一种抑菌酵母活性多糖及制备方法、鉴定方法和应用与流程

1.本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种抑菌酵母活性多糖及制备方法、鉴定方法和应用。


背景技术：

2.饲用促生长抗生素长期不合理不规范使用导致细菌耐药性以及畜禽产品抗生素残留等安全性风险日趋严重，畜禽养殖“减抗、无抗”等行业大背景需求下，新型具有替代饲用促生长抗生素作用的产品研究不断涌现。
3.多糖作为高等动植物细胞膜及微生物细胞壁的天然大分子物质，研究发现具有多种生物活性功能，包括免疫、降血糖、抗肿瘤、调控肠道菌群等。功能性生物多糖的研究也正紧随核酸和蛋白质研究之后受到广泛关注。在动物养殖领域，伴随着绿色健康养殖、无抗养殖等需求日益增长，功能性生物多糖也被广泛关注。
4.酵母细胞壁作为酵母源生物饲料的重要组成部分，研究发现其化学成分主要为甘露聚糖、葡聚糖、蛋白质以及少量的几丁质和脂类等。目前研究报道称酵母细胞壁发挥主要生理功效的成分主要是主链以α-1,6糖苷键连接，支链以α-1,2或者α-1,3糖苷键结合的α-甘露聚糖和以β-1,3/1,6糖苷键链接的β-葡聚糖。研究发现传统酵母细胞壁能够吸附肠道病原菌、促进肠道有益菌群、调节机体免疫、特异性吸附玉米赤霉烯酮等生理功效，因此已经被广泛应用于畜禽养殖中。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题：提供一种抑菌酵母活性多糖，其抑菌效果更稳定。
6.针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一提供一种抑菌酵母活性多糖，本发明的目的之二提供上述抑菌酵母活性多糖的制备方法，本发明的目的之三提供上述抑菌酵母活性多糖的鉴定方法，本发明的目的之四提供上述抑菌酵母活性多糖在畜禽养殖中的应用。
7.本发明的技术方案：
8.本发明提供一种抑菌酵母活性多糖，以抑菌酵母活性多糖总重为100％计，包含总糖含量为65-85％，蛋白质含量为2-5％，其中重均分子量为90000-110000da。
9.优选的是，所述抑菌酵母活性多糖为具有吡喃环结构的多糖，优选地，所述抑菌酵母活性多糖具有三维螺旋结构。
10.优选的是，所述抑菌酵母活性多糖的单糖组成为盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖和甘露糖。
11.优选的是，所述抑菌酵母活性多糖为swap-1：其单糖组成摩尔比为盐酸氨基葡萄糖:葡萄糖:甘露糖＝0.109:0.422:0.469。
12.优选的是，所述抑菌酵母活性多糖为swap-2：其单糖组成摩尔比为盐酸氨基葡萄糖:葡萄糖:甘露糖＝0.090:0.551:0.349。
13.优选的是，所述抑菌酵母活性多糖为swnp，其单糖组成还包括葡萄糖醛酸，单糖组成摩尔比为盐酸氨基葡萄糖:葡萄糖:甘露糖:葡萄糖醛酸＝0.086:0.552:0.344:0.018。
14.优选的是，所述抑菌酵母活性多糖包含以下3种多糖中两种或两种以上：(1)swap-1：其单糖组成摩尔比为盐酸氨基葡萄糖:葡萄糖:甘露糖＝0.109:0.422:0.469；(2)swap-2：其单糖组成摩尔比为盐酸氨基葡萄糖:葡萄糖:甘露糖＝0.090:0.551:0.349；(3)swnp：单糖组成摩尔比为盐酸氨基葡萄糖:葡萄糖:甘露糖:葡萄糖醛酸＝0.086:0.552:0.344:0.018。
15.本发明还提供上述抑菌酵母活性多糖的制备方法，包括如下步骤：
16.(1)热提取：将酵母细胞壁进行热水提取，离心分离得到上清液；
17.(2)蒸发：将步骤(1)得到上清液蒸发得到浓缩液；
18.(3)乙醇沉淀：向步骤(2)得到的浓缩液中加入乙醇，离心分离得到固形物粗酵母多糖；
19.(4)脱蛋白：将步骤(3)得到的粗酵母活性多糖配制成溶液，加入sevag试剂重复脱蛋白1-10次，离心分离收集滤液，将滤液重复步骤(3)得到脱蛋白酵母活性多糖。
20.(5)分离纯化：将步骤(4)得到的脱蛋白多糖依次经离子交换层析、凝胶柱层析得到抑菌酵母活性多糖。
21.优选的是，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，酵母细胞壁的制备方法如下：
22.a.自溶破壁
23.将酵母原料进行自溶处理，自溶条件：氯化钠质量浓度为5％，ph为5.5，温度为75℃，自溶25小时后，5000rpm离心处理，得到位于上层的酵母自溶物和位于下层的酵母细胞壁乳，收集酵母细胞壁乳进行酶解处理。
24.b.酶解
25.将步骤a得到的酵母细胞壁乳加水，依次加入甘露聚糖酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶进行酶解处理；
26.c.喷雾干燥
27.将步骤b得到的溶液升温至85℃保温处理1.5h，然后进行喷雾干燥处理，得到经过改性的酵母细胞壁粉末。
28.优选的是，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，步骤(1)所述酵母细胞壁的酵母原料来源于酿酒酵母和/或假丝酵母。
29.优选的是，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，所述步骤(1)热提取温度为30-50℃，优选的，料液重量比为1:5-15。
30.优选的是，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，所述步骤(3)乙醇沉淀时乙醇和浓缩液的体积比为1:1-10。
31.优选的是，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，所述步骤(3)离心分离前还包括将乙醇和浓缩液的混合液冷藏，优选的，所述冷藏温度为2-6℃，进一步优选的，冷藏时间为12-24h。
32.优选的是，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，所述步骤(3)还包括将离心分离得到固形物进行冷冻干燥。
33.优选的是，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，所述步骤(4)中粗多糖溶液和
sevag试剂的体积比3-5:1。sevag试剂采用氯仿和正丁醇体积比为5:1配制而成。
34.本发明还提供上述抑菌酵母活性多糖或上述制备方法制得抑菌酵母活性多糖的鉴定方法，包括如下步骤：取抑菌性活性酵母活性多糖样品，分别进行离子色谱检测和红外光谱检测。
35.本发明还提供上述抑菌酵母活性多糖或上述制备方法制备的抑菌酵母活性多糖在畜禽养殖中的应用。
36.本发明的有益效果：本发明通过对酵母细胞壁进行提取、分离纯化，得到总糖含量为65-85％，重均分子量为90000-110000da的抑菌酵母活性多糖，进一步结构鉴定得到多糖swnp、多糖swap-1和多糖swap-2，并对它们进行抑菌活性评价，结果表明，上述多糖均具有抑菌活性，和酵母细胞壁相比，抗菌活性提高4倍以上，用作饲料添加领域可大大提高抑菌效果的稳定性，实现替代抗生素的目的。
附图说明
37.图1为抑菌酵母活性多糖swnp的分子量图谱
38.图2为抑菌酵母活性多糖swap-1的分子量图谱
39.图3为抑菌酵母活性多糖swap-2的分子量图谱
40.图4为swnp、swap-1和swap-2与刚果红试剂混合溶液在不同naoh浓度下最大吸收波长的变化曲线
41.图5为抑菌酵母活性多糖swnp的红外光谱图
42.图6为抑菌酵母活性多糖swap-1的红外光谱图
43.图7为抑菌酵母活性多糖swap-2的红外光谱图
44.图8为抑菌酵母活性多糖swnp的离子色谱图
45.图9为抑菌酵母活性多糖swap-1的离子色谱图
46.图10为抑菌酵母活性多糖swap-2的离子色谱图
具体实施方式
47.本发明提供一种从酵母细胞壁中提取、分离纯化得到的抑菌酵母活性多糖，相比酵母细胞壁，其抑菌活性大大提高。本发明提供了一种抑菌酵母活性多糖，以抑菌酵母活性多糖总重为100％计，包含总糖含量为65-85％，蛋白质含量为2-5％，其中重均分子量为90000-110000da。所述抑菌酵母活性多糖可以作为饲料添加剂应用，提高抑菌效果的稳定性，可替代抗生素。
48.在本发明又一个优选实施方式，所述抑菌酵母活性多糖为具有吡喃环结构的多糖，优选地，所述抑菌酵母活性多糖具有三维螺旋结构。
49.在本发明的又一个优选实施方式，所述抑菌酵母活性多糖的单糖组成为盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖和甘露糖。
50.在本发明的又一个优选实施方式，所述抑菌酵母活性多糖为swap-1：其单糖组成摩尔比为盐酸氨基葡萄糖:葡萄糖:甘露糖＝0.109:0.422:0.469。
51.在本发明的又一个优选实施方式，所述抑菌酵母活性多糖为swap-2:：其单糖组成摩尔比为盐酸氨基葡萄糖:葡萄糖:甘露糖＝0.090:0.551:0.349。
52.在本发明的又一个优选实施方式，所述抑菌酵母活性多糖为swnp：其单糖组成还包括葡萄糖醛酸，单糖组成摩尔比为盐酸氨基葡萄糖:葡萄糖:甘露糖:葡萄糖醛酸＝0.086:0.552:0.344:0.018。
53.在本发明的又一个优选实施方式，所述抑菌酵母活性多糖包含以下3种多糖中两种或两种以上：(1)swap-1：其单糖组成摩尔比为盐酸氨基葡萄糖:葡萄糖:甘露糖＝0.109:0.422:0.469；(2)swap-2：其单糖组成摩尔比为盐酸氨基葡萄糖:葡萄糖:甘露糖＝0.090:0.551:0.349；(3)swnp：单糖组成摩尔比为盐酸氨基葡萄糖:葡萄糖:甘露糖:葡萄糖醛酸＝0.086:0.552:0.344:0.018。
54.不受理论限制，本发明提供的抑菌酵母活性多糖的抑菌效果，与抑菌酵母活性多糖的单糖组成含量和多糖的结构等是相关。
55.本发明还提供上述抑菌酵母活性多糖的制备方法，包括如下步骤：
56.(1)热提取：将酵母细胞壁进行热水提取，离心分离得到上清液；
57.(2)蒸发：将步骤(1)得到上清液蒸发得到浓缩液；
58.(3)乙醇沉淀：向步骤(2)得到的浓缩液中加入乙醇，离心分离得到固形物粗酵母多糖；
59.(4)脱蛋白：将步骤(3)得到的粗酵母多糖配制成溶液，加入sevag试剂重复脱蛋白1-10次，离心分离收集滤液，将滤液重复步骤(3)得到脱蛋白酵母多糖。
60.(5)分离纯化：将步骤(4)得到的脱蛋白多糖依次经离子交换层析、凝胶柱层析得到抑菌酵母活性多糖。
61.在本发明的又一个优选实施方式，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，酵母细胞壁的制备方法如下：
62.a.自溶破壁
63.将酵母原料进行自溶处理，自溶条件：氯化钠质量浓度为5％，ph为5.5，温度为75℃，自溶25小时后，5000rpm离心处理，得到位于上层的酵母自溶物和位于下层的酵母细胞壁乳，收集酵母细胞壁乳进行酶解处理。
64.b.酶解
65.将步骤a得到的酵母细胞壁乳加水，依次加入甘露聚糖酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶进行酶解处理；
66.c.喷雾干燥
67.将步骤b得到的溶液升温至85℃保温处理1.5h，然后进行喷雾干燥处理，得到经过改性的酵母细胞壁粉末。
68.在本发明的又一个优选实施方式，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，步骤(1)所述酵母细胞壁的酵母原料来源于酿酒酵母和/或假丝酵母。
69.在本发明的又一个优选实施方式中，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，所述步骤(1)热提取温度为30-50℃，优选的，料液重量比为1:5-15。
70.在本发明的又一个优选实施方式，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，所述步骤(3)乙醇沉淀时乙醇和浓缩液的体积比为1:1-10。
71.在本发明的又一个优选实施方式，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，所述步骤(3)离心分离前还包括将乙醇和浓缩液的混合液冷藏，优选的，所述冷藏温度为2-6℃，进
一步优选的，冷藏时间为12-24h。
72.在本发明的又一个优选实施方式，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，所述步骤(3)还包括将离心分离得到固形物进行冷冻干燥。
73.在本发明的又一个优选实施方式，上述抑菌酵母活性多糖的制备方法中，所述步骤(4)中粗多糖溶液和sevag试剂的体积比3-5:1。sevag试剂采用氯仿和正丁醇体积比为5:1配制而成。
74.本发明还提供上述抑菌酵母活性多糖或上述制备方法制得抑菌酵母活性多糖的鉴定方法，包括如下步骤：取抑菌性酵母活性多糖样品，分别进行离子色谱检测和红外光谱检测。
75.本发明还提供上述抑菌酵母活性多糖或上述制备方法制备的抑菌酵母活性多糖在畜禽养殖中的应用。
76.菌种保藏信息：
77.本发明所采用酿酒酵母fx-2(saccharomyces cerevisiae fx-2)于2016年8月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2016418。该菌株在公开号为cn108220175a的专利公开文本中已有记载。
78.本发明所采用假丝酵母c1.7(wickerhamomyces anomalus c1.7)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2017782。该菌株在公开号为cn110959853a的专利公开文本中已有记载。
79.下面将通过具体的实施例、实验例对本发明抑菌活性多糖及其制备方法、鉴定方进行具体说明。
80.本发明实施例和对比例使用原料和设备来源见表1。
81.表1本发明实施例和对比例使用原料和设备来源
82.[0083][0084]
实施例1
[0085]
(一)酵母细胞壁的制备
[0086]
1.将酿酒酵母fx-2菌株斜面以2环的接种量至100ml摇瓶液体培养基中，放置摇床培养，设置转速250r/min，温度30℃，培养18h。其中，发酵培养基的配方为：总糖浓度为28％的糖蜜，10l；(nh4)2so4，500g；nh4h2po4,80g；mgso4,56g；znso4,28g；h2o，20l；ph为6.0。
[0087]
2.将上述酵母初级原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为5％，ph为5.5，温度为75℃，自溶25小时后，5000rpm离心处理，得到位于上层的酵母自溶物和位于下层的酵母细胞壁乳，收集酵母细胞壁乳进行酶解处理。
[0088]
3.酶解
[0089]
(1)将步骤2得到的酵母细胞壁乳加水稀释成为20％的浓度，加入0.5％质量浓度的甘露聚糖酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度为45℃，ph为7.5，水解时间为10小时；
[0090]
(2)继续加入0.6％质量浓度的碱性蛋白酶，控制温度50℃，ph为7.5，水解时间为10小时；
[0091]
(3)调节步骤(2)处理后的溶液的温度为58℃，ph为7.0，然后继续加入0.03％质量浓度的木瓜蛋白酶，酶解5小时；
[0092]
(4)调节步骤(2)处理后的溶液的温度为85℃，保温处理1.5h，得到灭活后的溶液；
[0093]
(5)调节灭酶后的溶液温度为50℃，ph为4.5，然后加入0.1％质量浓度的纤维素酶，酶解5小时；
[0094]
(6)向步骤(5)处理后的溶液中加入0.1％质量浓度的β-葡聚糖酶，水解12小时；
[0095]
(7)将步骤(6)得到的溶液升温至85℃保温处理1.5h，然后进行喷雾干燥处理，得到酵母细胞壁粉末。
[0096]
(二)抑菌酵母活性多糖的制备
[0097]
1.热提取：准确称取步骤(一)中制得酵母细胞壁60g，加入600g的去离子水，于50℃下磁力搅拌1h，使样品溶解均匀；将样品分装到100ml离心管中，6000rpm离心20min，收集上清液；上清液旋转蒸发浓缩，浓缩液的体积为60ml。
[0098]
2.乙醇沉淀：在上述步骤1所得浓缩液中加入4倍体积无水乙醇，混匀后4℃冰箱冷藏12h，4500rpm离心10min，收集沉淀并冷冻干燥，得到粗多糖。
[0099]
3.脱蛋白：将步骤2所得粗多糖配制为20mg/ml，加入sevag试剂(粗多糖溶液：sevag试剂体积比为3:1)，在摇床震荡0.5h后，10000rpm离心1min，收集上层水层，按照上述方法用sevag试剂反复除蛋白4次。将收集到的上层水层倒入离心管中，在离心管中加入4倍体积无水乙醇，混匀后4℃冰箱冷藏12h，4500rpm离心10min，收集沉淀并冷冻干燥，得到脱蛋白多糖。
[0100]
4.离子交换层析：将步骤3所得脱蛋白多糖配制成20mg/ml溶液上deae纤维素层析柱，体积5ml，流速1ml/min，先以200ml去离子水洗脱柱子，然后分别以200ml0.1 mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l的nacl溶液进行梯度洗脱，每10ml收集一管。每隔一管，取样100ul用苯酚-浓硫酸法跟踪检测洗脱液中多糖含量，绘制洗脱曲线，出现两个洗脱峰，合并同一洗脱峰的收集液，浓缩，透析除盐，冻干，得到多糖swn和多糖swa。
[0101]
5.凝胶柱层析：将步骤4得到的多糖swn和多糖swa分别配制成40mg/ml溶液，将上述两种多糖溶液分别上sephadex g-100层析柱，然后用200ml去离子水洗脱，每试管收集5ml。取样100ul用苯酚-浓硫酸法跟踪检测洗脱液中多糖的含量，绘制洗脱曲线，多糖swn样品出现一个洗脱峰，多糖swa样品出现两个洗脱峰，合并同一洗脱峰的收集液，冻干，得到抑菌酵母活性多糖swnp、抑菌酵母活性多糖swap-1和抑菌酵母活性多糖swap-2。
[0102]
(三)抑菌酵母活性多糖产品测定
[0103]
1.总糖和蛋白质含量的测定
[0104]
1)总糖含量的测定方法
[0105]
采用苯酚-浓硫酸法测定总糖含量。分别吸取0.1mg/ml标准葡萄糖标准溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml加入试管，各自补水(去离子水)至1ml。每管加入6％苯酚溶液
0.5ml，迅速滴加浓硫酸2.5ml，立即摇匀，放置20min，以空白参照(去离子水1.0ml)，于490nm处测吸光度。同一浓度的标准溶液分别重复测定3次。以吸光度值(y)对葡萄糖质量浓度(x)作回归处理，得到回归方程。
[0106]
准确称取样品10mg，在100ml容量瓶中定容，配制为0.1mg/ml。取1ml后，按照上述方法进行操作，对照标准曲线计算多糖含量，三次平行重复。样品总糖含量(％)＝以葡萄糖计的浓度(mg/ml)
×
0.9/样品浓度(mg/ml)。
[0107]
2)蛋白质含量的测定方法
[0108]
采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。分别吸取0.1mg/ml牛血清蛋白标准溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml加入试管中。各补水至1ml，加考马斯亮蓝溶液5ml，5-20min内，以空白参照，于595nm处测吸光度值。以吸光度(y)对蛋白质质量(x)作回归处理，得到回归方程。
[0109]
准确称取样品10mg，在100ml容量瓶中定容，配制为0.1mg/ml。取1ml后，按照上述方法进行操作，对照标准曲线计算蛋白质含量，三次平行重复。
[0110]
3)测定结果
[0111]
抑菌酵母活性多糖swnp、swap-1和swap-2中总糖含量和蛋白质含量测定结果如表2所示，
[0112]
表2抑菌酵母活性多糖总糖含量和蛋白质含量测定结果
[0113]
抑菌酵母活性多糖总糖(％)蛋白(％)swnp74.04
±
1.352.73
±
0.37swap-184.01
±
1.462.53
±
0.12swap-267.74
±
1.462.35
±
0.15
[0114]
2.抑菌酵母活性多糖分子量的测定
[0115]
1)抑菌酵母活性多糖分子量的测定方法
[0116]
采用高效凝胶渗透色谱法(hpgpc)测定抑菌酵母活性多糖分子量；
[0117]
hpgpc色谱条件：色谱柱：brt105-104-102串联凝胶柱(8
×
300mm)；流动相：0.05mol/l nacl溶液；流速：0.6ml/min，柱温：40℃；进样量：20μl；检测器：示差检测器rid-10a。
[0118]
标准曲线的绘制：分别称取5mg/ml不同分子量葡聚糖标准品(葡聚糖标准品1152、葡聚糖标准品5000、葡聚糖标准品11600、葡聚糖标准品23800、葡聚糖标准品48600、葡聚糖标准品80900、葡聚糖标准品148000、葡聚糖标准品273000、葡聚糖标准品409800、葡聚糖标准品667800、葡聚糖标准品3693000)配制标准溶液，12000rpm离10min，取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，用hpgpc检测，绘制标准曲线。
[0119]
准确称取样品，样品配制成5mg/ml溶液，12000rpm离10min，取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，用hpgpc检测，根据标准曲线，由浓度计算出样品的分子量大小。
[0120]
2)抑菌酵母活性多糖分子量测定结果
[0121]
抑菌酵母活性多糖swnp、swap-1和swap-2的分子量图谱如图1-3所示，经计算得出swnp、swap-1和swap-2的分子量如表3所示。
[0122]
表3多糖分子量测定结果
[0123][0124]
4.与刚果红试剂的反应
[0125]
1)测定方法
[0126]
精确称取抑菌酵母活性多糖样品4mg，加入去离子水和80umol/l刚果红试剂各2ml，加入适量1mol/lnaoh溶液，使溶液中碱浓度分别为0.0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mol/l，充分混匀静置5min后用紫外可见分光光度计于400-600nm波长范围内进行扫描，测定最大吸收波长。以不加多糖样品的刚果红溶液为对照。横坐标naoh浓度，纵坐标为最大吸收波长绘制曲线。
[0127]
2)测定结果
[0128]
swnp、swap-1和swap-2与刚果红试剂混合溶液在不同naoh浓度下最大吸收波长的变化见图4，当naoh浓度从0-0.1mol/l时，swnp、swap-1和swap-2与刚果红试剂混合溶液的最大吸收波长发生红移，这表明swnp、swap-1和swap-2具有三螺旋结构，可与刚果红试剂发生络合反应；naoh浓度从0.1-0.5mol/l时，swnp、swap-1和swap-2与刚果红试剂混合溶液的最大吸收波长降低，这表明此时swnp、swap-1和swap-2的三螺旋结构被破坏，无法与刚果红试剂发生络合反应。
[0129]
实施例2
[0130]
采用红外光谱和离子色谱(ic)对抑菌酵母活性多糖swnp、swap-1和swap-2进行结构分析。
[0131]
(一)试验方法
[0132]
1.红外光谱测试方法
[0133]
将干燥的分析样品与kbr研磨后，压片，用ft/ir在4000-400cm-1
范围内扫描。
[0134]
2.离子色谱(ic)测定单糖组成的测试方法
[0135]
ic色谱条件：色谱柱：dionexcarbopactmpa20(150mm
×
3mm)；流动相：a:h2o；b:15mmol/lnaoh；c:15mmol/lnaoh&100mmol/l naoac；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；柱温：30℃；检测器：电化学检测器。
[0136]
样品前处理方案：准确称取10mg样品置于安瓿瓶中，加入3mol/l tfa 10ml，120℃水解3h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入5ml去离子水涡旋混匀，吸取100ul加入900ul去离子水，12000rpm离心5min。上清液进ic分析。
[0137]
标准曲线：各取16种10mg/ml单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、n-乙酰-d氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)标准溶液精密配置0.01、0.1、0.5、1、5、10、20mg/l梯度浓度。
[0138]
结果计算：根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔
比。
[0139]
(二)试验结果
[0140]
1.红外光谱分析结果
[0141]
swnp、swap-1和swap-2的红外光谱分析结果，如图5-7。由图5可知，swnp在3262cm-1
、2935cm-1
、1636cm-1
、1410cm-1
、1022cm-1
、915cm-1
、810cm-1
和579cm-1
处有较强吸收峰；由图6可知，swap-1在3290cm-1
、2933cm-1
、1651cm-1
、1386cm-1
、1021cm-1
、911cm-1
、811cm-1
和588cm-1
处有较强吸收峰；由图7可知，swap-2在3281cm-1
、2933cm-1
、1645cm-1
、1362cm-1
、1019cm-1
、915cm-1
、808cm-1
和599cm-1
处有较强吸收峰。其中3262cm-1
、3290cm-1
和3281cm-1
出现较宽的吸收峰，为多糖-oh的伸缩振动，在2935cm-1
和2933cm-1
的吸收峰为多糖的c-h伸缩振动，在1636cm-1
、1651cm-1
和1645cm-1
的吸收峰为多糖的o-h的弯曲振动，在1410cm-1
、1386cm-1
和1362cm-1
的吸收峰为多糖的c-h变角振动，在1126cm-1
、1128cm-1
和1127cm-1
的吸收峰为吡喃环上c-o-c伸缩振动，在1022cm-1
、1021cm-1
和1019cm-1
的吸收峰为吡喃环上c-o-h伸缩振动，在915cm-1
和911cm-1
的吸收峰表明存在β-糖苷键，在810cm-1
、811cm-1
和808cm-1
的吸收峰表明存在α-糖苷键，579cm-1
、588cm-1
和599cm-1
的吸收峰为吡喃糖的骨架对称伸缩振动。综上所述，swnp、swap-1和swap-2是具有吡喃环结构的多糖，糖与糖之间由α-糖苷键和β-糖苷键连接。
[0142]
2.离子色谱(ic)测定结果
[0143]
swnp、swap-1和swap-2的离子色谱(ic)测定结果，如图8-10和表4所示，由图8和表4可知，swnp的单糖组成为由盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，其摩尔比0.086:0.552:0.344:0.018；由图9和表4可知，swap-1的单糖组成为由盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖和甘露糖，其摩尔比为0.109:0.422:0.469；由图10和表4可知，swap-2的单糖组成为由盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖和甘露糖，其摩尔比为0.090:0.551:0.349。
[0144]
表4抑菌酵母活性多糖的单糖组成及摩尔比
[0145]
[0146][0147]
实验例1
[0148]
将实施例1步骤(一)制得的酵母细胞壁、swnp、swap-1和swap-2进行mic(最小抑菌浓度)实验。具体实验过程和实验结果如下：
[0149]
1.试验方法
[0150]
按照clsi m07-a9中宏量肉汤稀释法(试管法)测定样品对实验菌株的mic，具体方法如下：取灭菌试管9支，每管加入灭菌肉汤1ml，然后第1管加入1ml受试药液，混匀并取出1ml至第2管，依次类推到第7管取1ml弃去。第8管不加药，第9管为加空白肉汤不加细菌，作为对照。例如样品梯度为：200、100、50、25、12.5、6.25和3.13mg/ml。第1-8管加入稀释后的菌悬液1ml混匀后置于37℃恒温培养箱孵育16-20h，观察结果，以肉眼所见能完全抑制细菌生长的最小浓度为mic。
[0151]
2.试验结果
[0152]
mic(最小抑菌浓度)实验结果如表5所示，与分离提纯前酵母细胞壁相比，本发明制备的swnp、swap-1和swap-2对大肠杆菌的抑菌效果较分离提纯前酵母细胞壁提高了4倍，对金黄色葡萄球菌抑菌效果，swnp较分离提纯前酵母细胞壁提高了8倍，swap-1和swap-2较分离提纯前酵母细胞壁提高了4倍。
[0153]
表5 mic(最小抑菌浓度)实验结果
[0154]
[0155]
综上所述，本发明通过对酵母细胞壁进行提取、分离纯化，得到总糖含量为65-85％，重均分子量为90000-110000da的抑菌酵母活性多糖，进一步结构鉴定得到抑菌酵母活性多糖swnp、swap-1和swap-2，并对它们进行抑菌活性评价，结果表明，上述抑菌酵母活性多糖均具有抑菌活性，和酵母细胞壁相比，抗菌活性提高4倍以上，用作饲料添加领域可大大提高抑菌效果的稳定性，实现替代抗生素的目的。
[0156]
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。