一种水稻粒形主效QTL的InDel分子标记GW6a-InDel及其检测引物和应用的制作方法

文档序号：25986759发布日期：2021-07-23 20:55阅读：79来源：国知局

本发明涉及水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻粒形主效qtl的indel分子标记gw6a-indel及其检测引物和应用。

背景技术：

水稻是世界上最重要的谷类作物之一，也是世界上约一半人口的主要粮食来源，水稻产量的稳步提高对于我国乃至全球的粮食生产和稳定具有重要意义。水稻产量主要单株穗数、每穗粒数和粒重决定。其中，粒形是影响水稻粒重的最重要因素之一，同时也影响着稻米品质。粒形有关的三个主要性状分别为粒长、粒宽、千粒重。水稻粒形不仅直接决定水稻品种的外观品质，而且对水稻品种的高产起重要作用。因此，发掘利用新的粒形基因等位变异也是水稻分子育种的研究目的之一。

根据gramene网站(http://www.gramene.org/qtl/)公布的数据，目前和水稻粒形相关的主效qtl有18个，分布于水稻各条染色体上。然而，在这些研究中，大多数qtls仅在特定的遗传背景中被发现和定位，存在于其他的品种中的等位变异却并没有被发现以及研究，导致对这些qtl的基因分布和功能研究不够完善。现在主要利用分子测序手段，对这些主效qtl在一些特异种质中检测分析。通过基因序列分析的策略，对已克隆的主效qtl的新型等位变异进行挖掘，以期对这些主效qtl的在不同材料中的分布和功能进行完善。

水稻粒形是重要的产量性状，因此发掘新的水稻主效粒形qtl位点的等位变异，可为进一步阐明水稻粒形遗传机制及调控网络及高产、广适性水稻育种提供理论和实践支持。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种水稻粒形主效qtl的indel分子标记gw6a-indel及其检测引物和应用。本发明所述分子标记与粒形qtl紧密连锁，可用于鉴定和选育是否含有新型等位变异gw6a-2的水稻品种，进而实现细长粒表型的目标水稻品种的选择。

本发明提供了一种水稻粒形主效qtl的indel分子标记gw6a-indel，所述gw6a-indel的核苷酸序列如seqidno:1所示；在所述seqidno:1中存在连续的2或3个重复序列；所述重复序列为cgtctt。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述indel分子标记gw6a-indel的试剂，所述试剂包括引物对；所述引物对包括核苷酸序列如seqidno:2所述的正向引物和核苷酸序列如seqidno:3所示的反向引物。

本发明还提供了一种用于检测水稻粒形性状的试剂盒，包括上述技术方案所述试剂。

优选的是，所述试剂盒还包括dntps、taqdna聚合酶和含镁离子的10×taqbuffer。

本发明还提供了上述技术方案所述indel分子标记gw6a-indel或上述技术方案所述试剂或上述技术方案所述试剂盒在检测水稻粒形中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述indel分子标记gw6a-indel或上述技术方案所述试剂或上述技术方案所述试剂盒在选育细长粒形的水稻品种中的应用。

本发明还提供了一种检测水稻粒形的方法，包括以下步骤：

1)提取待测水稻的dna；

2)以步骤1)提取的dna为模板，用上述技术方案所述试剂中的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；

3)对步骤2)中扩增产物进行分析，根据扩增产物的长度判断待测水稻的粒形情况：当所述扩增产物长度为130bp，则待测水稻的基因型为gw6a，粒型为短粒；如果所述扩增产物的长度为136bp，则所述待测水稻的基因型为gw6a-2，粒型表现为细长粒；如果扩增产物为杂合型，则待测水稻的基因型为gw6a/gw6a-2，粒形介于两者之间。

优选的，步骤2)中所述pcr扩增的反应体系如下：1μldna、0.5μl10mmol的正向引物、0.5μl10mmol的反向引物、1μl含20mmmg²⁺的10×taqbuffer、0.2μl10mmdntps、0.2μl2u/μltaqdna聚合酶和6.6μlddh2o。

优选的，步骤2)中所述pcr扩增的反应程序为95℃预变性4min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共32个循环；最后72℃延伸10min。

优选的，所述待测水稻的品种包括日本晴、9311、中恢9308、中恢8015、长粒粳、bg1、ir56、华占、中花11、02428、南京11、玉针香、ir24、ir26和ir64。

本发明提供了一种水稻粒形主效qtl的indel分子标记gw6a-indel。本发明首次发现了位于水稻第6染色体长臂上的控制粒形的主效基因gw6a新等位变异，并获得了可用于区分二者的indel分子标记gw6a-indel。只需要检测上述标记的扩增条带特性，可以判断目标材料中的gw6a位点是否是新的等位变异gw6a-2，用于指导水稻粒形改良的育种工作，如可以实现具有细长粒表型品种的筛选。本发明所述分子标记不仅在苗期就能区别水稻品种的基因型，而且能够方便、快捷、直接地实现目标基因在水稻种质资源以及育种后代中的鉴定，极大的降低了劳动成本、节约时间且不受环境及人为因素的影响。

附图说明

图1为本发明提供的采用本发明所述分子标记gw6a-indel对不同水稻品种粒形鉴定结果；其中1～15分别代表：1，日本晴；2，9311；3，中恢9308；4，中恢8015；5，长粒粳；6，bg1；7，ir56；8，华占；9，中花11；10，02428；11，南京11；12，玉针香；13，ir24；14，ir26；15，ir64。

具体实施方式

本发明提供了一种水稻粒形主效qtl的indel分子标记gw6a-indel，所述gw6a-indel的核苷酸序列如seqidno:1所示：gctcgacgcagagagacatgcccgccttcttcttctt(cgtctt)2或3ggtcttcttcttctccttggcggcggcgccgtcgccgtcgtcggcgtggtcgtgaaccgccgccatgtcgccggacaggcc；在所述seqidno:1中存在连续的2或3个重复序列；所述重复序列为cgtctt。本发明在gw6a精确定位的基础上，对其在多个品种上进行测序鉴定分析(具体为对大粒籼稻品种bg1和xlj中的gw6a基因座进行二代测序，与参照品种日本晴的基因组序列进行比对)，发现新的等位变异，即在第一个外显子的+202位点插入了一段cgtctt的重复序列，命名该主效粒形qtl为gw6a-2。序列表中提供了大粒籼稻品种bg1(seqidno.4，gw6a-2)、xlj(seqidno.5，gw6a-2)和日本晴(seqidno.6，gw6a)的gw6a基因序列。与gw6a的编码区序列(对应2个重复序列)相比，新的等位变异(对应3个重复序列)在第一个外显子的一段cgtctt重复序列处(+202位点)，多插入了一段cgtctt，原本的两个重复，插入后产生三个重复。对应的编码序列转录产物在原本的对应位点是一段富含赖氨酸(k)和苏氨酸(t)的氨基酸序列，新等位变异的转录产物在此处额外增加了一对赖氨酸(k)和苏氨酸(t)，使其t-k富集度增加。当gw6a基因包含3个重复序列时，水稻粒形表现为细长粒，当gw6a基因包含2次重复序列时，水稻粒形表现为短粒。本发明通过pcr扩增水稻粒形主效qtl的indel分子标记gw6a-indel，根据扩增产物的长度判断水稻粒形性状。本发明针对上述变异，获得分子标记，能够大大提高水稻粒形基因gw6a的鉴定选育效率、加快育种进展。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述indel分子标记gw6a-indel的试剂，所述试剂包括引物对；所述引物对包括核苷酸序列如seqidno:2所述的正向引物(ggcctgtccggcgac)和核苷酸序列如seqidno:3所示的反向引物(gctcgacgcagagagaca)。本发明对所述引物对的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物对的来源即可。在本发明实施例中，所述引物优选对委托杭州有康生物科技有限公司合成。

本发明还提供了一种用于检测水稻粒形性状的试剂盒，包括上述技术方案所述试剂。在本发明中，所述试剂盒优选还包括dntps、taqdna聚合酶和含镁离子的10×taqbuffer。本发明对所述dntps、taqdna聚合酶和含镁离子的10×taqbuffer的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的dntps、taqdna聚合酶和含镁离子的10×taqbuffer等试剂的来源即可。在本发明实施例中，所述dntps、taqdna聚合酶和含镁离子的10×taqbuffer分别购自诺唯赞公司。

本发明还提供了上述技术方案所述indel分子标记gw6a-indel或上述技术方案所述试剂或上述技术方案所述试剂盒在检测水稻粒形中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述indel分子标记gw6a-indel或上述技术方案所述试剂或上述技术方案所述试剂盒在选育细长粒形的水稻品种中的应用。

本发明还提供了一种检测水稻粒形的方法，包括以下步骤：

1)提取待测水稻的dna；

2)以步骤1)提取的dna为模板，用上述技术方案所述试剂中的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；

本发明提取待测水稻的dna。在本发明中，所述水稻的dna优选为水稻的基因组dna。本发明对所述待测水稻的dna的提取方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取植物dna的方法即可，例如试剂盒法和ctab法。本发明提供的方法对待测水稻的品种不做具体限定，采用本领域所熟知的水稻品种即可，在本发明中，所述待测水稻的品种优选包括日本晴、9311、中恢9308、中恢8015、长粒粳、bg1、ir56、华占、中花11、02428、南京11、玉针香、ir24、ir26和ir64。

提取待测水稻dna后，本发明以提取的dna为模板，用所述引物进行pcr扩增，得到扩增产物。在本发明中，所述pcr扩增的反应体系优选如下：1μldna、0.5μl10mmol的正向引物、0.5μl10mmol的反向引物、1μl含20mmmg²⁺的10×taqbuffer、0.2μl10mmdntps、0.2μl2u/μltaqdna聚合酶和6.6μlddh2o。在本发明中，所述pcr扩增的反应程序优选为95℃预变性4min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共32个循环；最后72℃延伸10min。本发明对所述pcr扩增用仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的pcr仪即可。

得到扩增产物后，本发明对所述扩增产物进行分析，根据扩增产物的长度判断待测水稻的粒形情况：当所述扩增产物长度为130bp，则待测水稻的基因型为gw6a，粒型为短粒；如果所述扩增产物的长度为136bp，则所述待测水稻的基因型为gw6a-2，粒型表现为细长粒；如果扩增产物为杂合型，则待测水稻的基因型为gw6a/gw6a-2，粒形介于两者之间。在本发明中，对所述扩增产物分析的方法优选包括page凝胶电泳或测序。本发明对所述page凝胶电泳或测序的方法均没有特殊限制，采用本领域所熟知的page凝胶电泳或测序即可。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种水稻粒形主效qtl的indel分子标记gw6a-indel及其检测引物和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1、检测材料

对大粒籼稻品种bg1和xlj中的gw6a基因座进行二代测序，与参照品种日本晴的基因组序列进行比对，发现差异后，设计本发明所述分子标记，对日本晴、9311、中恢9308、中恢8015、长粒粳、bg1、ir56、华占、中花11、02428、南京11、玉针香、ir24、ir26和ir64等15个亲本进行标记鉴定。

2、试验方法(dna提取与pcr扩增)

单株取幼嫩叶片，用ctab法提取个体dna。

pcr反应：1μldna(100ng)，1μl引物(10mmol，0.5μl正向引物和0.5μl反向引物)，1μl10×taqbuffer(20mmmg²⁺)，0.2μldntps(10mm)，0.2μltaqdna聚合酶(2u/μl)和6.6μlddh2o。

pcr反应程序为：95℃预变性4min(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环)，最后72℃延伸10min。在pcr仪上进行pcr扩增，扩增产物在8％聚丙烯酰氨凝胶上进行电泳分离。

(二)测序结果

通过测序引物对日本晴、bg1和xlj中gw6a的基因组序列扩增并测序，发现在第一个外显子上存在一段cgtctt重复序列的插入/缺失差异，可通过设计indel分子标记并用于分子标记辅助选择。以分子标记gw6a-indel对15个常规亲本进行聚丙烯凝胶电泳实验进行鉴定，鉴定结果如图1所示。

表1分子标记信息

(四)结果与分析

以分子标记gw6a筛选了15个常规亲本，根据差异结果进行测序鉴定，发现条带为130bp的品种不存在cgtctt序列插入，为串联重复正常型；条带为136的品种存在cgtctt序列插入，为串联重复插入型。

表215个亲本的理性考察和gw6a位点的基因分型

注：tgw表示千粒重，gl/gw表示粒长/粒宽，gl表示粒长，gw表示粒宽。

根据上述15个亲本的粒型考察数据，发现基因分型为gw6a-2型的水稻品种的籽粒的长宽比普遍偏大，属于典型的细长粒(gl/gw≥3.0)(黄海祥,钱前.(2017).水稻粒形遗传与长粒型优质粳稻育种进展.中国水稻科学(06),665-672.doi:10.16819/j.1001-7216.2017.7115)。本发明所鉴定的gw6a-2的等位变异会导致粒长变长。

实施例2

利用gw6a-indel区分水稻品种中是否含有gw6a的新型等位变异gw6a-2的方法

具体步骤如下：

(1)dna的提取：取水稻幼嫩叶片，ctab法提取基因组dna；

(2)标准pcr扩增体系的建立：以gw6a-indel标记引物，以待测水稻单株全基因组dna为模板，进行pcr扩增；

(3)扩增dna片段检测分析：pcr产物经过8％的聚丙烯酰氨凝胶电泳检测，如果标记能扩增出130bp片段，则说明目标品种不存在cgtctt插入，其基因型为gw6a，如果标记能扩增出136bp片段则说明目标品种中存在cgtctt插入，其基因型为gw6a-2，如果能扩增出杂合带型，说明该单株基因型为gw6a/gw6a-2。

表3新开发的标记在24个品种的检测及粒型考察

注：tgw表示千粒重，gl表示粒长，gw表示粒宽，gl/gw表示粒长/粒宽，-表示与表头的基因型一致。

由上述实例可知，采用上述分子标记及方法，主要用于水稻粒形主效基因gw6a第一个外显子上是否存在cgtctt重复序列插入的鉴定。通过检测鉴定，可以确定目标品种中是否存在导致籽粒变细长的新型等位变异gw6a-2，提高了水稻粒形基因gw6a的多样性基因座，提高了选择效率、加快了育种进度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国水稻研究所

<120>一种水稻粒形主效qtl的indel分子标记gw6a-indel及其检测引物和应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>119

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(38)..(38)

<223>n=cgtcttcgtcttorcgtcttcgtcttcgtctt

<400>1

gctcgacgcagagagacatgcccgccttcttcttcttnggtcttcttcttctccttggcg60

gcggcgccgtcgccgtcgtcggcgtggtcgtgaaccgccgccatgtcgccggacaggcc119

<210>2

<211>15

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggcctgtccggcgac15

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gctcgacgcagagagaca18

<210>4

<211>1566

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ttagaactcgcgggggtcgacgaagaggtggcgtcccggcggcggcggcggcgccgccca60

gtcgtcggcgtcgtgttcgtccgggttgaggttcttgatgcaccagacgtcctcgtcgca120

gcagaagcggcgccaccgcgggacggcggcggcggccgggtcgtcgggggagatgtcggc180

ggcgacgacggcgcacgccgggttcttgcgggcgacgttgtgggcgtggtggcagagcga240

ccggagcagctccgggccgtccgggccggacatgcggaggccgtagaggaggtaggctcc300

gaaggggcggaagatgtccgggatggaggggaggtgcagccacggcgcaccgcggtcgag360

cgcccggagcgcggcgagcgacgcgcggagcagcgccggggcgccgctcacgcggaggct420

gagcgagcgtgtggagtcccagacgctgggcacggcgaacgacgcgccgtcagcggcgac480

ggcgacgaaggtgccgagggtgagcttgtgtgcgagcagcgcgggcatgtcggcggggag540

gaactcggcgtcctgcggcgggagcagccgcgcgtacgccgccgcggcgacctcgggggg600

cagctggaacacgcggtgccccctcgccaccggcagccggtgcgcgtgcaccgggtggcc660

gatgaactccggccgcctgaacggcgcgtacccgaacctccccgtgaacagcgccagcga720

cgccgcgttcgactccgtcgtcgccatcgtcgcgtgctccgctcccctcgccacgcacca780

ctcctccgcccgcctcaccagcgccgtcccgatccccagccgcctacaaacacaaacaca840

aatcacaccatcagccttgcattggccgccattgctggaagaagcaagagcaatgttggt900

gtgcaccatgaatgatcaaaggaatcacctgtgagatggcgacaccctgaggccgaggag960

gttggcgaccttcacgaatggcttctcctgcttccctccacggctcaccgtcttcacgca1020

cgccttgatcacacccaccaccttcttcttctcctcctcctcgccgtactccgccacctg1080

taacacacacaaatccaatcaaccaccatgttaattaaccattcgtgttcgtacatctcg1140

tctgatcggcttaattagagacatgatcatcaaccacacgatcatttcatggatgtttat1200

atgtaatgcatgtttgtgaatctgatcagaatcgattagattagattagattagttagat1260

cgatgatattaccagcatgacgtgttccggggcgtggcggactctggcgagcgggtcgcc1320

gatctgctcgacgcagagagacatgcccgccttcttcttcttcgtcttcgtcttcgtctt1380

ggtcttcttcttctccttggcggcggcgccgtcgccgtcgtcggcgtggtcgtgaaccgc1440

cgccatgtcgccggacaggccgacctggcaccgccgctccagctcctccaccgccggcaa1500

gtccttctccacgtcgaactccctcaccctcaccaacaccttcatcatcgtcgtcgtctc1560

caccat1566

<210>5

<211>1566

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5