu/ml)＝感染细胞数(1
×
105个)
×
流式检测car表达比例(％)/病毒液体积(ml)
[0071]
图3所示包膜蛋白包装慢病毒载体的病毒滴度定量柱状图。
具体实施方式
[0072]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，否则本发明实施例中所用的试剂和材料均为市售产品。
[0073]
实施例1：慢病毒包装
[0074]
1.第1天：hke293t细胞应是小于20代，细胞状态良好，不过分长满。以6
×
106个细胞铺板t25培养瓶，添加10ml的dmem+10％fbs培养基，充分混匀细胞，co2培养箱37℃培养过夜；
[0075]
2、第2天：hek293t细胞融合度达到80％左右进行转染(通常是铺板16-20h左右)；准备质粒复合物，慢病毒包装体系为：在一个离心管中加入300ul dmem培养基，3ug骨架质粒mp71 gfp，1.9ugrre，1.1ugrev,0.75ug包膜质粒galv或galv-tr或galv-trd或galv-trd-v1，混匀静置2分钟；在另一个离心管中加入300ul dmem培养基，6.28ul peipro(polyplus)，混匀静置2分钟，边涡旋震荡边加入上述质粒。吸弃6ml293t细胞的t25培养瓶培养基，温柔地加入质粒转染试剂混合物，37℃培养4h，去除培养基，重新加入预热的新鲜培养基。
[0076]
3、第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后分装保存于-80℃。
[0077]
实施例2：hek293t细胞感染检测慢病毒滴度
[0078]
1、将实施案例2中收获的由galv或galv-tr或galv-trd或galv-trd-v1包装的病毒液依次以12.3ul、37ul、111ul、333ul加入24孔板中，最终补齐培养基至终体积为1ml，均匀混合。
[0079]
2、加入100ul细胞悬液浓度为1x106cells/ml的293t细胞，细胞总数为1x105cells/well，添加polybrene 每孔终浓度为8.8ug/ml，病毒液和细胞均匀混合后，32℃，离心机设置2500rpm，离心90min。
[0080]
3、吸弃上清0.8ml，显微镜下观察细胞是否聚团，是否铺板均匀，如不均匀可用1ml枪头吹打，再加入0.8mld10完全培养基至终体积为1ml，细胞铺均匀后放入37℃，5％co2培养箱继续培养。
[0081]
4、48h后流式检测gfp阳性率，按照如下公式计算病毒感染滴度，实验结果如下表1所示：
[0082]
每孔滴度titer(tu/ml)＝感染细胞数(1
×
105个)
×
流式检测car表达比例(％)/病毒液体积(ml)
[0083]
表1.不同体积病毒液感染293t细胞测定滴度
[0084]