一种提高氧化葡糖杆菌发酵食醋中总酸含量的方法

1.本发明属于微生物应用和食醋酿造领域，具体涉及一种提高氧化葡糖杆菌发酵食醋中总酸含量的方法。


背景技术：

2.食醋作为一种酸性调味品广泛应用于食品烹饪中，其中醋酸是食醋的主要成分，还含有酚类化合物、黄酮类化合物、类胡萝卜素、植物甾醇、维生素等多种营养物质和功能成分，具有缓解疲劳、促进食欲、调节血糖、抗氧化、降低血压及血中胆固醇、预防动脉硬化及某些癌症等多重功效。随着人们对天然健康产品需求的不断增加，食醋在渔业加工、空气净化等方面也有了广泛应用。因此，食醋的酿造与深加工愈来愈受到人们的重视。
3.超声波常用于微生物细胞破碎，其在微生物发酵中的应用较少且集中于提高微生物细胞膜透性，提高生物量，从而提高产物产量，但也有大量微生物表现出对超声波不敏感、超声波对发酵过程产生抑制或杀伤破坏细胞，不同种或同种不同株微生物的超声波处理效果和机制等均存在很大差异。如周文文等(一种利用超声波提高细菌胞外多糖产量的方法，浙江大学，cn202011455431.9，公开日为2021年4月6日)测定超声处理对多株芽孢杆菌菌株胞外多糖产量的影响，结果表明菌株pyq1的胞外多糖相对于未处理组提高33.79％，菌株50
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3的胞外多糖产量相对于未处理组降低了80.63％，菌株ht16和pyq12的胞外多糖产量相对于未处理组没有显著变化，表明不同芽孢杆菌菌株对超声波处理的耐受性存在差异，对菌株胞外多糖产量会产生不同影响和效果。熊峰等(“低强度超声波对酿酒酵母增殖和发酵效率影响的研究”,江苏大学，公开日为2017年6月1日)通过超声波处理停滞后期酿酒酵母，使酿酒酵母生物量增加了127.03％，通过细胞外蛋白质，核酸和fdp含量进行分析，超声波处理增强了细胞膜的通透性。
4.在液态食醋发酵中，醋酸菌会受到乙醇、乙酸(醋酸)等胁迫条件的影响，特别是醋酸的积累会对醋酸菌有杀灭作用，导致醋酸发酵过程中醋酸菌大量死亡，导致产酸下降，因此提高发酵食醋总酸含量的关键就是提高醋酸菌耐乙醇和醋酸胁迫能力，提升高醋酸下细胞膜的完整性或降低细胞膜的受损程度，而超声波在这方面的应用还未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种提高氧化葡糖杆菌发酵食醋中总酸含量的方法，从而弥补现有技术的不足。
6.本发明首先提供一种能够提高发酵食醋中总酸含量的方法，所述的方法，是使用超声波来处理氧化葡糖杆菌菌液；再使用处理后的氧化葡糖杆菌来发酵制备食醋；
7.所述的超声处理，其一种具体的条件，是使用功率为300～350w的超声波处理氧化葡糖杆菌的菌液，时间为20～30min。
8.所述的氧化葡糖杆菌的菌液，是将氧化葡糖杆菌接种于液体种子培养基进行培养制成种子液或将种子液接种于发酵培养基中发酵制备的发酵液；
9.所述液体种子培养基的成分包含有葡萄糖、酵母提取物、乙醇和蒸馏水；
10.具体地，该液体种子培养基的一种具体组成为：葡萄糖20g/l，酵母浸粉10g/l，乙醇30ml/l，ph6.0。
11.所述的培养，是在ph 6.0，30℃，180rpm培养制得种子液；
12.所述的再使用处理后的氧化葡糖杆菌种子液来发酵制备食醋，是将菌氧化葡糖杆菌菌液接种于酒醪或发酵培养基中来发酵制备食醋；
13.所述的发酵培养基，其一种组成为葡萄糖20g/l，酵母浸粉10g/l，乙醇80ml/l，ph6.0；
14.所述的发酵，其接种量10％，培养温度为30℃，转速500rpm，通气速率设定为0.3vvm，发酵时间24h。
15.所述的氧化葡糖杆菌，为氧化葡糖醋杆菌(gluconobacter oxydans)w
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1株；该菌株于2019年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no：18500。
16.本发明通过超声波处理氧化葡糖杆菌w
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1菌株对数期前期到对数期中期种子液或0.5～2d发酵液，氧化葡糖杆菌w
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1的菌体形体变的细长，细胞壁致密，细胞膜的完整性提高，细胞膜的受损程度降低，显著提升氧化葡糖杆菌w
‑
1产酸发酵性能，提高了氧化葡糖杆菌w
‑
1耐酸能力和食醋的总酸含量。
附图说明
17.图1：超声波处理对氧化葡糖杆菌w
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1菌体生物量的影响图；
18.图2：超声波处理对氧化葡糖杆菌w
‑
1食醋总酸含量的影响图；
19.图3：扫描电镜下的超声波处理氧化葡糖杆菌w
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1菌体形态图；
20.图4：透射电镜下超声波处理氧化葡糖杆菌w
‑
1胞内微观结构图；
21.图5：超声波处理对氧化葡糖杆菌w
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1乙醇脱氢酶比酶活影响图；
22.图6：超声波处理对氧化葡糖杆菌w
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1乙醛脱氢酶比酶活影响图；
23.图7：超声波处理对氧化葡糖杆菌w
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1细胞膜完整性的影响图；
24.图8：超声波处理对氧化葡糖杆菌w
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1菌体存活率的影响图；
25.图9：超声波处理对氧化葡糖杆菌w
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1发酵罐发酵食醋总酸含量的影响图。
具体实施方式
26.氧化葡糖杆菌w
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1具有产非挥发性有机酸高、较好的高温耐受性和高醇耐受性且产酸量较高、酿醋风味好的特点，因此，提高氧化葡糖杆菌w
‑
1的乙醇耐性和发酵食醋中酸含量可以进一步提高其食醋生产效率，节约生产成本，提高企业的经济效益，具有重要的经济价值和实际意义。
27.下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
28.实施例1：超声波处理氧化葡糖杆菌w
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1高醇发酵食醋
29.(1)种子液的制备
30.将氧化葡糖杆菌w
‑
1和沪酿1.01菌株接种于液体种子培养基，所述液体种子培养基的成分为：葡萄糖、酵母提取物、乙醇和蒸馏水；ph 6.0，30℃，180rpm培养24h，制得种子
液。
31.(2)超声发酵
32.将氧化葡糖杆菌w
‑
1和沪酿1.01菌株种子液以5％(v/v)接种到液体发酵培养基中，ph 6.0，30℃，180rpm培养1d后超声波处理，功率为350w，时间为25min；发酵时间为8天。
33.具体地，该发酵培养基的一种具体组成为：葡萄糖20g/l，酵母浸粉10g/l，乙醇80ml/l，ph6.0。
34.由图1种可知，超声波处理氧化葡糖杆菌w
‑
1的菌体生物量在2d时无显著变化，在4d时，其生物量明显高于对照组，在6d、8d时，其生物量与对照组差异不大。而超声处理沪酿1.01生物量在0～6d无显著性差异，发酵8d时明显低于对照组。说明超声处理氧化葡糖杆菌w
‑
1和沪酿1.01对菌体生长产生了不同的作用效果。
35.由图2可知，超声波处理对氧化葡糖杆菌w
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1食醋总酸含量的影响显著，在4d、6d和8d时，食醋中总酸含量分别为1.06g/100ml、3.74g/100ml、5.34g/100ml，分别比对照组(未超声处理)的提高了160.74％、223.38％和30.88％，说明超声波处理可以显著提高氧化葡糖杆菌w
‑
1的总酸生产效率和产量。而超声处理沪酿1.01的总酸产量在6d、8d时分别较对照组降低了24.2％、1.9％。说明超声处理氧化葡糖杆菌w
‑
1和沪酿1.01对菌体总酸产量产生了不同的作用效果。
36.实施例2：超声波处理氧化葡糖杆菌w
‑
1细胞形态和微观结构的变化
37.(1)处理菌体，电镜观察
38.使用扫描和透射电子显微镜(sem和tem)观察超声处理后细菌的形态和超微结构的变化。将每1ml样品以6000rpm离心10分钟。样品的细胞沉淀用2.5％(v/v)的预冷戊二醛在4℃固定2小时。接下来，将样品脱水，包埋并准备超薄切片。然后在透射电子显微镜(jem
‑
1200em)下观察每个样品的截面。
39.(2)扫描电镜图像
40.由图3可知，超声处理氧化葡糖杆菌w
‑
1菌体呈杆菌，较处理前更加细长，表面较为光滑。而未经超声处理的氧化葡糖杆菌w
‑
1的形态趋近于椭圆形，细胞存在着不同程度的损伤，细胞表面有许多不规则的突起。说明超声处理氧化葡糖杆菌w
‑
1可以显著提高其在高醇和高酸环境的耐胁迫能力。
41.(3)透射电镜图像
42.由图4可知，超声波处理氧化葡糖杆菌w
‑
1的细胞壁更加致密，这有助于细胞抵御胞外乙醇和醋酸胁迫损伤，而未经超声处理的氧化葡糖杆菌w
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1的细胞壁更加松散，明显受到乙醇和醋酸的破坏。
43.实施例3：超声波处理氧化葡糖杆菌w
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1乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶活性的变化
44.(1)粗酶液制备
45.取氧化葡糖杆菌w
‑
1发酵液于4℃，8000g离心10min，弃上清。而后用20ml预冷的kpb(50mmol/l，ph6.0)缓冲液重悬菌体，8000g离心10min，弃上清，重复上述操作，洗涤菌体沉淀3次。而后加入20ml的kpb缓冲液重悬菌体，利用scientz
‑
iid超声波细胞粉碎仪进行超声破碎，超声破碎条件为：破碎时间：5min；破碎开/关＝3/3s；破碎功率：40％。破碎后将破碎液于4℃，8000r/min离心5min，所得的上清液即为粗酶液。
46.(2)adh和aldh酶活测定
47.取mcllvaine缓冲液(ph4.0)0.5ml，1.0mol/l乙醇(乙醛)溶液0.1ml，粗酶液0.1ml，10％tritonx
‑
100溶液0.1ml和0.1mol/l铁氰化钾溶液0.2ml于10ml比色管中，25℃保温5min，加入硫酸铁
‑
dupanol溶液0.5ml终止反应，25℃下放置20min，加入3.5ml蒸馏水混合，测定波长660nm下的吸光值。在25℃、ph4.0条件下，1min氧化lμmol乙醇的酶量为一个酶活力单位；4.0光密度等于氧化lμmol乙醇。
[0048][0049][0050]
由图5和图6可知，培养2d，超声波处理氧化葡糖杆菌w
‑
1的adh和aldh活性达到最高值，分别为1.076u/mg和1.767u/mg，是对照组的8.6倍和2.9倍，这说明超声波处理氧化葡糖杆菌w
‑
1较对照组菌株能够更快速的生成醋酸，从而加快生产进度，提高生产效率。
[0051]
实施例4：超声波处理氧化葡糖杆菌w
‑
1细胞膜完整性的变化
[0052]
(1)氧化葡糖杆菌w
‑
1荧光染色
[0053]
取氧化葡糖杆菌w
‑
1发酵液于4℃，4500g离心10min，弃上清。用磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)洗涤两次。将洗涤的细胞重悬于pbs中是菌体浓度达到5
×
107细胞/ml。将500μl细菌悬液与5μl to溶液混合并在30℃下孵育5min，然后添加5μlpi溶液并在30℃下孵育5min。最后，将细胞用pbs洗涤并重悬于pbs中。
[0054]
(2)流式细胞仪测定
[0055]
细胞悬液以低流速递送，速率为900
‑
1000个/s(在前向散射(fsc)与侧向散射(ssc)图中)。在fl1通道中检测到to，而在fl3通道中检测到pi。fsc与ssc的组合用于区分细菌与背景。使用sscvsfl2进行门控可更好地鉴定细菌。通过使用对数放大来收集所有信号：fsc
‑
e01，ssc
‑
551v，fl1
‑
690v，fl2
‑
620v和fl3
‑
829v。在ssc信号上设置了阈值。从sscvsfl2，每个样本计数的总个数为20,000。
[0056]
由图7可知，按照细胞膜完整性可以将氧化葡糖杆菌w
‑
1分为三个类群，分别为死亡细胞(q1)、细胞膜受损细胞(q2)和细胞膜未受损细胞(q3)。发酵2d，超声波处理氧化葡糖杆菌w
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1的细胞膜未受损细胞占比为30.5％，比对照组高了84.85％。同时，超声波处理氧化葡糖杆菌w
‑
1的死亡细胞数和细胞膜受损细胞数分别为31.7％和24.8％，明显低于对照组的死亡细胞数和细胞膜受损细胞数的占比，分别为40％，34.9％。发酵4d，超声处理氧化葡糖杆菌w
‑
1的细胞膜未受损细胞数依然明显高于对照组。这说明超声波处理氧化葡糖杆菌w
‑
1提升其总酸含量不是通过提高其膜透性来实现的，而是提高了氧化葡糖杆菌w
‑
1在高醇和高酸环境的耐胁迫能力。
[0057]
实施例5：超声波处理氧化葡糖杆菌w
‑
1菌体活菌数的变化
[0058]
将培养至2d、4d、6d、8d氧化葡糖杆菌w
‑
1发酵液(超声处理和未处理的)梯度稀释，涂布于固体培养基平板上，30℃倒置培养72h。进行平板菌落计数。
[0059]
固体培养基组成：葡萄糖20g/l、酵母浸粉10g/l、琼脂粉20g/l、碳酸钙20g/l、乙醇20ml/l。
[0060]
由图8可知，超声处理氧化葡糖杆菌w
‑
1在2d、4d的菌体活菌数显著高于对照组，这
与图7细胞膜完整性数据相对应。在6d、8d，随着醋酸大量生成，总酸含量达到3.7g/100ml以上(图6)，超声处理氧化葡糖杆菌w
‑
1的菌体活菌数有所下降，但仍然维持在较高水平。而对照组菌体活菌数增长缓慢，说明其耐乙醇胁迫能力较差。
[0061]
实施例6：超声波处理氧化葡糖杆菌w
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1发酵罐实验
[0062]
(1)氧化葡糖杆菌w
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1种子液的制备及超声处理
[0063]
将氧化葡糖杆菌w
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1接种于液体种子培养基中，于30℃，180rpm摇床培养。超声处理生长到16h(对数中期)的种子液，功率为350w，处理时间为25min，温度为25℃。处理完后在30℃、180r/min条件下培养至24h。
[0064]
(2)发酵罐发酵
[0065]
取2l酒精含量为6.7％的酒醪添加到灭菌后的发酵罐中，接种量10％，培养24h的种子接种到发酵罐，培养温度为30℃，转速500rpm，通气速率设定为0.3vvm，发酵至24h到达发酵终点。
[0066]
由图9可知，超声处理氧化葡糖杆菌w
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1发酵食醋的总酸含量为5.55g/100ml，比对照组(未超声处理)提高了25.2％。说明通过超声波处理氧化葡糖杆菌w
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1种子液可以显著提高其发酵食醋的总酸含量和生产效率。
[0067]
以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对发明进行了详细的描述，但本领域的技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。