一种羟基红花黄色素A的新晶型及其制备方法与流程

一种羟基红花黄色素a的新晶型及其制备方法
技术领域
1.本发明属于化学领域，具体地说，本发明涉及一种羟基红花黄色素a的新晶型及其制备方法。


背景技术：

2.中药“红花”来源于菊科植物红花(carthamus tinctorius l.)干燥花，《中国药典》(2020版)(一部)记载，其有活血通经、散瘀止痛的效果，主要用于关节炎症、心脑血管疾病等的治疗。
3.羟基红花黄色素a是红花中的主要活性成分之一，也是红花中含量最高的活性成分，其具有抗炎、抗血小板、抗血栓等药理活性，可以用于心脑血管疾病、脓毒血症、新冠肺炎等疾病的治疗，是丹红注射液、注射用红花黄色素、血必净注射液等中药大品种的主要活性成分之一。
4.羟基红花黄色素a可应用于危重症病人，如心脑血管疾病、脓毒血症、新冠肺炎等且具有较好的疗效。由于危重症病患的特点，加上羟基红花黄色素a的口服生物利用度非常低(zhao,f.,et al.(2020)."hydroxysafflor yellow a:a systematical review on botanical resources,physicochemical properties,drug delivery system,pharmacokinetics,and pharmacological effects."front pharmacol11:579332)，其用药一般采用静脉注射的方式。
5.静脉注射制剂是一种高风险剂型，对药品的质量要求非常严格，包括原料药和制剂的纯度、辅料的种类、在药品存放过程中的稳定性等对药品的质量影响非常大，从而进一步影响到药品的安全性。但是，上述中药大品种，皆为有效成分相对含量较低的“中药注射剂”，质控难度高，存在着较大的潜在风险。目前市场上的药物，即使是技术难度最高的“注射用红花黄色素”，其质控成分“羟基红花黄色素a”的含量也仅仅只有80％。而剩余的杂质，显著增加了药品质控的难度，难以满足广大医患人员对药品品质不断提升的需求。尤其是近年来，中药注射剂成为了“广受争议”的制剂品种，越来越多的医院已经禁止中药注射剂的使用，使其变得举步维艰。
6.羟基红花黄色素a的纯化，常采用柱色谱的方法，例如专利文献cn201410355732.2中公开的工艺已经可以将其纯度提升至99％以上。产物经过冷冻干燥后，成为无定型的冻干粉。上述工艺，虽然可以制备纯度较高的羟基红花黄色素a产品，但其工艺复杂，成本较高，收率较低。更为严重的是，制备得到的冻干粉，其稳定性较差，难以在常规存放条件下长期存放，无法满足静脉注射制剂的要求。这使得其原料药存放需要低温、充氮等苛刻条件，而制剂则必需添加抗氧剂、金属离子络合剂等辅料。而上述辅料具有潜在的毒性，增加了用药风险，提高了制剂成本。
7.结晶法是化合物纯化过程中常用的一种方法，其避免了使用价格昂贵的纯化介质(如前述的“注射用红花黄色素”，纯化过程中需采用进口树脂，售价高达万元/l)，且工艺放大过程中对设备要求较低，是一种化合物纯化过程中的理想手段。更重要的，相对比冻干
粉，结晶的稳定性显著提高，结晶颗粒的流动性显著增加、引湿性显著降低，对制药设备的要求也更加宽泛，进而使得制剂工艺的难度也显著降低，但目前尚未见羟基红花黄色素a结晶及其工艺的报道。
8.因此，基于结晶在药品制备过程中的显著优势，本领域的技术人员致力于开发一种羟基红花黄色素a的结晶工艺，解决其生产工艺复杂、生产成本高、产物纯度低、稳定性差等诸多问题，提供一种羟基红花黄色素a原料药，特别是满足于注射制剂的原料药的生产工艺及结晶产品。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种羟基红花黄色素a的新晶型及其制备方法。
10.本发明的第一方面，提供了一种羟基红花黄色素a的晶型i，所述晶型i的x-射线粉末衍射(xrpd)图具有以下2θ角处的特征峰：13.56
±
0.2
°
。
11.在另一优选例中，所述晶型i的x-射线粉末衍射(xrpd)图具有以下2θ角处的特征峰：13.56
±
0.2
°
、和8.96
±
0.2
°
。
12.在另一优选例中，所述晶型i的x-射线粉末衍射(xrpd)图具有以下2θ角处的特征峰：13.56
±
0.2
°
、8.96
±
0.2
°
、和22.81
±
0.2
°
。
13.在另一优选例中，所述晶型i的x-射线粉末衍射(xrpd)图还具有选自下组的一个或多个2θ角处的特征峰：4.40
±
0.2
°
、18.16
±
0.2
°
、27.47
±
0.2
°
、28.87
±
0.2
°
、33.41
±
0.2
°
、和36.95
±
0.2
°
。
14.在另一优选例中，所述晶型i具有基本如图1所示的xrpd谱图。
15.在另一优选例中，所述晶型i的差示扫描量热法图谱(dsc)在110-130℃有特征吸热峰；优选地，在120.5
±
5℃有特征吸热峰。
16.在另一优选例中，所述晶型i的差示扫描量热法图谱还在155-175℃有特征吸热峰；优选地，还在165.3
±
5℃有特征吸热峰。。
17.在另一优选例中，所述晶型i的差示扫描量热法(dsc)图谱基本如图3所示。
18.在另一优选例中，所述晶型i的tga谱图基本如图4所示。
19.本发明的第二方面，提供了一种如第一方面所述的羟基红花黄色素a的晶型i的制备方法，所述方法包括步骤：
20.提供羟基红花黄色素a溶液，使溶液中析出晶体，收集析出的晶体，从而得到所述的晶型i。
21.在另一优选例中，通过降温使羟基红花黄色素a溶液中析出晶体。
22.在另一优选例中，所述方法包括步骤：
23.(1)提供具有第一温度的羟基红花黄色素a溶液；
24.(2)调节步骤(1)提供的羟基红花黄色素a溶液的ph至酸性；
25.(3)对步骤(2)调节ph后的溶液降温至第二温度进行析晶，从而获得所述晶型i；
26.其中，所述第一温度高于所述第二温度。
27.在另一优选例中，所述第一温度为10-80℃；所述第二温度为0-30℃。
28.在另一优选例中，所述第一温度为20-70℃；优选地为约50℃。
29.在另一优选例中，所述步骤(1)中所得羟基红花黄色素a溶液中，羟基红花黄色素a
的质量浓度为约1％-70％；优选地为约2％-50％；更优选地为约10％-40％。
30.在另一优选例中，所述步骤(2)中调节ph至1-4；优选地调节ph至2-3。
31.在另一优选例中，所述步骤(3)中降温速率为0.01℃/min-20℃/min；优选地降温速率为0.1℃/min-10℃/min；更优选地降温速率为1℃/min-5℃/min。
32.在另一优选例中，所述第二温度为0-20℃；优选地，所述第二温度为1-15℃；更优选地，所述第二温度为4-10℃。
33.在另一优选例中，所述步骤(3)中降温析晶过程中，不停搅拌。
34.在另一优选例中，所述步骤(3)中降温至第二温度后，析晶5-48h；优选地，析晶8-36h；更优选地，析晶12-24h。
35.在另一优选例中，所述方法还包括步骤，对获得的晶型i进行真空干燥处理。优选地，真空干燥处理温度为10-30℃。
36.在另一优选例中，所述方法还包括步骤，对获得的所述羟基红花黄色素a晶型i进行重结晶处理；优选地，所述重结晶步骤包括：
37.(a)将羟基红花黄色素a晶型i原料溶于具有第一温度的含水溶剂中，获得羟基红花黄色素a溶液；
38.(b)调节步骤(a)获得的羟基红花黄色素a溶液的ph至酸性；
39.(c)对步骤(a)的溶液降温至第二温度进行析晶，从而获得所述羟基红花黄色素a的晶型i精制品；
40.其中，所述第一温度高于所述第二温度。
41.在另一优选例中，所述第一温度为10-80℃；所述第二温度为0-30℃；优选地，所述第一温度为20-80℃；所述第二温度为0-20℃。
42.在另一优选例中，所述第一温度为30-70℃；优选地为约50℃。
43.在另一优选例中，所述步骤(a)中所得溶液中，羟基红花黄色素a的质量浓度为约1％-80％；优选地为约2％-60％；更优选地为约20％-40％。
44.在另一优选例中，所述步骤(b)中调节ph至1-4；优选地调节ph至2-3。
45.在另一优选例中，所述步骤(c)中降温速率为0.01℃/min-20℃/min；优选地降温速率为0.1℃/min-10℃/min；更优选地降温速率为1℃/min-5℃/min。
46.在另一优选例中，所述第二温度为0-20℃；优选地，所述第二温度为1-15℃；更优选地，所述第二温度为4-10℃。
47.在另一优选例中，所述步骤(c)中降温析晶过程中，不停搅拌。
48.在另一优选例中，所述步骤(c)中降温至第二温度后，析晶5-48h；优选地，析晶8-36h；更优选地，析晶12-24h。
49.在另一优选例中，所述方法还包括步骤，对获得的所述羟基红花黄色素a的晶型i精制品进行真空干燥处理。优选地，真空干燥处理温度为10-30℃。
50.在另一优选例中，所述步骤(1)中，羟基红花黄色素a溶液中羟基红花黄色素a的hplc纯度≥70％；优选地，羟基红花黄色素a的hplc纯度≥80％；或者，羟基红花黄色素a的hplc纯度在约75％-95％之间。
51.在另一优选例中，所述羟基红花黄色素a溶液为将羟基红花黄色素a原料溶于含水溶剂形成的溶液；优选地，含水溶剂中水的质量分数≥70％；优选地≥80％；更优选地≥
90％。
52.在另一优选例中，所述含水溶剂选自：水、乙醇水溶液、丙酮水溶液等。
53.本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述羟基红花黄色素a晶型i的用途，用于制备治疗或预防疾病的药物组合物，所述药物组合物用于抗炎、抗血小板、或抗血栓等；和/或，所述药物组合物用于治疗心脑血管疾病、脓毒血症、新冠肺炎等疾病。
54.本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，包含：
55.本发明第一方面所述的羟基红花黄色素a晶型i；以及药学上可接受的载体。
56.在另一优选例中，所述药物组合物由本发明第一方面所述的羟基红花黄色素a晶型i和药学上可接受的载体构成。
57.在另一优选例中，所述药物组合物为注射剂。
58.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
59.图1是本发明所述的羟基红花黄色素a晶型i的x射线粉末衍射图谱；
60.图2是本发明所述的羟基红花黄色素a晶型i的x射线粉末衍射峰详细参数；
61.图3是本发明所述的羟基红花黄色素a晶型i的dsc图谱；
62.图4是本发明所述的羟基红花黄色素a晶型i的tga图谱；
63.图5是本发明所述的羟基红花黄色素a晶型i的显微照片(10
×
目镜+10
×
物镜)。
具体实施方式
64.经过广泛而深入的研究，本发明人意外制得一种羟基红花黄色素a晶型i，该羟基红花黄色素a晶型i的稳定性好、产物纯度高，适用于作为注射剂原料。本发明还公开了该类新晶型的制备方法，以纯度约80％的羟基红花黄色素a为起始原料经结晶步骤制备本发明的羟基红花黄色素a晶型i。该羟基红花黄色素a晶型i能够应用于缺血性脑血管疾病和缺血性心血管疾病的治疗。
65.在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
66.除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
67.虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
68.具体地，本发明制备了一种羟基红花黄色素a晶型i，与无定型羟基红花黄色素a冻干粉对比，该羟基红花黄色素a晶型i具有稳定性好、纯度高、生产成本低等特点。该羟基红花黄色素a晶型i可应用于缺血性心脏病和缺血性脑血管疾病的治疗，作为相关药物注射制
剂原料药(api)使用。
69.可以采用如下多种方式和仪器对本发明的羟基红花黄色素a晶型i性质进行研究，例如采用x射线粉末衍射、示差扫描量热分析、热重分析法(tga)进行分析。这些分析方法可以为本领域常规的方法。
70.本发明所述测定晶型的x射线粉末衍射的方法在本领域中是已知的。本发明的具体检测条件可参考本发明各晶体的x射线粉末衍射图谱。结果表明，本发明的各晶体在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有特定的特征峰。
71.本发明还提供了一种羟基红花黄色素a晶型i的结晶工艺，通过该结晶工艺，得到了一种羟基红花黄色素a的新晶型。同干燥工艺得到的无定型固体粉末相比，该结晶具有纯度高、生产成本低、更加稳定的优点，能够满足注射剂新药原料药的生产需求。
72.活性成分
73.如本文所用，术语“活性成分”或“活性化合物”指本发明的羟基红花黄色素a晶型i。
74.羟基红花黄色素a(hydroxysafflor yellow a)是红花中的主要活性成分之一，其具有抗炎、抗血小板、抗血栓等药理活性，可以用于心脑血管疾病、脓毒血症、新冠肺炎等疾病的治疗。本发明公开了羟基红花黄色素a晶型i及其制备方法。羟基红花黄色素a冻干粉，可以采用专利文献cn201410355732.2中的方法制备，相比起无定型粉末，羟基红花黄色素a晶型i具有稳定性好、纯度高、制备成本低的特点。本发明制备的羟基红花黄色素a晶型i更适用于注射剂的开发，其可应用于缺血性脑卒中和缺血性心血管疾病的治疗。
75.药物组合物和施用方法
76.由于羟基红花黄色素a具有抗炎、抗血小板、抗血栓等药理活性，可以用于心脑血管疾病、脓毒血症、新冠肺炎等疾病的治疗。因此，本发明的羟基红花黄色素a晶型i可以用于治疗或预防上述疾病。
77.本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明的羟基红花黄色素a晶型i及药学上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：羟基红花黄色素a晶型i的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明的晶型物/剂，更佳地，含有10-200mg本发明的晶型物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个注射剂量或一个胶囊或药片。
[0078]“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效或者稳定性等。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、崩解剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0079]
本发明的羟基红花黄色素a晶型i或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。优选地，采用注射方式给药，如静脉注射。
[0080]
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
[0081]
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性成分也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
[0082]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0083]
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
[0084]
除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0085]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。本发明的羟基红花黄色素a晶型i由于其优异的稳定性和高纯度，因此特别适用于注射给药。
[0086]
用于局部给药的本发明的晶型物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
[0087]
本发明的羟基红花黄色素a晶型i可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
[0088]
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的晶型物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选10～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0089]
检测方法
[0090]
除非另外说明，本发明实施例中按照下述方法检测：
[0091]
x-射线粉末衍射(xrpd)检测：
[0092]
x-射线粉末衍射仪器：brucker d8 advance
[0093]
试验条件：
[0094]
cuka40kv 40ma，发散狭缝0.6mm，索拉狭缝4.0
°
，连续扫描；探测器：lynxeye步长：0.02
°
；扫描速度：8
°
/min；扫描范围：3-45
°
[0095]
差示扫描量热法(dsc)检测：
[0096]
差示扫描量热(dsc)仪器：ta dsc q2000型。
[0097]
温度范围：室温～300℃，
[0098]
扫描速度：10℃/分钟，
[0099]
热重分析法(tga)检测：
[0100]
热重分析(tga)仪器：tatga500。
[0101]
温度范围：室温～350℃
[0102]
扫描速度：10℃/分钟
[0103]
hplc检测：
[0104]
色谱柱：zorbax eclipse xdb-c8色谱柱，5μm填料，4.6
×
250mm
[0105]
柱温35℃，流速1ml/min，检测波长230nm，进样量10μm；
[0106]
流动相：0.05％磷酸水溶液：乙腈；
[0107]
按照如下洗脱程序梯度洗脱：
[0108]
时间/min055657070.1750.05％磷酸水溶液(体积百分比)100701010100100乙腈(体积百分比)030909000
[0109]
本发明的主要优点在于：
[0110]
(1)本发明首次制备得到的羟基红花黄色素a晶型i，与羟基红花黄色素a冻干粉末相比，稳定性更强，更耐高温、高湿、强光照射等，，适合作为注射剂原料使用；
[0111]
(2)本发明提供的制备羟基红花黄色素a晶型i的方法，可以采用低纯度的羟基红花黄色素a原料(约80％即可)为起始原料进行结晶，因此极大的降低了羟基红花黄色素a晶型i制备的成本。
[0112]
(3)本发明提供的制备羟基红花黄色素a晶型i的方法，产物纯度高，收率大，方便工业生产。
[0113]
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0114]
实施例1柱色谱法初步纯化羟基红花黄色素a粗品
[0115]
取红花药材(红花药材来自于浙江永宁药业新疆塔城红花gap种植基地，其中羟基红花黄色素a含量约1.7％)1.5kg，加水15l，100℃提取30min，过滤，滤渣再次加水15l，100℃提取30min，滤渣丢弃，合并两次滤液。一般可得滤液22-24l，其中含羟基红花黄色素a约22g。
[0116]
取大孔吸附树脂(华东理工大学上海华震科技有限公司，树脂型号hz816)5l，装柱待用(色谱柱内径10cm)。将上述滤液浓缩至体积约5l，调节ph3.0后柱层析。过柱吸附后，先后采用30l水、30l 20％乙醇洗脱，再采用30％乙醇洗脱树脂柱，1.25l/瓶分步收集洗脱液，
hplc检测，合并纯度超过50％部分，一般可得羟基红花黄色素a约20g。
[0117]
另取大孔吸附树脂(华东理工大学上海华震科技有限公司，树脂型号微球1号)5l，装同样规格的树脂柱待用。上步骤得到的纯度超过50％的羟基红花黄色素a合并液浓缩至原体积的1/2。再次将浓缩液调节至ph3.0，再次采用相同的方法进行柱色谱层析，本次合并纯度超过80％部分，一般可得羟基红花黄色素a约15g。浓缩本步骤合并液至原体积的1/2，待用。
[0118]
通过本实施例制备得到的纯度超过80％的羟基红花黄色素a溶液，用于后续制备羟基红花黄色素a的原料。
[0119]
实施例2结晶法制备羟基红花黄色素a结晶
[0120]
取依实施例1方法制备的纯度超过80％的羟基红花黄色素a溶液(约含羟基红花黄色素a15g)，低压浓缩至浓度30.0％，50℃温水浴条件下加入盐酸调节水溶液ph至2.5。将该溶液自然降温至室温，然后将其转移至20℃的水浴条件下，可见浑浊析出，不断搅拌，缓慢降温(降温速度4min/℃)至5℃。溶液继续保持5℃并不断搅拌12h，可见大量固体沉淀析出。过滤沉淀，得纯度大于96.1％的羟基红花黄色素a粗晶10.5g.本步一次结晶的过程，收率一般可达70％以上。
[0121]
取上述羟基红花黄色素a粗晶，50℃水浴条件下溶解于水中，配置成30.0％的水溶液，以盐酸调节水溶液ph 2.5。将该溶液自然降温至室温，然后将其转移至20℃水浴条件下，不断搅拌，并缓慢降温(降温速度4min/℃)至5℃。溶液继续保持5℃并不断搅拌12h，可见大量结晶析出。过滤结晶，干燥得终产品，得纯度99.4％的羟基红花黄色素a结晶9.5g，即为羟基红花黄色素a晶型i。本步骤二次结晶的过程，收率一般可达90％以上。
[0122]
本实施例制备得到的羟基红花黄色素a晶型i，可用于进行粉末x射线衍射、差示扫描量热分析(dsc)、热重分析(tga)、影响因素试验、药效学试验等研究。
[0123]
图1显示了制得的羟基红花黄色素a晶型i的x射线粉末衍射图谱；
[0124]
图2显示了制得的羟基红花黄色素a晶型i的x射线粉末衍射峰详细参数；
[0125]
图3显示了制得的的羟基红花黄色素a晶型i的dsc图谱；
[0126]
图4显示了制得的羟基红花黄色素a晶型i的tga图谱；
[0127]
图5显示了制得的羟基红花黄色素a晶型i的显微照片(10
×
目镜+10
×
物镜)。
[0128]
实施例3研究结晶过程中结晶前溶液的浓度范围
[0129]
本实施例，采用类似于实施例2的方法，将两次结晶前结晶溶液的浓度改变，分别采用结晶前溶液中羟基红花黄色素a的浓度为2.0％和60％，得到的产品结果分别如下：
[0130]
结晶浓度2.0％时，最初15g羟基红花黄色素a原料，调节ph 2.0，一次结晶后，得到97.8％的产物5.2g；重结晶后，得到纯度99.7％的产物2.7g。
[0131]
结晶浓度60.0％时，最初15g羟基红花黄色素a原料，调节ph 3.0，一次结晶后，得到95.0％的产物11.3g；重结晶后，得到纯度99.1％的结晶8.8g。且在结晶过程中，由于结晶溶液相对粘稠，处理过程中存在一定难度。
[0132]
本实施例得到的两个产物，分别进行了粉末x射线衍射分析，表明其与实施例2中的产物为同一种晶型。
[0133]
结果表明，结晶前采用不同的浓度，最终在产品得率、产物纯度、可操作性方面，有一定的差异。较低的结晶浓度得率低，产物纯度高。较高的结晶浓度，产物得率相对偏高，但
纯度偏低(可能与溶液粘稠，结晶吸附母液导致)。但综合本次结果，结晶前羟基红花黄色素a溶液的浓度，在2.0％-60.0％范围内，都可以得到较为满意的结果，最终决定选择该浓度范围。
[0134]
实施例4研究结晶过程中溶液的ph范围
[0135]
本实施例，同样采用类似于实施例2的方法，将两次结晶前溶液(30％含量)的ph分别调节至ph 1.0和ph 3.0，来探索本发明可选择的ph范围。
[0136]
本实施例得到的结果分别如下：
[0137]
调节至ph 1.0时，最初15g羟基红花黄色素a原料，一次结晶后，得到95.3％的产物12.1g；重结晶后，得到纯度99.2％的产物10.0g。产物有较强的酸味，可能与体系酸性较强，结晶吸附了过量的盐酸有关。
[0138]
调节至ph 3.0时，最初15g羟基红花黄色素a原料，一次结晶后，得到96.6％的产物7.3g；重结晶后，得到纯度99.5％的产物5.5g。
[0139]
本实施例得到的两种产物，分别进行了粉末x射线衍射分析，表明其与实施例2中的产物为同一种晶型。
[0140]
由本实施例的结果我们可以发现，结晶前溶液调节至不同的ph，最终在产品得率、产物纯度方面表现一定的差异。因为羟基红花黄色素a在酸性的溶液中产物收率更高，相应的纯度偏低一些。但综合本次结果，结晶前羟基红花黄色素a溶液的ph 1.0-3.0范围内，所得到的产物纯度、收率等都得到了较为满意的结果，最终选择该ph范围
[0141]
实施例5研究结晶时的温度范围
[0142]
本实施例，同样采用类似于实施例2的方法，调整析晶时的温度，分别为20℃和0℃，来探索本发明结晶过程中可以选择的温度范围。本实施例得到的结果分别如下：
[0143]
当析晶时温度为20℃时，最初15g羟基红花黄色素a原料，一次结晶后，得到97.9％的产物7.6g；重结晶后，得到纯度99.8％的产物5.5g。
[0144]
当析晶时温度为0℃时，最初15g羟基红花黄色素a原料，一次结晶后，得到95.2％的产物12.2g；重结晶后，得到纯度99.0％的产物11.3g。
[0145]
本实施例得到的两种产物，分别进行了粉末x射线衍射分析，表明其与实施例2中的产物为同一种晶型。
[0146]
由本实施例我们可以发现，结晶时的温度不同，最终产品的得率、纯度略有差异。20℃时收率偏低，但产物纯度更高，而0℃时收率偏高，但产物纯度稍低。产物的得率、纯度等各项参数，皆在可接受范围之内。综合本实施例结果，因此选择析晶时的温度范围0-20℃。
[0147]
实施例6羟基红花黄色素a晶型i与冻干粉的影响因素试验
[0148]
影响因素试验是药物稳定性考察的重要方法，其通过相对苛刻的条件(高温、高湿、强光照射)，加速待测样品的降解过程，可以在较短时间内对药物稳定性有初步的了解，对后续的新药开发具有重要的意义。一般来讲，影响因素试验条件下稳定性好的产品，最终长期存放过程中的稳定性也会更好。按照新药注册法规相关要求，所有的原料药与制剂都要进行影响因素试验。
[0149]
本实施例中的羟基红花黄色素a结晶，采用本发明中实施例2中的方法制备。本实施例中羟基红花黄色素a冻干粉，采用专利文献cn201410355732.2中的方法制备，冻干粉经
过hplc检测，纯度为99.2％。
[0150]
本实施例参考《中国药典》2020版四部第457页中所述的试验方法，简述如下：
[0151]
将供试品置于适当的开口容器中(如称量瓶或培养皿)，摊成厚度≤5mm的薄层，进行如下试验：
[0152]
高温试验：供试品开口置于洁净容器中，60℃温度下放置10天后取样hplc检测，并与0天时的样品对比。
[0153]
高湿试验：供试品开口置于恒湿密闭容器中，在25℃条件下分别于相对湿度90
±
5％条件下放置10天后取样hplc检测，并记录样品放置前后的重量，以考察样品的吸湿情况。(选择kno3饱和溶液共同放置于密闭容器中营造高湿环境：25℃时相对湿度92.5％)，并与0天时的样品对比。
[0154]
强光照射试验：供试品开口放置于装有日光灯的光照箱内，于照度4500lx
±
500lx条件下照射10天后取样hplc检测，留意供试品外观变化，并与0天时的样品对比。
[0155]
羟基红花黄色素a结晶和冻干粉的影响因素试验结果见表1。
[0156]
表1高温、高湿、强光照射影响因素试验前后的产品质量统计表
[0157][0158]
影响因素结果显示，在高温、强光照射影响因素试验中，羟基红花黄色素a晶型i的稳定性显著好于冻干粉。在高湿试验中，晶型i的吸湿性显著低于冻干粉，由于后者吸湿严重，已经成为粘稠的液滴状，明显已经不合格，因此我们未检测其hplc纯度。
[0159]
另外，冻干粉极易吸潮的特征，增加了药品生产过程中的处理难度，提升了药品成产车间湿度控制设备、自动分装设备、除静电设备等的技术要求，可能会显著增加药品的生产成本。
[0160]
综上，结晶状态下的羟基红花黄色素a，稳定性显著好于无定型的冻干粉，更适用于作为化药注射剂原料药使用。可以预见，在加速试验和长期稳定性试验中，本发明所制备的羟基红花黄色素a晶型i，稳定性亦会显著好于无定型的冻干粉。
[0161]
实施例7羟基红花黄色素a晶型i对缺血性脑卒中大鼠的保护作用
[0162]
本实施例中，采用静脉注射给药的方式，选择市场上的畅销药物作为阳性药，对比羟基红花黄色素a晶型i与阳性药物对缺血性脑卒中模型动物大脑梗死面积的影响。
[0163]
阳性药物选择的丁苯酞氯化钠注射液(石药集团产)是《中国缺血性脑卒中诊疗指南》(2018版)中推荐的缺血性脑卒中治疗药物。
[0164]
本试验选用sd大鼠，构建缺血性脑卒中试验动物模型，方法如下：
[0165]
缺血不灌注模型：大鼠中动脉栓塞-电凝法
[0166]
sd大鼠称重，用15％的水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉，左侧侧卧固定在大鼠手
术台，左侧颞顶部及面部剃毛，用75％乙醇消毒后在左眼和左耳之间，切开皮肤，钝性分离颞肌和咬肌，暴露颞骨翼板，于手术显微镜下，在颞骨和颞鳞骨结合靠近口侧1mm处用颅骨钻研磨出2mm
×
2mm的骨窗，用撬棒撬开颅骨。此时，透过硬脑膜即可见一条较直且分支较少的血管，即为大脑中动脉。用双极电凝镊在嗅束内1mm至大脑下静脉之间处烧灼，将血流彻底阻断后止血，依次缝合颞肌和皮肤，然后尾静脉注射给药。待大鼠苏醒后，放回笼中继续饲养24h。
[0167]
缺血再灌注模型：大鼠中动脉栓塞-线栓法
[0168]
大鼠称重后用15％水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧固定在大鼠手术台上，颈部剃毛，75％乙醇消毒，手术剪纵向剪开皮肤，手术分离暴露一侧颈总动脉，沿颈总动脉上行分离并结扎颈外动脉和翼突颚动脉，在颈总动脉的近心端放置动脉夹阻断血流，于远心端用眼科手术剪剪一个小口，插入栓线，缓缓推入栓线(约20mm)至前脑动脉再往回抽出约2mm即至大脑中动脉口，结扎栓线和血管，缝合皮肤。脑组织缺血后，尾静脉注射给药一次，放回笼中饲养。
[0169]
大鼠用药后24h后，再次用15％的水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉，断头取脑，去除嗅球、小脑和脑干，-20℃冰箱中速冻20min左右；将冰冻好的大脑等分切成7片；将脑切片置于0.5％的ttc染液中进行染色(40℃避光温孵10min)，染色后的脑片梗死区呈白色，非梗死区呈玫瑰红色；染色完成后将脑片移到10％的甲醛溶液中，避光保存24h，最后用数码相机拍照，用图像分析软件(imagej，版本：1.4.3.67)测量出正面和反面梗死区和非梗死区的面积，计算梗死面积占梗死大脑半球总面积的百分率。(以不造模大鼠脑梗死面积为0，造模后仅应用溶媒的大鼠脑梗死面积为100，计算各处理动物脑梗死面积的降低的百分比，见表2)
[0170]
表2羟基红花黄色素a晶型i(羟a)与丁苯酞氯化钠注射液(丁苯酞)对大鼠脑梗死面积的影响
[0171][0172]
*，p＜0.05vs溶媒对照组；**，p＜0.01vs溶媒对照组；***，p＜0.001vs溶媒对照组
[0173]
由表2可知，造模后，试验动物大脑梗死，且阳性药物丁苯酞能够显著降低试验动物的脑梗死面积，表明本次造模成功。同时，丁苯酞和供试品羟基红花黄色素a晶型i都能够
显著降低试验大鼠的脑梗死面积，且在大部分剂量下的差异达到显著水平(p＜0.05)。其中丁苯酞在剂量达到6mg/kg时到达治疗天花板，而羟基红花黄色素a晶型i在剂量80mg/kg时达到治疗天花板，其中前者的效价强度大于后者，而后者的最大治疗效果好于前者。鉴于大量的临床数据已经表明，在上述剂量下羟基红花黄色素a晶型i和丁苯酞对人体都是安全的，所以羟基红花黄色素a的效果更好(表现为在安全剂量下治疗天花板更高)
[0174]
综上，本实施例结果表明，羟基红花黄色素a晶型i能够显著降低缺血大鼠的脑梗死面积，对缺血性脑卒中具有潜在的治疗价值。这与市场上以红花为主要成分的注射剂的临床结果是一致的。
[0175]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。