一种牦牛皮胶/PMVE-MA复合材料及其制备方法和用途

本发明属于复合材料领域，具体涉及一种牦牛皮胶/pmve-ma复合材料及其制备方法和用途。

背景技术：

近年来，复合支架材料成为医学组织工程领域的研究热点，与传统金属和高分子材料相比，天然生物材料具有可降解、降解产物无毒性、良好的生物相容性等特点，是制备可降解性组织工程支架材料的主要原料。动物明胶作为一种天然生物材料，已广泛应用于组织工程领域。甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物(pmve-ma)是一类经fda批准的酸苷聚合物，其优势是生物降解性和低毒性，已在伤口愈合方面的研究中得到应用，还被用于包裹胶囊药物以增强生物粘附性。因此，将明胶与pmve-ma复合制成复合材料，探索其性能以及在组织工程领域的应用，将为组织工程材料领域提供新的选择。

hemlatachhabra^[1]等人成功制备了一种明胶/pmve-ma的复合支架，尽管该支架的溶血率较低，然而其吸水溶胀程度很高，最高达到了1200％。过高的溶胀比意味着过量的水分进入支架内部，不仅会对支架产生由内向外的压力，使其孔径增大，结构崩塌，机械强度降低，降解速率加快，还会对初期黏附于支架表面的细胞产生“冲刷”作用，造成黏附细胞的脱落，进而影响组织的新生；而且，该支架力学强度较低，压缩模量在50mpa以下，容易被破坏，难以支撑损伤部位。

牦牛皮胶是以牦牛皮为原料提取出的一种含有丰富营养成分的明胶，由于牦牛生长条件不同于其他动物，因此提取自青藏高原牦牛的牦牛皮胶不仅含有更丰富的营养物质，其热稳定性也远高于其他动物明胶。牦牛皮是肉类加工的废物，只有其中的少数被用来制造成皮革制品，大多数牦牛皮通常都被丢弃，其中的高含量蛋白质没有得到有效利用，造成了严重的资源浪费和环境污染，若能将其应用于组织工程领域，不仅能够减少对环境的污染，其中的营养成分也能被充分利用。

因此，研究一种以牦牛皮胶为基体的组织工程材料，将具有巨大优势和重要的经济价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种牦牛皮胶/pmve-ma复合材料。

本发明提供了一种牦牛皮胶/pmve-ma复合材料，它由牦牛皮胶和pmve-ma复合而成；所述牦牛皮胶和pmve-ma的质量比为(4～8):1，优选为6:1。

进一步地，上述复合材料的溶血率不高于5％，优选为0.1％～1.6％。

进一步地，上述复合材料的压缩模量不低于300mpa，优选为391～468mpa。

进一步地，上述复合材料的最大溶胀度不高于100％，优选为54％～72％。

更进一步地，上述的复合材料是由牦牛皮胶和pmve-ma按比例共混，预冷冻并冻干后，在hmdi溶液中浸泡所得。

更进一步地，上述共混是：牦牛皮胶和pmve-ma按比例混合，在37～55℃搅拌1～4小时；和/或上述预冷冻是：在-50℃～-100℃冷冻；和/或上述浸泡是：在hmdi溶液中浸泡1～3小时；优选地，所述hmdi溶液质量浓度为10％。

本发明提供了上述复合材料的制备方法，包括如下步骤：牦牛皮胶和pmve-ma按比例共混，预冷冻并冻干后，在hmdi溶液中浸泡。

进一步地，上述制备方法包括如下步骤：

(1)牦牛皮胶的溶液和pmve-ma的溶液按比例混合；

(2)在37～55℃下搅拌2～3小时得混合溶液；

(3)混合溶液在-50℃～-100℃预冷冻后进行冻干；

(4)冻干后的支架材料在hmdi溶液中浸泡1～3小时。

所述牦牛皮胶的溶液优选为牦牛皮胶的乙醇溶液；pmve-ma的溶液优选为pmve-ma的乙醇溶液；所述hmdi溶液浓度优选为10％。

本发明还提供了上述的复合材料在体内植入材料中的应用，优选为在组织工程支架中的应用。

实验结果表明，本发明的牦牛皮胶/pmve-ma复合材料溶胀度和力学性能优异，降解速率可满足支架材料植入体内的时间要求，微观结构满足细胞粘附生长的条件，而且具有低溶血率，作为组织工程支架材料具有极佳的潜力。

本发明所述pmve-ma指：甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物；hmdi指：六亚甲基二异氰酸酯。本发明所述最大溶胀度是指吸水溶胀后的复合材料质量不随时间变化出现统计学意义上的显著变化时的溶胀度。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：成分配比(牦牛皮胶：pmve-ma的质量比)对支架材料溶血率的影响(*表示样品材料的差异显著性，#表示对照品材料的差异显著性*或#表示p<0.05，差异显著；**或##表示p<0.01，差异极显著)。

图2：搅拌温度对支架材料溶血率的影响(*表示样品材料的差异显著性，#表示对照品材料的差异显著性*或#表示p<0.05，差异显著；**或##表示p<0.01，差异极显著)。

图3：搅拌时间对支架材料溶血率的影响(*表示样品材料的差异显著性，#表示对照品材料的差异显著性*或#表示p<0.05，差异显著；**或##表示p<0.01，差异极显著)。

图4：预冻温度对支架材料溶血率的影响。

图5：hmdi浸泡时间对支架材料溶血率的影响。

图6：配比和搅拌温度交互作用的等高线和响应面。

图7：配比和搅拌时间交互作用的等高线和响应面。

图8：搅拌温度和搅拌时间交互作用的等高线和响应面。

图9：复合支架材料的微观结构图。

图10：复合支架材料在不同时间的溶胀度(a)和降解率(b)变化。

具体实施方式

材料与试剂：

牦牛皮胶(实验室自制，制备方法参照“xum,weil,xiaoy,etal.molecularstructuralpropertiesofextractedgelatinfromyakskinasanalysedbasedonmolecularweight[j].internationaljournaloffoodproperties,2017:10942912.2017.1300813.”所公开的方法)；pmve-ma(北京伊诺凯科技有限公司)；冰乙酸(分析纯，上海广诺化学科技有限公司)；生理盐水(山东华鲁制药有限公司)；pbs(北京索莱宝科技有限公司)；hmdi(北京伊诺凯科技有限公司)；异丙醇(分析纯，上海广诺化学科技有限公司)。

仪器与设备：

电子天平(al105，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；加热型磁力搅拌器(加热型1ea，北京赛欧华创科技有限公司)；冷冻干燥机(fd-1a-80+，北京博医康实验仪器有限公司)；超低温冰箱(dw-hl398s，美菱)；自动纯水机(uph-i-40l，四川优普超纯科技有限公司)；多功能酶标仪(perineimerenspire公司)；台式高速冷冻离心机(sigma3-18ks，)；数显恒温水浴锅(hh-8，邦西仪器科技(上海)有限公司)；微机控制电子万能试验机(c45.105)；扫描电子显微镜(日立su8010)。

实施例1、本发明牦牛皮胶/pmve-ma复合支架的制备

用0.5mol/l乙酸溶液分别溶解配制牦牛皮胶溶液(8％w/v)和pmve-ma溶液(1.33％w/v)，两种溶液以1:1比例混合(牦牛皮胶：pmve-ma质量比6：1)，在41℃下进行磁力搅拌3.85h，将搅拌后的混合溶液倒入合适的模具，在-80℃条件下冷冻24h后进行冷冻干燥，冷冻干燥后的材料样品在10％hmdi(以异丙醇配制)溶液中浸泡2h后用异丙醇清洗两遍，待异丙醇自然挥干，再用纯水清洗三遍即得。

实施例2、本发明牦牛皮胶/pmve-ma复合支架的制备

用0.5mol/l乙酸溶液分别溶解配制牦牛皮胶溶液(8％w/v)和pmve-ma溶液(1％w/v)，两种溶液以1:1比例混合(牦牛皮胶：pmve-ma质量比8：1)，在55℃下进行磁力搅拌4h，将搅拌后的混合溶液倒入合适的模具，在-50℃条件下冷冻24h后进行冷冻干燥，冷冻干燥后的材料样品在10％hmdi(以异丙醇配制)溶液中浸泡3h后用异丙醇清洗两遍，待异丙醇自然挥干，再用纯水清洗三遍即得。

实施例3、本发明牦牛皮胶/pmve-ma复合支架的制备

用0.5mol/l乙酸溶液分别溶解配制牦牛皮胶溶液(8％w/v)和pmve-ma溶液(2％w/v)，两种溶液以1:1比例混合(牦牛皮胶：pmve-ma质量比4：1)，在37℃下进行磁力搅拌1h，将搅拌后的混合溶液倒入合适的模具，在-100℃条件下冷冻24h后进行冷冻干燥，冷冻干燥后的材料样品在10％hmdi(以异丙醇配制)溶液中浸泡1h后用异丙醇清洗两遍，待异丙醇自然挥干，再用纯水清洗三遍即得。

以下通过实验例证明本发明复合材料的有益效果。

实验例1、本发明牦牛皮胶/pmve-ma的单因素试验筛选

1、浓度配比(牦牛皮胶：pmve-ma)对支架材料溶血率的影响

在搅拌时间2h，搅拌温度20℃，预冻温度为-80℃，10％hmdi浸泡时间2h的条件下，测定牦牛皮胶与pmve-ma配比为1:1，1:2，2:1，4:1时复合支架材料的溶血率，确定两种成分的最佳配比(配比指质量比)。

图1表明，没有pmve-ma聚合物成分的对照品材料溶血率最低，且低于5％，可视为该材料不引起溶血反应。添加pmve-ma聚合物后，除成分配比为4:1的材料外，其他配比的材料溶血率均有显著升高，其中二者浓度配比为1:1时，材料溶血率达到最高，且远高于5％，成分配比为1:2和2:1时，材料的溶血率明显低于浓度配比为1:1的材料，但仍高于5％，即视为会引起溶血反应。聚合物pmve-ma的添加导致支架材料的两种主要成分间发生反应，进而对复合支架材料的溶血率产生影响，溶血率测定结果表明，较高浓度的pmve-ma将对材料溶血率产生一定影响，而低浓度pmve-ma的添加对支架材料溶血率无明显影响。因此，选取牦牛皮胶与pmve-ma的最佳配比为大于4:1。

2、搅拌温度对支架材料溶血率的影响

在牦牛皮胶与pmve-ma配比4:1，搅拌时间2h，预冻温度-80℃，10％hmdi溶液浸泡时间2h的条件下，分别测定磁力搅拌温度20℃，37℃，45℃，55℃时复合支架材料的溶血率，确定最佳的磁力搅拌温度。

实验表明，搅拌温度为20℃(室温)时，牦牛皮胶与pmve-ma无法充分反应。由图2可知，支架材料制备过程中，搅拌温度对样品材料和对照品材料的影响几乎呈相反趋势，随搅拌温度升高，样品材料溶血率呈降低趋势，对照品材料溶血率呈升高趋势，但各搅拌温度下制备的支架材料溶血率均低于5％，即各搅拌温度下制备的材料均不引起溶血反应。不考虑反应不充分的搅拌温度20℃条件，搅拌温度45℃时，对照品材料和样品材料的溶血率均相对较低，与45℃条件下的对照品材料相比，55℃条件下的对照品材料溶血率显著升高，其余各温度条件下的样品和对照品材料溶血率与45℃条件下的材料溶血率均无显著性差异，但均高于搅拌温度45℃条件下制备材料的溶血率。因此，搅拌温度在37～55℃为宜，最佳搅拌温度为45℃。

3、搅拌时间对支架材料溶血率的影响

在牦牛皮胶与pmve-ma配比4:1，搅拌温度20℃，预冻温度-80℃，10％hmdi溶液浸泡时间2h的条件下，分别测定磁力搅拌时间0.5h，1h，2h，3h，4h时复合支架材料的溶血率，确定最佳的磁力搅拌时间。

实验证明搅拌时间太短可能导致牦牛皮胶与pmve-ma反应不充分，材料溶血率相对较低。实验结果如图3所示，所有材料的溶血率均低于5％，但搅拌时间为3h时，对照品和样品材料溶血率均最低，与3h的材料相比，1h对照品、样品材料及4h样品材料的溶血率均与其有极显著差异，2h样品材料与其有显著性差异。因此，搅拌时间在1～4小时为宜，最佳搅拌时间为3h。

4、预冻温度对支架材料溶血率的影响

在牦牛皮胶与pmve-ma配比4:1，搅拌时间2h，搅拌温度20℃，10％hmdi溶液浸泡时间2h的条件下，分别测定预冻温度-20℃，-80℃，-196℃时复合支架材料的溶血率，确定最佳的预冻温度。

图4显示，各预冻温度下，复合支架材料的溶血率变化不明显，溶血率均低于5％，其中在预冻温度-196℃条件下的对照品和样品材料的溶血率相对最低。根据实验情况，预冻温度-20℃时，将材料从模具转移至相应容器进行冻干的过程中，冷冻的材料样品表面容易发生融化现象，而预冻温度-196℃的条件，需将磁力搅拌后的混合溶液置于液氮环境冷冻，操作较为困难，且冷冻过程中液氮极易流入模具，与材料接触，影响材料性能。因此，预冻温度最好在-50℃～-100℃范围内。

5、hmdi浸泡时间对支架材料溶血率的影响

在牦牛皮胶与pmve-ma配比4:1，搅拌温度20℃，搅拌时间2h，预冻温度-80℃的条件下，分别测定10％hmdi溶液浸泡时间1h，2h，3h时复合支架材料的溶血率，确定最佳的浸泡时间。

由图5可知，随着10％hmdi溶液浸泡时间的延长，复合支架材料的溶血率略有升高，但材料的溶血率均在1％左右，表明浸泡时间对复合支架材料的溶血率无明显影响。因此，hmdi溶液浸泡时间为1～3h均适宜。

实验例2、响应面试验

1、方法

在单因素实验的基础上，以配比(牦牛皮胶：pmve-ma)、搅拌温度、搅拌时间为自变量，以支架材料的溶血率为响应值，采用box-behnken设计优化牦牛皮胶/pmve-ma复合支架材料制备条件实验(表1)。

表1.响应面设计因子水平表

2、结果

(1)响应面实验结果：

采用design-expert8.0.6软件进行数据处理，表2是box-behnken实验设计与结果。

表2.box-behnken实验设计与结果

(2)回归模型的建立及方差分析：

以配比(牦牛皮胶：pmve-ma)(a)、搅拌温度(b)、搅拌时间(c)为响应变量，溶血率(y)为响应值建立模型。采用design-expert8.0.6软件对表2中的数据进行多元回归分析，进行手动优化后得到溶血率对配比、搅拌温度、搅拌时间三因素的模型方程：

y＝+1.91+4.06*a+0.045*b-0.33*c-0.33*a*b-0.34*a*c-0.037*b*c+2.50*a²+0.32*b²-0.079*c²

表3的方差分析结果显示，该模型的f＝401.77，p<0.0001，模型显著性高，表明该模型可信度好。回归模型方差分析结果表明，配比和搅拌时间对材料溶血率有极显著影响，且根据f值可判断，在实验选取的各因素水平范围内，三个因素对材料溶血率影响的显著性顺序依次是：配比(a)>搅拌时间(c)>搅拌温度(b)，搅拌温度(b)对材料溶血率的影响无显著性，各因素间交互作用对溶血率的影响顺序为：ac>ab>bc，配比(a)与搅拌温度(b)之间和配比(a)与搅拌时间(c)之间的交互作用呈显著性。该模型失拟项p＝0.7064>0.05，不具有显著性，即由误差引起的失拟不显著，且r²＝0.9981，r²adj＝0.9956，均接近于1，表明模型可靠，可用于复合支架材料制备条件和溶血率的分析及预测。

表3回归模型的方差分析

(3)两因素间交互作用的响应面分析

对浓度配比、搅拌温度和搅拌时间三因素的交互作用进行分析，各因素对材料溶血率的响应面等高线图和三维图如图6-8所示。响应面能够直接反映各实验因素对材料溶血率的影响程度，响应面坡度越陡，表明该实验因素对材料溶血率的影响越大。等高线图是响应面在底面的投影，能够反映两因素间交互作用的强弱，等高线图呈椭圆形时，表明两因素间交互作用显著。图6-8结果显示，配比的响应面坡度最陡，搅拌时间次之，搅拌温度最缓，表明搅拌温度对材料溶血率的影响不明显。浓度配比和搅拌时间的交互作用对材料溶血率的影响最为显著，浓度配比和搅拌温度的交互作用次之，搅拌温度和搅拌时间的交互作用对材料溶血率影响不明显。

(4)最佳制备条件预测及验证

通过designexpert软件分析，制备牦牛皮胶/pmve-ma复合支架材料的最优工艺条件为：配比6.25:1(牦牛皮胶8％w/v，pmve-ma1.28％w/v)，搅拌温度40.84℃，搅拌时间3.88h，在该条件下，制备的复合材料溶血率理论值为0.092％。根据实际情况，将复合支架材料的制备条件修正为：配比6:1(牦牛皮胶8％w/v，pmve-ma1.33％w/v)，搅拌温度41℃，搅拌时间3.85h作为最佳工艺。

在最佳制备条件下进行三组平行验证实验，测得材料溶血率平均值为0.145％，与模型值接近，说明该模型真实可靠，可用来预测牦牛皮胶/pmve-ma复合支架材料的制备条件。

3、本发明牦牛皮胶/pmve-ma复合支架的表征

通过溶胀度、降解率、力学性能的测定和微观结构的观察，对实施例1的复合支架材料进行表征。

(1)微观结构

样品形貌如图9所示。图9(a)和(b)是同等放大倍数(标尺：300um)的纯牦牛皮胶材料和牦牛皮胶/pmve-ma复合支架材料的断面sem，由图可观察到，纯牦牛皮胶材料的断面空隙较少，空隙尺寸分布比较均匀，材料比较致密；而复合材料的断面呈现松散片层结构，含有较多不规则空隙，溶胀性能更好，利于细胞粘附和生长，且这种互通的空隙结构有利于细胞生长和增殖。

(2)溶胀度

溶胀度是支架材料的一个重要特性，良好的溶胀性能有利于细胞在支架材料上的粘附和增殖。由如下公式计算：

溶胀度＝[(ww-wd)/wd]*100％；ww指吸水溶胀后湿态支架的质量，wd是指未吸水的干态支架的质量。

图10(a)是复合支架材料在pbs溶液中浸泡1h，3h，5h，10h，12h，24h后的溶胀度变化情况，由图可知，材料溶胀度在开始浸泡的1h内迅速升高，后续时间点均略有升高，在浸泡12h以后，溶胀度趋于平稳，无明显升高趋势，此时的溶胀度即为最大溶胀度，为100％以下(71.03％)。支架材料的溶胀性能与聚合物亲水性和材料微观结构有关，由于pmve-ma本身具有良好的保水性，支架材料表现出较好的溶胀性能。结合sem观察结果，与纯牦牛皮胶材料相比，复合支架材料有较多空隙结构，可进一步促进材料发生溶胀；与hemlatachhabra^[1]等人制备的明胶/pmve-ma复合支架材料溶胀度(400％以上)相比，本研究支架材料的溶胀度明显更低。有研究报道^[2]，过高的溶胀比表示有过量水分进入支架材料内部，可能导致支架材料产生由内向外的压力，使其微观结构遭到破坏，导致力学性能降低，且有可能对细胞在支架材料的上的粘附行为产生影响。因此，本发明相比于hemlatachhabra等人制备的明胶/pmve-ma复合支架，溶胀行为具有显著的优势。

(3)降解性能

图10(b)是复合支架材料在室温条件下，在pbs溶液中浸泡1d，3d，5d，7d，10d后的质量损失率，显示了在不同时间点复合支架材料的降解程度，由图可知，材料降解率随时间推移呈逐渐增大的趋势，第10天降解率达到16.44％，即10天后仍然有73.56％的支架材料，满足支架材料植入体内的时间要求。

(4)力学性能

支架材料(干态)力学性能检测结果如表4所示。检测结果显示，牦牛皮胶/pmve-ma复合支架材料的弯曲强度与纯牦牛皮胶材料差别不大，二者具有近似的柔韧性，表明聚合物pmve-ma对复合支架材料的弯曲强度无明显影响；复合支架材料压缩强度和压缩模量明显高于纯牦牛皮胶材料，表明复合支架材料有较强的抗压能力，相比于纯牦牛皮胶材料，复合支架材料因受到聚合物与牦牛皮胶之间反应的增强效应，表现出更好的力学性能，适于作为组织工程支架材料应用。

另外，本研究制备的复合支架材料的压缩模量显著高于hemlatachhabra等人制备的明胶/pmve-ma复合支架材料(干态压缩模量低于30mpa，湿态压缩模量低于5mpa)，表明牦牛皮胶复合pmve-ma制备的支架材料在力学性能方面具有明显优势。

表4.支架材料的力学性能(n＝3)

注：*表示样品压缩强度的差异显著性

*表示p<0.05，差异显著；**表示p<0.01，差异极显著

综上，本发明提供了一种牦牛皮胶/pmve-ma复合材料，其溶胀度和力学性能优异，降解速率可满足支架材料植入体内的时间要求，微观结构满足细胞粘附生长的条件，而且具有低溶血率，作为组织工程支架材料具有极佳的潜力。

参考文献：

[1]chhabrah,guptap,vermapj,etal.gelatin–pmve/macompositescaffoldpromotesexpansionofembryonicstemcells[j].materialsscience&engineeringc,2014,37.

[2]王博蔚,马瑞,吴凡,等.氧化石墨烯-海藻酸钠-壳聚糖复合支架的制备及表征[j].高等学校化学学报,2020,41(09):2099-2106。