用于检测外周T细胞淋巴瘤相关基因突变的数字PCR试剂盒及引物和探针的制作方法

用于检测外周t细胞淋巴瘤相关基因突变的数字pcr试剂盒及引物和探针
技术领域
1.本发明涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种用于检测外周t细胞淋巴瘤相关基因突变的数字pcr试剂盒及引物和探针。


背景技术：

2.淋巴瘤是全球发病率最高的血液系统恶性肿瘤，具有种类多样、分型复杂的特点。在我国癌症发病率的统计中(cancer statistics in china,2015)位列前十，年发病率达到6.78每10万人，年因病死亡率为5.21每10万人。作为异质性很强的疾病，传统的淋巴瘤分类主要依托于病理形态、免疫组化、细胞遗传学和单基因突变的检测方法，对淋巴瘤细胞来源及恶性程度进行判断。根据对淋巴瘤的认识及多参数的分类方法，大体上可以分为霍奇金淋巴瘤(hodgkin’s lymphoma,hl)和非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin’s lymphoma,nhl)两大类，后者又可以进一步根据免疫细胞来源分为如b细胞非霍奇金淋巴瘤或t细胞非霍奇金淋巴瘤等不同类别。
3.外周t细胞淋巴瘤(ptcl)是一组来源于成熟、胸腺后t细胞的罕见的异质性淋巴系统恶性疾病，ptcl的发病率在全世界有着显著的地域差异。ptcl在美国约占非霍奇金淋巴瘤(nhl)发病率的6-10％，是一组异质性淋巴瘤，绝大部分具有侵袭性的临床病程。根据最新的who 2016造血与淋巴组织肿瘤分类，ptcl包含29个亚型。ptcl发病率低，诊断困难，即使在发达国家也存在极高的误诊率。中国ptcl约占非霍奇金淋巴瘤(nhl)的25％-30％，显著高于欧美国家的10％-5％。生物学行为和临床呈现高度的异质性和侵袭性，病情发展迅速，缺乏高效、特异的治疗手段，预后较差。根据who分型(2016年)可以将ptcl氛围至少29种亚型，其中最为常见的是外周t细胞淋巴瘤-非特指型(ptcl-nos)、血管免疫母t细胞淋巴瘤(aitl)、间变大细胞淋巴瘤(alcl、nk/t细胞淋巴瘤(enkl)和成人t细胞淋巴瘤/白血病(atll)。根据不同的ptcl的亚型，在临床上也有着不同的临床特征、遗传学改变和治疗反应，因此给临床诊断和治疗带来了极大的困难。
4.初治ptcl最常用的一线治疗方案为chop(环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松)和chop样方案。但是除alk
+
alcl外，整体治疗发难对其他病理亚型的治疗疗效均较差，5年的生产率仅为30％。针对这类具有难治复发潜能的患者，需要在chop方案的基础上，或治疗达到缓解后，尽早采取自体造血干细胞移植，改善部分患者的长期预后。但是多数患者因未能取得缓解或体能情况等原因无法接受造血干细胞移植。对于复发或难治性ptcl，我国根据2018年版西达本胺治疗外周t细胞淋巴瘤中国专家共识建议使用组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，hdac)抑制剂联合传统化疗方案，并已在ptcl治疗中取得了显著的成果，目前我国药品监督管理局(nmpa)批准了新型hdac抑制剂西达本胺(chidamide，爱谱沙)的上市使用。
5.由于ptcl组织学分类的复杂性，给临床判断带来了极大的挑战。组织活检可以使临床表现不典型的ptcl患者获得确诊，但是对病理医师的经验以及密切结合患者临床信息
对准确诊断和分型有着较高要求。随着生物学技术的发展，淋巴瘤的诊断并不限于病理形态学(morphology)和免疫表型学(immunophenotype)，细胞遗传学(cytogenetics)和分子生物学(molecular biology)检测在诊断和分子分型中正逐渐开始发挥越来越重要的作用，形成了淋巴瘤的micm分型体系。不仅能够有助于更好的区分ptcl各个亚型，也为基于分子学异常的个体靶向治疗奠定了理论基础。
6.rhoa是小g蛋白的ras超家族中rho亚家族的一个重要成员，是重要的细胞内信号分子，通过其催化活性来调节肌动蛋白的聚集和收缩，在肿瘤迁移和侵袭中发挥重要作用。rhoa基因编码区第50位碱基g突变成了t，是导致其蛋白发生了一个gly-val的转变(rhoa g17v)。在常见的ptcl亚型中，如ptcl-nos和aitl/ptcl-tfh中，rhoa g17v都是显著常见的分子生物学改变，特别是在aitl中为常见的重现性基因突变占比高达近45％。针对血管免疫细胞性t细胞淋巴瘤(aitl)和其他外周t细胞淋巴瘤(ptcl)的患者预后极差，对rhoag17v位点进行检测分析将对患者治疗方案的选择起到重要的意义。
7.异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，idh)是参与细胞能量代谢的三羧酸循环中的限速酶，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-kg)及co2。人体中有3种idh酶，分别是细胞质中的nadp-idh1，线粒体中的nadp-idh2和线粒体中的nad-idh3。其中，idh1/2是人类癌症中代谢基因(metabolic genes)发生突变频率最高的，并干扰细胞新陈代谢和表观遗传调控，从而促进肿瘤发生。肿瘤细胞中idh突变(idh1m和idh2m)会导致其正常功能缺失，并将α-kg转化为致癌代谢物2-羟基戊二酸(2hg)，2hg在突变的肿瘤细胞中累积，导致dna或组蛋白过甲基化。idh2基因突变时aitl中常见的重现性基因突变，占比达到25％。
8.近年来，高通量测序结果表明，60％-70％的aitl具有rhoa g17v突变，而在ptcl-nos中rhoa g17v的发生率不足20％，alcl及enkl中不具有rhoa g17v突变。rhoa g17v的出现，为aitl的诊断和鉴别诊断提供了有力的工具。此外20-30％的idh2 r172突变，而ptcl-nos及其他外周t细胞不具有此突变。因此，rhoa g17v、idh r172突变的检测有助于aitl的诊断与鉴别诊断。
9.目前，临床中多采用二代测序技术对淋巴瘤患者生物学样本进行靶向基因检测，以选择最适治疗方案、实现精准化治疗。但是，经济成本高、检测周期长成为二代测序技术服务于淋巴瘤患者特别是难治复发的外周t细胞淋巴瘤患者的临床用药指导的绊脚石。特别是在外周t细胞淋巴瘤中aitl预后具有很强的异质性。所以早期预测患者的对于一线治疗的反应以及监测疾病的早期复发对于判断患者预后、及时调整治疗策略至关重要。近年来，使用循环肿瘤dna进行疗效监测已成为监测肿瘤治疗疗效的重要手段。因此，本试剂盒拟通过提取循环肿瘤dna，检测ptcl中rhoa g17v、idh2 r172突变，负责ptcl的诊断与鉴别诊断，同时对于具有检测阳性的患者，进行突变的动态监测，及时进行疗效判断，实现低成本、高精度的快速检测技术对于外周t细胞淋巴瘤患者实现精准监测、指导临床用药有着非常重要的价值。
10.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

11.本发明的首要发明目的在于提供一种用于检测外周t细胞淋巴瘤相关基因突变的
数字pcr试剂盒。
12.本发明的第二发明目的在于提供该试剂盒的使用方法。
13.本发明的第三发明目的在于提供用于检测外周t细胞淋巴瘤相关基因突变的引物和探针。
14.为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：
15.本发明提出一种用于检测外周t细胞淋巴瘤相关基因突变的数字pcr试剂盒，所述试剂盒中含有pcr扩增试剂和对照品，所述pcr扩增试剂中含有用于检测突变位点rhoa g17v和idh2-r172的引物和探针，优选的，所述引物的序列如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:5、seq id no:6所示；所述探针的序列如seq id no:3、seq id no:4、seq id no:7～seq id no:10所示。
16.本发明还提出该数字pcr试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：
17.s1、样品处理：采用商业化提取试剂盒对样品进行提取，得到样品处理液；
18.s2、配制数字pcr反应混合液：将所述数字pcr反应液与所述样品处理液混合，得到数字pcr反应混合液；优选的，所述数字pcr反应液与所述样品处理液的体积比为6:14；
19.s3、将所述数字pcr反应混合液和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴，封膜，然后进行数字pcr扩增反应；
20.s4、读取荧光信号：将扩增后的96孔板置于微滴读取仪中，利用软件直接进行结果读取和分析；按照泊松分布原理自动计算获得ddpcr反应体系内rhoa g17v、idh2-r172位点的突变的拷贝数。
21.本发明还提出一种采用数字pcr检测检测外周t细胞淋巴瘤相关基因突变的引物和探针，包括用于检测突变位点rhoa g17v和idh2-r172的引物和探针，优选的，所述引物的序列如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:5、seq id no:6所示。
22.本发明至少具有以下有益的效果：
23.本发明的试剂盒采用数字pcr技术，对人类rhoa g17v和idh2-r172等突变进行定量检测。外周t细胞淋巴瘤(ptcl)是一组来源于成熟、胸腺后t细胞的罕见的异质性淋巴系统恶性疾病且绝大部分具有侵袭性的临床病程。ptcl发病率低，诊断困难，即使在发达国家也存在极高的误诊率。在中国，ptcl的最常见亚型包括外周t细胞淋巴瘤非特指型(ptcl-nos)、血管免疫母t细胞淋巴瘤(aitl)、结外nk/t细胞淋巴瘤(enkl)，鼻型以及间变大细胞淋巴瘤等。aitl一种独特的外周t细胞淋巴瘤亚型，其具有独特的临床病理特征，在临床实践中，aitl的诊断困难，特别是与良性的反应性淋巴结增生、其他类型的淋巴瘤的鉴别具有一定的困难。近年来，高通量测序结果表明，60％-70％的aitl具有rhoa g17v突变，而在ptcl-nos中rhoa g17v的发生率不足20％，alcl及enkl中不具有rhoa g17v突变。rhoa g17v的出现，为aitl的诊断和鉴别诊断提供了有力的工具。此外20-30％的idh2r172突变，而ptcl-nos及其他外周t细胞不具有此突变。因此，rhoa g17v、idh r172突变的检测有助于aitl的诊断与鉴别诊断。为临床医生对外周t细胞淋巴瘤患者实现精准监测、指导临床用药提供参考。
附图说明
24.图1为检测过程中的界面示意图。
具体实施方式
25.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
26.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
27.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.本发明实施例提出一种用于检测外周t细胞淋巴瘤相关基因突变的数字pcr试剂盒，含有pcr扩增试剂和对照品，pcr扩增试剂中含有用于检测突变位点rhoa g17v和idh2-r172的引物和探针，
29.作为本发明实施例的一个具体实施方式，引物的序列如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:5、seq id no:6所示；探针的序列如seq id no:3、seq id no:4、seq id no:7～seq id no:10所示。
30.其中，探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团，荧光报告基团选自vic或fam，荧光淬灭基团选自mgb；优选的，seq id no:3、seq id no:7的5’端连接有vic，seq id no:4、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10的5’端连接有fam。
31.具体如表1所示：
32.表1：
33.名称编号5'-3'核苷酸序列修饰rhoa g17v-forward primerseq id no:1atggctgccatccggaag—rhoa g17v-reverse primerseq id no:2agttctcaaacactgtgggc—rhoa g17v-probe wtseq id no:3agcctgtggaaagacatg5
’‑
vic；3'-mgbrhoa g17v-probe g17vseq id no:4agcctgtgtaaagacatg5
’‑
fam；3'-mgbidh2-r172-forward primerseq id no:5agcccatcatctgcaaaaac—idh2-r172-reverse primerseq id no:6ccttgtactgcagagacaaga—idh2-r172-probe wtseq id no:7caccattggcaggcacgc5
’‑
vic；3'-mgbidh2-r172-probe r172kseq id no:8caccattggcaagcacgc5
’‑
fam；3'-mgbprobe r172mseq id no:9caccattggcatgcacgc5
’‑
fam；3'-mgbprobe r172wseq id no:10caccattggctggcacgc5
’‑
fam；3'-mgb
34.作为本发明实施例的一个具体实施方式，引物的浓度为0.17～0.5μmol/l，优选为0.35μm；探针的浓度为0.12～0.24μmol/l，优选为0.18μm。
35.作为本发明实施例的一个具体实施方式，阳性对照为含有seq id no:15～seq id no:20所示的片段化质粒标准品；片段化质粒标准品的核苷酸序列如表2所示：
36.表2
[0037][0038][0039]
阴性对照为无核酸酶水。
[0040]
作为本发明实施例的一个具体实施方式，试剂盒所适用的样本选血浆标本或石蜡标本。
[0041]
本发明实施例还涉及该数字pcr试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：
[0042]
s1、样品处理：采用商业化提取试剂盒对样品进行提取，得到样品处理液；
[0043]
s2、配制数字pcr反应混合液：将数字pcr反应液与所述样品处理液混合，得到数字pcr反应混合液；优选的，数字pcr反应液与所述样品处理液的体积比为6:14；
[0044]
s3、将数字pcr反应混合液和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴，封膜，然后进行数字pcr扩增反应；
[0045]
s4、读取荧光信号：将扩增后的96孔板置于微滴读取仪中，利用软件直接进行结果读取和分析；按照泊松分布原理自动计算获得ddpcr反应体系内rhoa g17v和idh2-r172位点的突变的拷贝数。
[0046]
其中，数字pcr扩增反应的条件为：首先在95℃条件下保温9～11min；然后94℃保温13～16sec、58℃保温58～60sec，共进行39～41个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃停止反应；
[0047]
优选的，首先在95℃条件下保温10min；然后94℃保温15sec、58℃保温60sec，共进行40个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃停止反应；
[0048]
更优选的，升降温的速度≤2℃/s。
[0049]
本发明实施例还涉及一种采用数字pcr检测检测外周t细胞淋巴瘤相关基因突变的引物和探针，包括用于检测突变位点rhoa g17v和idh2-r172的引物和探针，
[0050]
优选的，引物的序列如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:5、seq id no:6所示。
[0051]
优选的，探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团，荧光报告基团选自vic或fam，荧光淬灭基团选自mgb。
[0052]
进一步优选的，seq id no:3、seq id no:7的5’端连接有vic，seq id no:4、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10的5’端连接有fam。
[0053]
实施例1
[0054]
试剂盒的组成如表3所示：
[0055]
表3
[0056][0057]
适用仪器：qx200 droplet digital pcr系统(美国biorad公司)。
[0058]
样本要求：适用于从血浆标本中提取的人类基因组游离dna(cfdna)或石蜡标本中提取的人类基因组dna的检测。
[0059]
阳性判断值或者参考区间：对10ng基因组dna可测到1
‰
rhoa g17v和2
‰
idh2-r172基因突变。
[0060]
检验方法：
[0061]
1.样本处理：
[0062]
自行进行核酸提取(推荐使用商业化的试剂盒来提取dna)，以此作为pcr反应模板。提取完的核酸建议立即进行检测，否则于-20℃以下保存。
[0063]
2.扩增试剂准备及加样：
[0064]
a.从试剂盒中取出相应的反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的pcr预混液：4μl混合液ddpcr+10μl 2
×
ddpcr mix3，将上述配制好的pcr预混液，分别按每管14μl的量，分装于各pcr管内。
[0065]
b.基因组dna模板浓度测定(qubit测定)好后，用水稀释至2ng/μl，取模板6μl加至装有上述pcr预混液的pcr管中。
[0066]
c.每个反应体系的总体积为20μl。
[0067]
d.盖紧pcr管盖，振荡混匀20s以上，瞬时离心后进行微滴制备.
[0068]
3.制备微滴：
[0069]
a.将8个20μl反应体系加入到dg8 cartridge中间一排的8个孔内。
[0070]
注意：1)必须先在dg8 cartridge中间1排加样品(若样品不足8个时，空孔请加入20μl bx ddpcr buffer control；加样前将移液枪调制20μl示数，取样时吸取管中所有液体)。
[0071]
2)加样本时，避免产生气泡，如有肉眼可见气泡，可用一洁净枪头戳破气泡。
[0072]
b.在dg8 cartridge最底一排8个孔中各加入70μl droplet generation oil，盖上胶垫(gasket)，将dg8 cartridge轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2min之内完成。
[0073]
c.微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴(大约为35～45μl)转移到96孔板中。
[0074]
5.封膜
[0075]
微滴转入96孔板内后，用预热好的px1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5sec，无需颠倒方向二次封膜；封好膜之后应该在30min内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行pcr。
[0076]
6.pcr扩增：
[0077]
95℃，10min；(94℃，15sec；58℃，60sec)40个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为40μl，注意升降温速度≤2℃/s。
[0078]
7.微滴读取：
[0079]
a.先打开电脑，再打开droplet reader电源，在使用前需预热至少30min；
[0080]
b.将之前完成pcr的96孔板放入plate holder，平稳放入微滴读取仪中。
[0081]
c.打开quantasoft软件，对96孔板中样品信息进行setup，完成后即可进行run。注意：1)supermix选择“ddpcr supermix for probes”[0082]
2)dye set选择“fam/vic”[0083]
8.结果分析：
[0084]
检测完成后，点击“2d amplitude”查看通道1和通道2聚类图。此图允许手工或自动调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。
[0085]
点击“auto analyze”重设阈值；
[0086]
手工指定阈值：
[0087]
使用阈值十字线指定整个点图的分类区域(仅在热图模式下可选)；
[0088]
使用椭圆，矩形或套索阈值调节工具来分类点图区域：点击相应工具按钮，然后在“working cluster selector”点击区域类型，使用工具选择相应区域。界面示意图如图1所
示：
[0089]
注意：荧光阈值线的设置参照阴性对照和阳性对照：在2d amplitude中，荧光阈值线的位置应该使阴性对照的微滴簇在“ch1-ch2
‑”
区间内，阳性对照的4种微滴簇分别位于四个区间内。
[0090]
检验结果的解释：
[0091]
8.1对于rhoa g17v检测位点而言：
[0092]
1、有效性判定：
[0093]
1)阴性对照有效性判定：“ch1+”区的点＜5个且落在“ch2+”区的点＜5个。
[0094]
2)阳性对照有效性判定：突变比例≥1
‰
且落在“ch1+ch2
‑”
区的点≥5个且突变比例≥1
‰
。
[0095]
3)无效结果的判定：每个反应管的total微滴数应≥8000，若total微滴数＜8000，该反应孔的微滴生成则不理想，需重新进行微滴生成。
[0096]
2、结果判定：
[0097]
2.1定性判定
[0098]
(1)若样本落在“ch1+ch2
‑”
区的点≥5个且突变比例≥1
‰
，则判定rhoa位点突变。
[0099]
(2)如不符合(1)，
[0100]
①
若样本dna≥50拷贝
[0101]
a.若样本落在“ch1+ch2
‑”
区的点为0个或突变比例＜1
‰
，则判定rhoa位点无突变或突变低于最低检测限值。
[0102]
b.若样本落在“ch1+ch2
‑”
区的点为1～4个，且突变比例≥1
‰
，则判定rhoa位点突变疑似阳性，需重新检测。重新检测的结果，若样本落在“ch1+ch2
‑”
区的点≥5个且突变比例≥1
‰
，则判定rhoa位点突变。反之，判定rhoa位点无突变或突变低于最低检测限值。
[0103]
②
若样本dna＜50拷贝，则提示加入的dna质量不佳或者含有pcr抑制剂，需要重新提取dna后或重新取样后再做。重新检测后，样本dna《50拷贝且不符合(1)，则判定dna质量不符合要求。反之，按上述条件进行相应判定。
[0104]
8.2对于idh2-r172检测位点而言：
[0105]
1、有效性判定：
[0106]
1)阴性对照有效性判定：“ch1+”区的点＜4个且落在“ch2+”区的点＜4个。
[0107]
2)阳性对照有效性判定：突变比例≥2
‰
且落在“ch1+ch2
‑”
区的点≥4个且突变比例≥2
‰
。
[0108]
3)无效结果的判定：每个反应管的total微滴数应≥8000，若total微滴数＜8000，该反应孔的微滴生成则不理想，需重新进行微滴生成。
[0109]
2、结果判定：
[0110]
2.1定性判定
[0111]
(1)若样本落在“ch1+ch2
‑”
区的点≥4个且突变比例≥2
‰
，则判定idh2-r172位点突变。
[0112]
(2)如不符合(1)，
[0113]
①
若样本dna≥50拷贝
[0114]
a.若样本落在“ch1+ch2
‑”
区的点为《3个或突变比例＜2
‰
，则判定idh2-r172位点
无突变或突变低于最低检测限值。
[0115]
b.若样本落在“ch1+ch2
‑”
区的点为3个，且突变比例≥2
‰
，则判定idh2-r172位点突变疑似阳性，需重新检测。重新检测的结果，若样本落在“ch1+ch2
‑”
区的点≥4个且突变比例≥2
‰
，则判定idh2-r172位点突变。反之，判定idh2-r172位点无突变或突变低于最低检测限值。
[0116]
②
若样本dna＜50拷贝，则提示加入的dna质量不佳或者含有pcr抑制剂，需要重新提取dna后或重新取样后再做。重新检测后，样本dna《50拷贝且不符合(1)，则判定dna质量不符合要求。反之，按上述条件进行相应判定。
[0117]
2.2定量判定
[0118]
若样本rhoa g17v和idh2-172位点突变，可按ch1/(ch1+ch2)公式进行突变百分比计算。
[0119]
实验例1引物筛选试验
[0120]
按一般原则配制引物探针反应液，在每一需要检测的位点上先配制20人份小样进行预实验。核苷酸序列如表4所示：
[0121]
表4
[0122][0123][0124]
根据rhoa g17v位点配制表5的组分。再将引物f1/r2，f2/r1，f2/r2进行替换表1中的f1/r1进行实验，使用通过其他检测方法如ngs测序获得的已知突变频率的标准品进行微滴反应试验来比较各引物搭配之间的好坏，选择最优搭配方案。
[0125]
表5：rhoa g17v反应液
[0126]
名称浓度1人份20人份rhoa-g17v-f150μm0.18μl3.6μlrhoa-g17v-r150μm0.18μl3.6μlrhoa-g17v-wt-probe50μm0.05μl0.1μlrhoa-g17v-mt-probe50μm0.07μl0.14μlte 3.52μl70.4μltotal 4μl80μl
[0127]
rhoa g17v引物筛选试验结果如表6～表9所示：
[0128]
表6：rhoa g17v f1/r1引物筛选试验结果
[0129][0130]
表7：rhoa g17v f1/r2引物筛选试验结果
[0131][0132]
表8：rhoa g17v f2/r1引物筛选试验结果
[0133][0134][0135]
表9：rhoa g17v f2/r2引物筛选试验结果
[0136][0137]
通过表6至表9所示微滴读取结果可以看出，rhoa g17v f1/r1引物混合的反应液对于阳性标准品突变率检测出的准确性最高，且在阴性样本中有着较好的检测特异性，同时未发现非特异性的突变点数(ch1+ch2-点数)。
[0138]
根据相同的方法，分别对检测位点idh2 r172位点根据表10所示的常规反应液配比进行了20人份小样试剂的配制，再将引物f1/r2，f2/r1，f2/r2进行替换表中的f1/r1进行
实验，比较各引物之间的好坏，根据相同的标准选择最优搭配。
[0139]
表10：idh2 r172反应液
[0140]
引物/探针浓度1人份20人份idh2-172-f250μm0.24idh2-172-r250μm0.24idh2-r172k-probe50μm0.12idh2-r172w-probe50μm0.12idh2-r172m-probe50μm0.12idh2-172-wt-probe50μm0.12te 3.264总量(μl) 480
[0141]
idh2 r172引物筛选试验结果表11～14所示：
[0142]
表11：idh2 r172 f1/r1引物筛选试验结果
[0143][0144]
表12：idh2 r172 f1/r2引物筛选试验结果
[0145][0146]
表13：idh2 r172 f2/r1引物筛选试验结果
[0147][0148]
表14:idh2 r172 f2/r2引物筛选试验结果
[0149][0150]
通过观察微滴读取结果可以看出(表11至14)，idh2 r172f2/r2引物混合的反应液对于阳性标准品突变率检测出的准确性最高，且在阴性样本中有着较好的检测特异性，同时未发现非特异性的突变点数(ch1+ch2-点数)，可作为选择进行预实验的配制方案。
[0151]
实验例2:引物浓度筛选实验及结果
[0152]
引物浓度和探针浓度在整个pcr反应中是相互关联的，因此选用了这两种因素对稀释至10％的质粒参考品进行交叉实验对pcr反应体系进行优化。
[0153]
表15:rhoa g17v引物浓度和探针浓度试验结果
[0154][0155][0156]
以上实验结果表明，在节约原材料及保证检测准确性的前提下引物浓度0.35μm，探针浓度为0.18μm的组合为最有效的检测搭配。表明了在拷贝数不受影响的前提检测出的突变率与参考品一致。同理对idh2-r172位点也进行了相应的实验，结果一致。根据此配制方案进行灵敏度、准确性、稳定性等试验。
[0157]
实验例3 检测限实验
[0158]
根据上述引物筛选试验最终确定的配方配制中样，进行检出限等试验。检测灵敏度的确定和依据选取含有突变的质粒参考品按一定比例与野生的质粒混合，以确定反应液突变率的参考值。以rhoa g17v位点为例，其检测结果如表16所示：
[0159]
表16：rhoa g17v检测限设定试验结果
[0160][0161]
通过观察微滴读取结果可以看出，btk c481s反应液对于突变率大于等于0.1％的样本仍然可以检出。但是在0.1％～0.2％的范围内，定量结果与预期突变率出现了较大偏差；当突变率降到0.1％以下时，检测结果容易出现漏检(如阴性被检测出)。因此将定性检测范围定为≥0.1％。以此相同的方法分别对idh2 r172位点进行了相同检测灵敏度确定试验，这两基因突变位点的突变检测范围都定为≥0.2％。
[0162]
检测限的检测结果：根据以上实验结果，采用rhoa g17v突变比例为确定的检测限，重复20次，检测结果如表17所示：
[0163]
表17：rhoa g17v检测限结果
[0164][0165]
由以上结果可以看出，在95％的置信区间的条件下，使用rhoa g17v检出限参考品
(突变率＝0.1％)进行实验，重复20次的实验结果的阳性符合率为100％，显示为有效的检测灵敏度。以此相同的方法分别对idh2 r172位点进行了相同确定实验，所有位点的阳性符合率都为100％。
[0166]
实验例4 准确度实验及结果
[0167]
选用4例临床检测rhoa g17v为阳性的临床dna样本，进行检测实验并与经过高通量测序方法检测为阳性的突变率进行比较。检测结果如表18所示：
[0168]
表18：rhoa g17v临床样本准确性实验结果
[0169][0170]
根据结果可知，lyz、hqs、和hdy的样本呈现rhoa g17v阳性，突变率分别为24.8％、13.6％、和29.8％，结果与经过ngs检测计算出的频率相一致。为了进一步确认其突变比率的正确性，进行了二次相同重复实验，结果与第一次结果相一致，排除了操作误差会给结果带来不准确性的可能。
[0171]
同理，分别选用了临床检测idh1 r132和idh2 r172阳性的样本共5例进行了检测，结果与经过ngs检测计算出的频率相一致，每组实验重复了三次以确保实验误差对结果的影响。
[0172]
实验例5:特异性实验及结果
[0173]
选取rhoag17v和idh2 r172经高通量测序检测为阴性的临床dna样本分别使用上述3个位点的反应液进行检测。rhoa g17v反应液实验结果如表19所示。
[0174]
表19：rhoa g17v反应液特异性结果
[0175][0176]
以上结果显示：rhoa g17v反应液检测阴性的样本结果均为阴性，提示该反应液特异性好。以此相同的方法分别idh2 r172位点进行了相同确定实验，所有位点的检测结果都为阴性。
[0177]
本技术虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本技术构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本技术的保护范围应当以本技术权利要求所界定的范围为准。