一种具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白CpoC及其基因和应用

一种具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白cpoc及其基因和应用
技术领域
1.本公开涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、制备玉米赤霉烯酮降解酶的方法和玉米赤霉烯酮降解酶在处理农产品中的应用。


背景技术：

2.霉菌毒素是由真菌产生的有毒代谢产物或次生代谢产物，其高毒性和强致癌性严重威胁动物生产性能和人类健康，给食品业、饲料业和畜牧业带来巨大损失。霉菌毒素的脱毒方法主要包括物理、化学和生物脱毒法，而生物脱毒法可将霉菌毒素降解为无毒物质，具有专一性强、转化效率高和安全环保等优势，但迄今为止，能够产业化应用的高效广谱的霉菌毒素降解酶仍然极少。
3.玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)属于类雌激素活性的次生代谢产物，是危害最严重的霉菌毒素之一。目前对于zen降解酶的研究主要聚焦于真菌来源的内酯水解酶zhd101及其同源物，这类降解酶可以有效转化zen为无毒产物，但同时也存在对中间产物α
‑
玉米赤霉烯醇的降解活力低、热稳定性差以及异源表达量较低等亟待解决的瓶颈问题，因此，需要探索和挖掘更多的降解玉米赤霉烯酮的酶资源。


技术实现要素：

4.为了进一步满足实际应用的需求，本公开提供了一种具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、制备玉米赤霉烯酮降解酶的方法和玉米赤霉烯酮降解酶在处理农产品中的应用。
5.本公开第一方面提供了一种具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白，所述蛋白为如下蛋白(a)或(b)：(a)由seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)在(a)中的氨基酸经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～4之间的任意一个整数。
6.本公开第二方面提供了一种编码如下蛋白(a)或(b)的基因：(a)由seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～4之间的任意一个整数。
7.本公开第三方面提供了一种重组载体，其中，所述重组载体中包含第二方面所述的基因。
8.本公开第四方面提供了一种转化体，其中，所述转化体的宿主细胞为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括第二方面所述的基因，或者，所述转化体中导入的重组载体为第三方面所述的重组载体。
9.本公开第五方面提供了一种玉米赤霉烯酮降解酶的制备方法，其中，所述降解酶方法包括将第四方面所述的转化体接种于培养基中进行培养。
10.本公开第六方面提供了一种玉米赤霉烯酮降解酶在处理农产品中的应用，其中，所述玉米赤霉烯酮降解酶含有第一方面所述的蛋白。
11.通过上述技术方案，本公开提供了具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、制备玉米赤霉烯酮降解酶的方法和玉米赤霉烯酮降解酶在处理农产品中的应用，为低成本生产高产新型的玉米赤霉烯酮降解酶奠定基础，在农产品领域的霉菌毒素的生物降解中具有重要的应用潜力。
12.本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
13.附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
14.图1是蛋白cpoc纯化胶图。泳道1，未诱导的重组菌粗酶液；泳道2，诱导后的重组菌粗酶液；泳道3，nta
‑
10洗脱液；泳道4，nta
‑
20洗脱液；泳道5，nta
‑
50洗脱液；泳道6，nta
‑
100洗脱液；泳道7，nta
‑
150洗脱液；泳道8，nta
‑
200洗脱液。
15.图2是蛋白cpoc降解玉米赤霉烯酮的hplc色谱图。
16.图3是降解酶cpoc与zhd101的序列比对分析。
具体实施方式
17.以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
18.本公开第一方面提供一种具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白，其中，所述蛋白为如下蛋白(a)或(b)：
19.(a)由seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；
20.(b)在(a)中的氨基酸经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～4之间的任意一个整数。
21.其中，本公开第一方面提供的一种具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白即为蛋白cpoc。其中，n可以为1、2、3或4。
22.玉米赤霉烯酮降解酶的活性可以参照db42/t1630
‑
2021(玉米赤霉烯酮降解酶活力的测定)进行测定。玉米赤霉烯酮降解酶活力单位的定义可以包括：在37℃、ph值为5.5的条件下，每分钟从浓度为10μg/ml的玉米赤霉烯酮溶液中降解1μg玉米赤霉烯酮所需的酶量为一个玉米赤霉烯酮降解酶活力单位(u)。
23.本公开第二方面提供一种编码如下蛋白(a)或(b)的基因：
24.(a)由seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；
25.(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～4之间的任意一个整数。
26.根据本公开，其中，所述基因是核苷酸序列为seq id no.1所示的dna分子。
27.本公开第三方面提供一种重组载体，其中，所述重组载体中包含第二方面所述的基因。
28.根据本公开，其中，所述重组载体为重组表达载体，所述重组表达载体是核苷酸序
列如seq id no.3所示的dna分子。
29.本公开第四方面提供一种转化体，其中，所述转化体的宿主细胞为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括第二方面所述的基因，或者，所述转化体中导入的重组载体为第三方面所述的重组载体。
30.根据本公开，其中，所述基因工程菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母中的一种。
31.本公开第五方面提供一种玉米赤霉烯酮降解酶的制备方法，其中，所述降解酶方法包括将第四方面所述的转化体接种于培养基中进行培养。其中，培养基和培养条件可以为已知的各种合适的选择。培养后的物料含有本公开第一方面提供的具有玉米赤霉烯酮降解酶的蛋白，因而具有玉米赤霉烯酮降解酶活性，可以根据需要直接作为玉米赤霉烯酮降解酶组合物使用，也可以根据需要纯化出本公开第一方面提供的具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白，再进行使用。
32.本公开第六方面提供一种玉米赤霉烯酮降解酶在处理农产品中的应用，其中，所述玉米赤霉烯酮降解酶含有第一方面所述的蛋白。
33.根据本公开，其中，所述农产品包括谷物、坚果、水果中的至少一种；优选地，所述谷物包括玉米，所述坚果包括花生。
34.下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
35.实施例1
36.本实施例构建表达cpoc基因的转化体。
37.本公开中表达质粒pet28a为德国默克公司市售产品；大肠杆菌bl21(de3)为北京诺唯赞公司市售产品。
38.首先，使用如下引物对发霉的玉米、秸秆和根茎样品宏基因组进行扩增得到cpoc基因：cpoc
‑
f：5
′‑
ggatccatgagcagcggcttcttcac
‑3′
(seq id no.4)，cpoc
‑
r：5
′‑
ctcgagtctacccttcgatgaaggcc
‑3′
(seq id no.5)；pcr反应程序如表1所示；pcr产物经胶回收后，通过重组酶连接于经过bamhi/xhoi双酶切获得的含有粘性末端的pet
‑
28a载体上，构建大肠杆菌重组表达载体pet
‑
cpoc；将该表达载体转化至大肠杆菌bl21(de3)，经pcr、酶切，测序验证插入序列正确，得到转化体，将该转化体命名为bl21
‑
pet
‑
cpoc。
39.表1 pcr反应程序
[0040][0041]
实施例2
[0042]
本实施例用于制备纯品蛋白。
[0043]
降解酶cpoc的诱导表达：(1)以1％的接种量将转化体接种到20ml的加了抗生素的lb液体培养基中，37℃摇床过夜培养；(2)次日以od
600
为0.1的初始浓度的接种量将菌液转接到500ml的加了卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养至菌液浓度0.6～0.8；(3)加入iptg(终浓度0.5mmol/l)进行蛋白诱导表达，诱导条件为16℃，20h。
[0044]
亲和层析纯化重组降解酶cpoc：(1)诱导后的菌液离心，经5000rpm10min收集菌体，用nta
‑
0重新悬浮菌体；(2)菌液超声破碎：将含有悬浮菌体的离心管置于冰水混合物的烧杯中，置于超声破碎仪超声5～10min，超声仪设定程序为：超声3s停5s，功率＜400w；(3)超声破碎后的样品13000xg离心30min，用离心管分别收集破碎液上清和沉淀，离心得到的破碎上清液即为粗酶液。(4)取出镍柱，待乙醇流完后首先用去离子水清洗镍柱两遍，然后用nta
‑
0平衡柱子，流速保持在1ml/min；粗酶液挂柱，穿透两次，流速同上；(5)用配置好的nta
‑
10，nta
‑
20，nta
‑
50，nta
‑
100，nta
‑
150，nta
‑
200，nta
‑
300梯度洗脱，使用蛋白检测液检测蛋白，收集洗脱峰；用浓度为20％的乙醇溶液清洗镍柱，清洗后将镍柱保存在4℃的冰箱中；使用超滤离心置换蛋白溶液的缓冲液，从而去除蛋白溶液中的咪唑，所得的蛋白溶液即为酶液。
[0045]
在上述实验中：iptg是诱导重组菌株表达降解酶cpoc蛋白的诱导物，并非催化反应的底物。
[0046]
本实施例的实验结果显示：cpoc基因在大肠杆菌中能够大量可溶性表达。50mm，100mm和150mm的咪唑洗脱液洗脱时，在约35kda处出现单一的蛋白条带，与预测的cpoc融合his
‑
tag的大小较为接近，表明cpoc在含有50
‑
150mm咪唑的缓冲液中被洗脱下来。纯化后的cpoc蛋白sds
‑
page电泳图背景清晰，没有其他的蛋白质条带，蛋白纯度较高并且表达量较大，如图2所示。纯化的蛋白经脱盐柱置换缓冲液并去除咪唑后进行下一步酶学性质的研究。
[0047]
实施例3
[0048]
本实施例用于测定降解酶cpoc的降解活力。
[0049]
实验材料：降解酶获得cpoc蛋白：实施例2得到的纯化后的cpoc蛋白；玉米赤霉烯酮(zen)：色谱级，购自上海源叶生物科技有限公司。
[0050]
重组酶cpoc降解活力测定：(1)zen标准工作母液制备：用注射器将5ml甲醇加入25mgzen标准品中，振荡混匀，使得终浓度达到5mg/ml。封口保存，置于
‑
20℃下备用。(2)制备反应混合体系：498μl以0.05mol
‑
l的tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.0)为buffer的酶溶液和2μl的zen标准储备液(5mg/ml)，使其终浓度达到20μg/ml。(3)反应混合物在37℃下孵育不同的时间(30min，1h，2h，8h)。温育后，加入等体积甲醇终止反应，然后通过agilent hplc系统定量反应酶液中的zen浓度。高效液相色谱的检测具体条件如下：色谱柱：agilent c18色谱柱，4.6mm
×
250mm
×
5μm；流动相：乙腈
‑
水(含0.1％甲酸)(10:90)；流速：0.8ml/min；柱温：25℃；检测波长：λ＝274nm；进样量：10μl。zen降解率(％)＝[20(μg/ml)
‑
剩余zen浓度(μg/ml)]/20
×
100；结果代表三次平行的平均值；酶活力单位(u)定义为在37℃，反应4h条件下，在1h内能转化1μg的zen的酶量。
[0051]
酶活计算(每毫升酶液所含酶活力单位)：
[0052]
[0053]
其中，酶活定义为每ml酶液所含的酶活力单位(u)，酶活力以平均数
±
标准偏差形式表示。稀释倍数为酶活反应体系中待测酶液的稀释倍数，20为酶液体积的单位换算。
[0054]
本实施例的实验结果显示：将cpoc与20μg/ml的zen在相同条件下进行孵育，分别在30min，1h，2h，3h，4h和5h取样进行hplc的检测，降解酶cpoc对zen的降解随时间变化的hplc图谱如图2所示。zen降解率随时间的变化如表1所示，cpoc孵育1h对zen的降解率达到41％，3h降解率达到98％，几乎完全降解，此后3
‑
5h的zen残余量几乎不变，zen降解率稳定在近100％，比酶活为960.92
±
8.30u/ml，cpoc对zen的降解率达到100％。同时，序列比对分析显示，降解酶cpoc与目前报道的玉米赤霉烯酮降解酶zhd101仅有25.51％的相似性(图3)，表明cpoc是一个新型玉米赤霉烯酮水解酶。
[0055]
表1cpoc不同时间对zen的降解率
[0056]
时间降解率30min22.21％
±
0.29％1h41.68％
±
1.52％2h75.74％
±
2.13％3h98.00％
±
0.78％4h99.17％
±
0.81％5h99.16％
±
0.10％
[0057]
本公开从发霉的玉米、秸秆和根茎样品中富集纯化高效稳定的玉米赤霉烯酮降解微生物，利用宏基因组测序的方法挖掘玉米赤霉烯酮降解酶基因，首次发现一个新型高效的玉米赤霉烯酮降解酶cpoc，在饲料、食品、畜牧等领域的霉菌毒素玉米赤霉烯酮的生物降解上具有重要的应用潜力。
[0058]
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0059]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0060]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。