抑制产气荚膜梭菌的益生菌及其筛选方法与应用

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及功能性芽孢杆菌开发与应用领域，特别是抑制产气荚膜梭菌的益生菌及其筛选方法与应用。
背景技术：
：产气荚膜梭菌会引起人类及其他动物的多种疾病，包括人类食物中毒、羔羊痢疾、仔猪腹泻、鸡坏死性肠炎等疾病。患病动物如果未能够得到正确和及时的治疗，很容易导致休克甚至死亡，即使幼龄畜禽感染产气荚膜梭菌经过治疗之后能够存活下来，也会影响其生长发育。产气荚膜梭菌作为主要的人畜共患病的病原菌，一旦触发致病条件就会给人类健康以及畜牧业等行业带来严重的经济损失。益生菌是指在一定量的添加后，对宿主能够产生健康益处的活的微生物。芽孢杆菌属是一种具有良好产酶能力，同时可以促进宿主健康、维持宿主肠道微生物平衡，以及提高宿主免疫能力和降低感染疾病等功能的一种微生物；同时益生菌也可以产生如抗菌素等生物活性物质抑制病原微生物的定殖。此外，益生菌还具有安全、无污染、无残留化的特点，是一种理想的饲料添加剂。已有研究表明，动物源筛选的芽孢杆菌对产气荚膜梭菌具有较好的拮抗能力，从而有效地预防产气荚膜梭菌所引起的动物回肠病变以及坏死性结肠炎等疾病的发生。所以，益生菌也有可能成为抗生素的理想替代品。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明目的在于提供一种抑制产气荚膜梭菌的益生菌及其筛选方法与应用。一种抑制产气荚膜梭菌的益生菌，为具有抑制产气荚膜梭菌能力的解淀粉芽孢杆菌（bacillus_amyloliquefaciens）ba40，保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏日期为2021年5月17日，保藏编号为cctccno:m2021535。所述的益生菌的应用，用于动物预防产气荚膜梭菌感染。所述的应用过程如下：1）益生菌菌液的制备在lb液体培养基中接种解淀粉芽孢杆菌ba40，37℃摇床培养12h，使菌液浓度达到1.0×108~1.0×109cfu/ml，制备解淀粉芽孢杆菌ba40菌液；2）益生菌菌液的应用选取对6周龄c57b/l小鼠24只，ba40+产气荚膜梭菌感染组连续10天口灌胃1ml益生菌解淀粉芽孢杆菌ba40，所述的小鼠经过益生菌解淀粉芽孢杆菌ba40处理后抗病能力显著提高，小鼠体重、肠道形态、肠道屏障有显著变化，同时增加小鼠血清iga、igg表达，降低小鼠血清促炎因子il-1β、il-6、tnf-α表达。一种抑制产气荚膜梭菌的益生菌筛选方法，从猪源粪便中分离纯化得到多株芽孢杆菌菌株，通过双层琼脂法、琼脂扩散法初筛，胆盐、胰酶和酸度耐受实验进行复筛的到具有抑菌活性的芽孢杆菌菌株；筛选步骤如下：1）分离纯化：从猪源粪便中分离芽孢杆菌，并纯化得到多株芽孢杆菌菌株；2）初筛：检测步骤1）中得到的芽孢杆菌菌株对产气荚膜梭菌的抑菌能力，得到具有抑菌能力的菌株；3）复筛：检测步骤2）中得到的抑制致病菌能力较高的芽孢杆菌菌株的胰酶耐受、酸度耐受、胆盐耐受能力，复筛得到具有抑产气荚膜梭菌能力的芽孢杆菌菌株。所述的猪源肠道内容物以及粪便，为地方猪种金华猪于180日龄屠宰后所得空肠、回肠内容物以及粪便样品。所述的分离纯化：将所述的猪源肠道内容物和粪便样品倍比稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6四个稀释梯度，涂布在lb平板，每个稀释梯度至少3个平板，于37℃培养箱24h左右获得单菌落，用接种环挑去单菌落，接种在lb液体培养基中，12h后，用接种环挑去菌液，在lb平板上划线，24h后，lb平板上单菌落即为所得到纯分离的芽孢杆菌菌株。所述的初筛：对于产气荚膜梭菌有抑制效果的菌株，通过检测其抑菌情况而筛选得到对产气荚膜梭菌抑制能力较强的菌株；具体步骤是，在下层lb固体平板中加入100μl的10-3、10-4、10-5、10-6四个稀释梯度的肠道内容物和粪便样品的稀释液，均匀涂布，上层培养基冷却至50℃左右，按照5%的比例，加入产气荚膜梭菌，混合后立即倒入上层平板铺平，置于37℃恒温培养箱中静置培养12h，每个稀释梯度至少做3个平板，筛选具有抑制产气荚膜梭菌能力的芽孢杆菌；随后对分离得到的芽孢杆菌提取其菌液上清，利用牛津杯法，下层琼脂按照5%添加量添加产气荚膜梭菌的rcm培养基中，待下层琼脂凝固后，均匀放置牛津杯，在牛津杯中加入100μl芽孢杆菌上清液，置于37℃厌氧培养箱内24h，每个平板做三个重复，测定抑菌区直径，筛选具有较强抑制产气荚膜梭菌能力的芽孢杆菌菌株。所述的复筛：采用所述的初筛及纯化后得到抑菌能力较强的芽孢杆菌，以市售的枯草芽孢杆菌pb6作为参考菌株，以菌株耐酸能力、耐胆盐能力和耐胰酶能力作为复筛指标得到高耐受能力的芽孢杆菌菌株。本发明能够的有益效果：利用该菌株进行预防小鼠产气荚膜梭菌的感染的动物实验，可以显著改善产气荚膜梭菌感染所引发的体重下降、肠道形态损伤、肠道炎症反应等问题，同时益生菌处理组提高小鼠血清中的iga、igg含量，显著改善小鼠肠道菌群结构，降低小鼠腹泻率，为替代抗生素的使用提供了一条新的途径。附图说明图1是芽孢杆菌抑制产气荚膜梭菌实验结果。图2为益生菌生长曲线。图3为小鼠体重变化结果。图4为小鼠肠道光镜、电镜结果。具体实施方式以下结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。实施例1菌株筛选：（1）从猪源肠道内容物和粪便中初筛具有抑菌能力的芽孢杆菌取180日龄金华猪空肠、回肠肠道内容物以及粪便样品1g，按1：10的比例，用灭菌生理盐水稀释，75℃水浴15min，然后用无菌水10倍梯度稀释，选取10-3、10-4、10-5、10-6四个稀释梯度，分别吸取100μl菌悬液在lb平板上涂布，每个稀释梯度至少3个平板，上层lb半固体培养基冷却至50℃左右，按照5%的比例，加入活化后产气荚膜梭菌(atcc13124)，混合后立即倒入上层平板铺平，置于37℃恒温培养箱中静置培养12h，每个稀释梯度和每个致病菌至少做3个平板，筛选具有抑制致产气荚膜梭菌能力的芽孢杆菌。（2）芽孢杆菌的纯化及抑制产气荚膜梭菌的芽孢杆菌的筛选将所述的初筛得到的芽孢杆菌，用接种环挑去单菌落，接种在lb液体培养基中，12h后，用接种环挑取菌液，在lb平板上划线，24h后，lb平板上单菌落即为所得到纯分离的芽孢杆菌菌株。随后对分离得到的芽孢杆菌提取其菌液上清，利用牛津杯法，下层琼脂按照5%添加量添加产气荚膜梭菌的rcm培养基中，带下层琼脂凝固后，均匀放置牛津杯，在牛津杯中加入100μl芽孢杆菌上清液，置于37℃厌氧培养箱内24h，每个平板做三个重复，测定抑菌圈直径，筛选具有较强抑制产气荚膜梭菌能力的芽孢杆菌菌株。实验结果如图1所示。表1菌株抑制产气荚膜梭菌能力测定菌株dbjtsnjh-5ba40pb6抑菌直径（产气荚膜梭菌）/cm1.571.811.811.921.92（3）复筛：以菌株耐酸能力、耐胆盐能力和耐胰酶能力作为复筛指标得到高耐受能力的芽孢杆菌菌株，具体过程如下：枯草芽孢杆菌pb6是具有优良的抑制产气荚膜梭菌功能的益生菌株，以此作为参考进行耐受菌株筛选。所得到的几株纯化后的菌株接种于lb液体培养基，37℃下培养24h，每隔2h测量一次在吸光度od600下的光密度值，测量芽孢杆菌的生长曲线，结果如图2所示。芽孢杆菌无菌生理盐水菌悬液制备：将上述初筛以及纯化所得到的芽孢杆菌菌落接种于lb液体培养基，37℃下培养12h，以此培养液为接种液，按照2%的接种量接种于50mllb液体培养基中静置培养12h，获得菌株的培养液。4℃条件下10000rpm离心，10min收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤两次，再用无菌生理盐水重悬菌体，调整菌体浓度为1.0×108cfu/ml。芽孢杆菌耐受酸度能力测定，具体操作如下：在lb液体培养基中加入适量5mol/lhcl溶液，使得培养基中ph值分别达到3.5，4.5，5.5，随后按照2%的接种量接入浓度为1×108cfu/ml的芽孢杆菌无菌生理盐水重悬液，置于37℃摇床中培养，12h后按照梯度稀释方法进行涂板记菌数，每个梯度三个重复，检测菌株在不同ph条件下的增殖能力。存活率按照公式计算：其中a对照为对照组菌数，a样品为样品组菌数。存活率%=a样品/a对照×100表2菌株耐酸能力测定菌株ph=3.5·存活率(%)ph=4.5·存活率(%)ph=5.5·存活率(%)dbj0.109.5831.35tsn0.126.1033.11jh-50.082.3430.45ba400.309.5744.53pb60.167.6941.19芽孢杆菌耐胆盐能力测定，具体操作如下：在lb固体培养基高压灭菌后，冷却至50℃左右，添加猪胆盐，设置三个梯度浓度，分别为0.2%、0.3%和0.4%，倒好平板后，取100μl浓度为1×108cfu/ml的芽孢杆菌无菌生理盐水重悬液涂板，放置于37℃恒温培养箱12h后，记菌数。存活率按照公式计算。表3菌株耐胆盐能力测定菌株0.2%胆盐·存活率(%)0.3%胆盐·存活率(%)0.4%胆盐·存活率(%)dbj38.2411.430.07tsn59.1512.120.13jh-559.437.570.07ba4067.6515.240.59pb662.809.880.24芽孢杆菌耐胰酶能力测定，具体操作如下：在lb固体培养基高压灭菌后，冷却至50℃左右，添加胰酶，设置三个梯度浓度，分别为0.2%、0.5%和08%，倒好平板后，取100μl浓度为1×108cfu/ml的芽孢杆菌无菌生理盐水重悬液涂板，放置于37℃恒温培养箱12h后，记菌数。存活率按照公式计算。表4菌株耐胰酶能力测定菌株0.2%胰酶·存活率(%)0.5%胰酶·存活率(%)0.8%胰酶·存活率(%)dbj45.1319.670.89tsn74.1343.360.52jh-539.3922.360.77ba4086.4937.701.33pb677.3828.211.22结果表明，芽孢杆菌对酸、胆盐、胰酶等均具有一定程度的耐受，结合三种指标的情况，选取ba40作为抑制产气荚膜梭菌菌株，然后对其应用能力进行测定。实施例2：菌株ba40的鉴定对本发明菌株ba40的16s16srdna进行测序，通过blast与ncbi数据库进行比对，显示ba40与模式株bacillusamyloliquefaciensab301002.1同源性为99.72%，与模式株bacillusamyloliquefacienskx137853.1同源性为99.38%，故判定为解淀粉芽孢杆菌。菌株ba40已于2021年5月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为cctccno:m2021535。实施例3应用解淀粉芽孢杆菌ba40预防产气荚膜梭菌感染1）益生菌菌液的制备在lb液体培养基中接种权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌ba40，37℃摇床培养12h，使菌液浓度达到1.0×108~1.0×109cfu/ml，制备解淀粉芽孢杆菌ba40菌液；按照同样的方法，对市售的枯草芽孢杆菌pb6制备菌液。2）益生菌菌液的应用选取对6周龄c57b/l小鼠24只，随机分为四组，分别为对照组、产气荚膜梭菌感染组、ba40+产气荚膜梭菌感染组、pb6+产气荚膜梭菌感染组。ba40+产气荚膜梭菌感染组连续10天口灌胃1ml益生菌解淀粉芽孢杆菌ba40、pb6+产气荚膜梭菌感染组连续10天口灌胃益生菌枯草芽孢杆菌pb6，对照组灌胃相同剂量pbs；实验第十一天，对除对照组外三组灌胃1.0×108产气荚膜梭菌，并于72h之内屠宰取样。血清il-1β含量的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。血清il-6含量的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。血清tnf-α含量的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。血清iga含量的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。血清igg含量的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。结肠siga含量的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。血清dao含量的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。血清dla含量的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。表5.本发明实施例3对小鼠生长性能的影响项目对照组感染组pb6+感染组ba40+感染组末重，g21.65a18.25c19.50b21.20a日均采食量，g/天2.99a1.09c2.07b2.85a结肠长度，cm6.61ab5.97c6.08bc6.83a肝脏指数4.40c6.30a5.04b4.84bc脾脏指数0.36c1.10a0.56b0.45b注：同行肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)由表5和对应的体重变化图图3可知，与对照组相比，益生菌ba40预防后攻毒产气荚膜梭菌，小鼠体重、日均采食量、结肠长度、肝脏指数、脾脏指数都无显著变化(p>0.05)；与产气荚膜梭菌感染组相比，益生菌ba40预防后攻毒产气荚膜梭菌小鼠体重、日均采食量、结肠长度、肝脏指数、脾脏指数都有显著变化(p<0.05)。表6.本发明实施例3对小鼠血清促炎因子及免疫球蛋白的影响项目对照组感染组pb6+感染组ba40+感染组il-1β，μg/ml144.34ab153.08a123.60bc113.22cil-6，μg/ml138.99b167.99a136.07b132.73btnf-α，μg/ml666.79ab731.97a590.29b564.45biga，μg/ml422.85a504.46b452.28a434.47aigg，μg/ml59.90ab78.64b64.71ab55.17bsiga，μg/ml17.09b21.99a15.99bc13.98cdao，μg/ml32.85ab37.93a38.28a26.07bdla，μg/ml103.01b119.49a111.57ab103.36b由表6可知，与对照组相比，益生菌ba40预防后攻毒产气荚膜梭菌，小鼠il-1β、il-6、tnf-α、iga、igg、siga、dao、dla含量均无显著变化(p>0.05)；与产气荚膜梭菌感染组相比，益生菌ba40预防后攻毒产气荚膜梭菌小鼠il-1β、il-6、tnf-α、iga、igg、siga、dao、dla含量均显著变化(p<0.05)。表7.本发明实施例3对小鼠肠道绒毛高度和隐窝深度影响项目对照组感染组pb6+感染组ba40+感染组绒毛高度，μm410.25210.3397.85415.36隐窝深度，μm80.3120.3379.6875.44绒隐比5.111.754.995.51由表7和对应肠道he染色、扫描电镜和透射电镜图图4可知，与对照组相比，益生菌ba40预防后攻毒产气荚膜梭菌，小鼠绒毛高度、隐窝深度和绒隐比均无显著变化(p>0.05)；与产气荚膜梭菌感染组相比，益生菌ba40预防后攻毒产气荚膜梭菌小鼠绒毛高度、隐窝深度和绒隐比均显著变化(p<0.05)。综上所述，我们可得知：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌ba40具有抑制产气荚膜梭菌的能力，同时其益生菌制剂可以有效预防小鼠感染产气荚膜梭菌，提高其机体抗病能力，同时维持肠道免疫和肠道形态能力。当前第1页12