ssDNA核酸适配体在识别大口黑鲈虹彩病毒感染细胞中的应用

ssdna核酸适配体在识别大口黑鲈虹彩病毒感染细胞中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种ssdna核酸适配体及其应用，特别是涉及一种ssdna核酸适配在识别大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞中的应用。


背景技术：

2.大口黑鲈(micropterus salmoides)是一种纯淡水的广温性肉食性名贵鱼类，其原产于北美洲密西西比河流域,于1983年初引入我国，经过试养与人工繁殖，获得成功，成为我国重要的淡水养殖鱼类之一。据不完全统计，目前中国大口黑鲈的年产量已达到16万吨。大口黑鲈具有适应性强、生长迅速、起捕容易、养殖周期短等优点，加之肉质鲜美、营养丰富、无肌间刺、外形美观，因而深受广大养殖者和消费者们的喜欢。
3.由病毒感染引起的大口黑鲈疾病死亡率高,且难以防治,对世界范围内的大口黑鲈养殖业带来了较为严重的威胁。大口黑鲈病毒性疾病主要有虹彩病毒导致的溃疡病、脾肾坏死病等。大口黑鲈在被虹彩病毒感染后，体表会有斑块状出血性溃疡，尾柄红肿溃疡，病鱼肝脏肿大、颜色发白或发黄。
4.对于水产疫病的防控应坚持“以防为主，防治结合”的原则。病害防控的核心在于深入研究病原侵染致病的分子机理，同时针对病原发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的快速检测技术及快检试剂盒，加强养殖过程中对病害的监测，结合使用高效的抗病药物，达到及时干预、降低病原暴发几率的目的。目前我国科研人员已针对大口黑鲈虹彩病毒研发出多种检测技术，包括基于分子生物学的聚合酶链式反应技术(pcr)和环介导等温扩增技术(lamp)，以及基于抗体的免疫检测技术等，部分产品的可操作性和技术水平等均达到较高水平。其中pcr技术基于其高灵敏度和高精确度，是目前实验室中最常用的检测病原技术，但是pcr技术存在操作繁琐、仪器昂贵、检测耗时长，以及试剂保存条件苛刻等种种不足，导致其仅适用于专业技术人员在实验室条件下对少量样品的检测，无法满足大口黑鲈养殖过程中对lmbv病毒进行现场高通量快速检测的需要。基于抗体的免疫学检测技术具有一些不足，例如抗体需要严格的低温保存条件，抗体制备耗时长、费用高、批次间质量存在差异，对结构类似化合物有一定程度的交叉反应易导致“假阳性”结果。
5.因此应着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高、可用于养殖现场的大口黑鲈lmbv病毒快速检测技术和功能产品，这对于及早发现、确定病原，进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失至关重要。
6.指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment technology,selex)是一种生物文库筛选技术，是基于分子生物学的认识：核酸分子与蛋白质分子等在体内的特异性相互作用，是基因转录、核酸复制、蛋白表达等一系列基本生命活动有序进行的保证。selex技术的基本原理：人工合成单链核酸文库(单链dna或rna)，文库含40nt左右的随机序列，其可能的序列理论上可达4
40
种。一级序列的多样性，也导致了单链dna或rna二级和三级结构的多样性。这些不同序列与不同空间
结构的核酸，经过多个循环的筛选，多种靶物质，如蛋白质、核酸、小肽和氨基酸等有机分子，甚至金属离子，在理论上都可以找到与之特异并稳固结合的核酸序列。经过多轮循环筛选及pcr/rt
‑
pcr技术的扩增，再经克隆测序鉴定，进而可以大量生产并纯化得到与靶物质结合的这一段特异序列的核酸链
‑
配基，也称核酸适配子或适配体。
7.核酸适配体能够特异性与靶物质牢固结合，因而可以在很大程度上相当于抗体的作用，而且在一些抗体还无法应用的领域也能发挥作用。适配子可以作为诊断试剂，单独或与抗体组合应用于多种诊断模式，还可以应用于临床治疗等。
8.核酸适配体具有易筛选、易修饰、稳定性强、高特异性识别靶标分子等优点，目前已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具。首先，selex技术筛选周期短，通常核酸适配体的筛选需要6
‑
30个selex循环，约3
‑
8周的时间。而针对靶标分子筛选、制备特异性的生物抗体等则需要长达3
‑
8个月的时间，且抗体存在成本高、易失活、保存条件苛刻、批次间的抗体质量存在差异等问题。其次，selex技术是在体外进行的化学筛选过程，因此靶标分子范围广范从金属离子、有机染料等简单体系，到病毒、细胞、组织等复杂体系，均可作为selex筛选的靶标分子，特别是具有细胞毒性、无免疫原性或者免疫原性弱的靶标分子，均能够使用selex技术在体外进行高特异性核酸适配体的筛选。因此，核酸适配体的研究日益受到国内外生物化学、生物医学、纳米材料、蛋白质科学等多学科研究者的广泛关注。目前，核酸适配体已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。


技术实现要素：

9.本发明在于提供一种高特异性、高灵敏度、无免疫原性、且稳定易修饰、便于合成和保存的用于检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞的核酸适配体，以至少解决现有的生物学检测技术不能在现场快速对大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞进行准确检测的问题。
10.本发明的目地在于提供一种可特异性识别、检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列为5
’‑
ggcggtcccgatggcgagcaagccaataacccccc atgcacatcgttagt
‑3’
(seq id no：1)。
11.进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列为5
’‑
gacgcttactcaggtgtgactcgggc ggtcccgatggcgagcaagccaataaccccccatgcacatcgttagtcgaaggacgcagat gaagtctc
‑3’
(seq id no：2)。
12.更进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。
13.更进一步地，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。
14.更进一步地，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,fitc)、羟基荧光素(6
‑
carboxy
‑
fluorescein,fam)、cy5荧光素(cy5 fluorescent dye)、cy3荧光素(cy3 fluorescent dye)、羧基四甲基罗丹明(carboxytetramethylrhodamine,tamra)等荧光物质或发光材料、荧光淬灭剂(black hole quencher,bhq)中的一种或多种。
15.本发明还有一目地在于提供一种基于核酸适配体的用于致病性大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞快速检测的荧光分子探针(aptamer lbva2
‑
based fluorescent molecular probe,lbva2
‑
afmp)，其特征在于，该分子探针含有上述核酸适配体。将大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞与羟基荧光素(6
‑
carboxy
‑
fluorescein,fam)标记的上述seq id：1或seq id：2
所示的核酸适配体孵育结合并清洗后，用流式细胞仪进行检测，根据荧光值的变化检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞。lbva2
‑
afmp可应用于开发基于核酸适配体的大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞的快速检测试剂盒，适用于诊断大口黑鲈是否被大口黑鲈虹彩病毒侵染的大批量快速检测，具有耗时短、操作简便、稳定性强、灵敏度高等优点。
16.本发明还有一目地在于提供一种应用上述核酸适配体在检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞中的用途。
17.与现有的技术相比，本发明的优点在于：本发明通过selex技术筛选得到的核酸适配体能够高亲和力和特异性识别大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞，而且核酸适配体无免疫原性；分子量小，便于体外化学合成；制备周期短；重现性好；易于对核酸适配体的不同部位进行化学基团修饰和取代；序列稳定，易于运输和保存等。采用本发明的基于核酸适配体的的快速检测方法(lbva2
‑
afmp)对大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞进行检测时，操作简单迅速，可用于开发相关的快速检测试剂盒。这对于大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞的快速检测具有重要意义，在大口黑鲈虹彩病毒的检测领域有良好的应用前景。
附图说明
18.图1是本发明实施例中seq id no：1核酸适配体的二级结构预测图；
19.图2是本发明实施例中，激光共聚焦显微镜检测羟基荧光素(fam)标记的seq id no：1与大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞的结合情况，对照组library：羟基荧光素(fam)标记的seq id no：1与正常细胞的结合情况；
20.图3是本发明实施例中，流式细胞仪检测羟基荧光素(fam)标记的seq id no：1与大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞的结合情况，对照组1：羟基荧光素(fam)标记的seq id no：1与正常细胞的结合情况；对照组2：羟基荧光素(fam)标记的seq id no：1与石斑鱼虹彩病毒sgiv感染细胞的结合情况；对照组3：羟基荧光素(fam)标记的seq id no：1与神经坏死病毒nnv感染细胞的结合情况；对照组4：羟基荧光素(fam)标记的seq id no：1与中华鳖虹彩病毒stiv感染细胞的结合情况。
具体实施方式
21.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
22.实施例1:核酸适配体的筛选
23.步骤1：合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物
24.随机起始单链ssdna文库library：
[0025]5’‑
gacgcttactcaggtgtgactcg
‑
n50
‑
cgaaggacgcagagaagtctc
‑3’
[0026]5’
引物：5
’‑
fam
‑
gacgcttactcaggtgtgactcg
‑3’
；
[0027]3’
引物：5
’‑
biotin
‑
gagacttcatctgcgtccttcg
‑
3；
[0028]
步骤2：selex筛选获得特异性识别水产致病菌大口黑鲈虹彩病毒的核酸适配体
[0029]
2.1将10nmol上述随机文库溶解在500μl pbs中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的随机文库与大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞在冰上孵育
40min；
[0030]
2.2孵育结合完成后，离心移除上清，用3ml pbs洗涤大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞，92℃恒温水浴10min，3000g离心收集上清，即为特异性识别大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞的单链核酸文库。
[0031]
步骤3：pcr扩增筛选文库
[0032]
取100μl筛选得到的识别大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞的单链核酸文库进行pcr扩增，具体的扩增条程序是：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过25轮循环，72℃5min。第一轮筛选后得到的上清，要全部用于进行pcr扩增，得到扩增后的双链核酸文库。
[0033]
步骤4：dna单链文库的制备
[0034]
将100μl链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中pcr扩增所得的双链核酸文库在常温下孵育20min，利用双链dna上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链dna结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清，用2ml pbs洗涤磁珠，然后在ep管中加入200ul naoh溶液(200mm)，常温反应10min，利用磁性分离架回收得到上清；将上清液中正向ssdna单链核酸用pcr纯化回收试剂盒纯化回收，收集到含有ssdna单链文库的溶液。:
[0035]
步骤5：如上反复筛选
[0036]
将步骤4中得到的dna单链文库代替步骤(2)中的随机文库，重复步骤2
‑
4所示的阳性筛选过程、pcr扩增及单链dna文库的制取过程9次。
[0037]
步骤6：阴性筛选
[0038]
在第二轮及第二轮以后筛选中，用正常fhm细胞为对照，将步骤5后筛选得到的ssdna单链文库进行阴性筛选以提高筛选效率。具体的阴性筛选过程为：将筛选得到的ssdna文库溶解、92℃恒温水浴、冰浴后，与正常fhm细胞在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液，收集到的上清即为经过阴性筛选的核酸文库。
[0039]
:步骤7：10轮筛选
[0040]
将步骤6中收集到的上清溶液，经过步骤3的pcr扩增和步骤4的单链dna文库制备后，依次重复进行步骤6、步骤2、步骤3和步骤4的过程，利用流式细胞仪检测所得单链dna文库对大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞识别能力的变化情况，直至9轮筛选后，核酸文库对大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到本实施例中可用于检测大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞的ssdna核酸适配体，序列如seq id no：1所示。
[0041]
步骤8：利用mfold软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/dna
‑
folding
‑
form)在线预测seq id no：1核酸适配体的二级结构。
[0042]
seq id no：1核酸适配体的二级结构预测结果如图1所示，核酸适配体seq id no：1形成特殊的茎环结构。
[0043]
步骤9：利用激光共聚焦显微镜检测本实施例中羟基荧光素(fam)标记的seq id no：1或seq id no：2核酸适配体对大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞的结合效果及其特异性
[0044]
核酸适配体seq id no：1与大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞的孵育结合过程如上述所示，激光共聚焦显微镜的检测结果如图2所示，结果证实，与对照组的正常fhm细胞相比，羟基荧光素(fam)标记的上述seq id no：1或seq id no：2所示的ssdna核酸适配体对大
口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞具有高特异性识别能力。
[0045]
步骤10：利用流式细胞仪检测本实施例中羟基荧光素(fam)标记的seq id no：1或seq id no：2核酸适配体对大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞的结合效果及其特异性
[0046]
核酸适配体与大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞的孵育结合过程如上述所示，流式细胞仪的检测结果如图3所示，结果证实，与四组对照组细胞相比，羟基荧光素(fam)标记的上述seq id no：1或seq id no：2所示的ssdna核酸适配体对大口黑鲈虹彩病毒lmbv感染细胞具有高特异性识别能力。
[0047]
实施例2
[0048]
本发明实施例取用实施例1所得seq id no：1或seq id no：2核酸适配体，进行荧光分子探针(aptamer lbva2
‑
based fluorescent molecular probe,lbva2
‑
afmp)试剂盒组装，形成一种用于大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞的lbva2
‑
afmp检测试剂盒。该分子探针含有上述seq id no：1或seq id no：2核酸适配体。
[0049]
本发明实施例通过selex技术筛选得到的核酸适配体具有较好的亲和力及特异性，且本发明实施例的核酸适配体结构稳定，在进行基团标记及修饰后，仍具有较好的亲和力和特异性，可应用于荧光分子探针检测试剂盒中，且本发明实施例的核酸适配体相比于蛋白抗体具有制备周期短、重现性好、分子量小的特点，便于体外合成，在水产致病菌大口黑鲈虹彩病毒的检测领域有良好的应用前景。
[0050]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本技术说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。
[0051]