一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株、构建方法及其应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株、构建方法及其应用。


背景技术：

2.非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swinefever virus，asfv)感染导致的家猪和野猪的烈性传染病，可致感染猪100％ 发病和死亡。然而，目前世界上没有可用于非洲猪瘟防控的疫苗和药物，只 能通过严格的生物安全措施进行防控。这种防控措施成本高，效果有限，疫 苗是防控传染病最为经济和有效的手段。目前，世界上在研非洲猪瘟疫苗主 要有灭活疫苗、亚单位疫苗、dna疫苗、弱毒活疫苗等。
3.灭活疫苗：早期疫苗研究主要集中在灭活疫苗。灭活疫苗安全、但细胞免疫应答弱，且很难诱导机体产生有效的中和抗体，对asfv强毒攻击无有效的保护作用，并可能存在抗体介导的感染增强。
4.亚单位疫苗：cd2v、p72、p54和p30蛋白均可诱导中和抗体，可作为亚单位疫苗开发的候选抗原。研究人员利用杆状病毒载体表达相关蛋白来免疫猪群，对保护猪群免受强毒攻击有一定效果。但目前亚单位疫苗中所使用的 asfv保护性抗原不足以提供完整保护。少数asfv蛋白作为抗原，即使出现中和抗体，也很难提供有效的免疫保护。
5.dna疫苗：目前报导的dna疫苗可以在宿主中诱导高水平的特异性t 细胞反应，产生体液免疫和细胞免疫，但仍无法提供有效保护。通过dna 疫苗实现提供有效免疫保护的目标仍有很长的路要走。
6.弱毒活疫苗：(1)自然弱毒株疫苗或常规技术致弱弱毒疫苗：从自然届 筛选天然弱毒株作为疫苗候选株或通过细胞连续传代得到的asfv弱毒株能 诱导针对亲本毒株的保护性免疫反应。此类疫苗可能存在交叉保护，但自然 弱毒株易出现毒力返强，同时存在严重副作用；(2)基因工程致弱弱毒疫苗： 采用基因工程技术，人工进行基因缺失以获得减毒疫苗株。我国报道了一株 由哈尔滨兽医研究所构建的基因缺失病毒株(hlj/18
‑
7gd)，初步试验证明 该七基因缺失疫苗具有较好的安全性和有效性。但是，所为弱毒是相对于机 体免疫力正常的动物而言，如果动物有免疫抑制病或其它基础病等所致的免 疫力低下，则弱毒疫苗对它们而言可能就是致病、甚至致死的强毒；另，不 同弱毒疫苗株存在重组而产生新的致病毒株的风险；再，所有弱毒苗均存在 返强的可能。
7.病毒活载体疫苗：大量研究表明，病毒载体疫苗可以诱导猪体内产生强烈的体液体液反应和细胞免疫，为抵抗asfv感染提供部分有效保护。但是，病毒载体疫苗所诱导的免疫反应以及保护效力仍需进一步评估。
8.目前国内外针对非洲猪瘟疫苗研究主要是利用基因删除技术进行减毒活疫苗的研究，这种策略研制减毒活疫苗至少存在两大制约瓶颈：一是疫苗的安全性难以保证；二是没有可用于商业化生产减毒活疫苗的细胞系。用同为大型dna病毒的猪伪狂犬病毒(prv)
(已有成熟疫苗)做骨架，生产嵌合载体疫苗可以解决上述两个制约因素，同时，还能成为多联、多价疫苗，一种疫苗防两个甚至三个病。
9.asfv是大型双股dna病毒，基因组大小为170
‑
193kbp,含160
‑
175个开放阅读框，可以编码150
‑
200种蛋白质。目前已知病毒蛋白p72(b646l)、p54(e183l)和p30(cp204l)可作为中和抗体的靶点，cd2v(ep402r)的表达也可诱导部分保护作用。因此，可将上述基因插入prv载体，创制新型重组prv非洲猪瘟病毒疫苗。
10.伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus，prv)属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，水痘病毒属。该病毒可引起猪伪狂犬病(porcinepseudorabies)，感染新生仔猪主要表现为神经症状,也可出现腹泻等消化系统症状；妊娠母猪感染后可引起流产,产死胎、木乃伊胎及呼吸系统症状。prv基因组>143kbp，可容纳较长的外源基因，是比较理想的嵌合苗构建载体。因此，通过对病毒非必须基因的删除，降低病毒毒力。在此基础上插入外源靶向基因，构建出表达非洲猪瘟基因的重组伪狂犬病毒嵌合载体疫苗是一种理想的途径。
11.crispr/cas9系统是最新的基因编辑工具，获得2020年度诺贝尔化学奖。crispr/cas9系统基本工作原理是利用sgrna引导cas9蛋白结合靶基因位点，在特定基因位点产生dna双链断裂，再通过提供同源序列进行同源重组修复可以在靶基因位点处插入特定序列，从而实现基因编辑的目的。crispr/cas9作为一种高效基因编辑工具，crispr/cas9系统已广泛应用于生物医药领域。
12.目前利用crispr/cas9构建表达非洲猪瘟蛋白的prv多基因缺失毒株，主要有以下报道：feng等以ge/gi双基因缺失的伪狂犬病病毒株为骨架，在tk基因处通过单sgrna切割后，将cd2v的表达盒插入。重组片段插入tk基因n端第108和109个碱基之间。其中n端同源臂492bp，c端同源臂466bp。egfp由cmv启动子驱动，flag
‑
cd2v
‑
flag由ef1α启动子驱动，同时带有绿色荧光和flag标签，但未去除筛选标记，参考说明书附图5。
13.黄剑同样在ge/gi双基因缺失的prv毒株上基础上进行了重组病毒的构建，使用双sgrna策略介导的同源重组，将含cmv启动子的asfv的p72、p54、p30、cd2v、pep153r表达盒分别插入到prv基因组中，并替换了prv的tk基因，筛选纯化得到重组病毒rprv
‑
p72、rprv
‑
p54、rprv
‑
p30、rprv
‑
cd2v和rprv
‑
pep153r，此方案未使用筛选标记。
14.德国学者的技术路线为：筛选出表达cas9蛋白的细胞系，将bartha株基因组缺失gg基因插入bac载体构建感染性克隆质粒pprv
‑
baδgg，进一步在此基础上缺失gd基因的启动子和起始序列，构建pprv
‑
baδggd，缺失gd基因的病毒生长受限制，可方便重组病毒的筛选，通过同源修复载体puc
‑
bakjcagplnew去除bac质粒序列的同时，替换上asfv蛋白的表达盒与gd基因缺失部分，可获得正常复制的重组病毒。过程十分繁琐(参考说明书附图6)，但利用了cag启动子，增强了蛋白表达能力。因此，现有技术存在下列问题：
15.(1)现有技术均未在prv野毒变异株基础上进行基因编辑，而是先通过构建bac质粒和双基因缺失毒株后，再进行重组病毒的构建，过程复杂。
16.(2)现有技术部分带有筛选标记，且并没有去除筛选标记，对临床应用有影响。
17.(3)现有技术在prv基因组上仅插入了单个asfv基因。
18.上述参考文献：
19.[1]fengz,chenj,liangw,etal.therecombinantpseudorabiesvirusexpressingafricanswinefeverviruscd2vproteinissafeandeffectivein
mice[j].virolj,2020,17(1):180.
[0020]
[2]黄剑.表达非洲猪瘟病毒结构蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及生物学特性分析[d].福建农林大学,2020.
[0021]
[3]a,keilgm,kabuukat,etal.efficienttransgeneinsertioninapseudorabiesvirusvectorbycrispr/cas9andmarkerrescue
‑
enforcedrecombination[j].journalofvirologicalmethods,2018,262:38
‑
47.


技术实现要素：

[0022]
本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株、构建方法及其应用。
[0023]
本发明的技术解决方案如下：
[0024]
本发明的一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组病毒毒株提交专利认可的机构进行保藏，其保藏编号为：cctccno：v202139；分类命名为：猪疱疹病毒1型prvtk
‑
/gi
‑
/ge
‑
‑
p54
+
/p30
+
。保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏时间是2021年05月10日。保藏单位地址：中国武汉，武汉大学。
[0025]
其保藏编号为：cctccno：v202128；分类命名为：猪疱疹病毒1型prvtk
‑
/gi
‑
/ge
‑
‑
cd2v
+
/p72
+
。保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏时间是2021年05月10日。保藏单位地址：中国武汉，武汉大学。
[0026]
一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组病毒毒株，在伪狂犬病毒tk，gi/ge基因处分别定点插入cd2v和p72，且tk，gi/ge基因全部缺失。
[0027]
一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组病毒毒株，在伪狂犬病毒tk，gi/ge基因处分别定点插入p54和p30，且tk，gi/ge基因全部缺失。
[0028]
本发明还公开了一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组病毒毒株的构建方法，采用crispr/cas9编辑prv病毒株基因组，将prv的tk、gi/ge基因删除，再利用同源重组修复，在tk和gi/ge基因的位置分别定点插入asfv的cd2v和p72，或，p54和p30,且tk、gi/ge基因全部缺失。
[0029]
优选地，包括以下步骤：
[0030]
s1.获取野外流行的变异株prv基因组全长序列；
[0031]
s2.根据所述变异株prvtk、gi/ge基因测序序列设计引导cas9蛋白特异性切割目的基因的sgrna，分别为sgrna
‑
tk,sgrna
‑
gi/ge；在其上设计合成正反向sgrna单链序列，并将其退火后的双链sgrna连接至px459质粒上，转化和提取表达sgrna序列和cas9蛋白的px459
‑
tk、px459
‑
gi/ge质粒载体；
[0032]
s3.体外分别扩增tk基因、gi/ge基因左右同源臂tkhml、tkhmr、gi/gehml、gi/gehmr，通过酶切连接，构建同源臂质粒puc19
‑
tkhm、puc19
‑
gi/gehm；在各个左右同源臂之间插入cag
‑
bghpa元件，构建出中间质粒puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
bghpa和puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
bghpa；
[0033]
s4.化学合成asfv的cd2v、p30、p54、p72基因序列；
[0034]
s5.利用酶切连接或无缝克隆的方法，进一步构建同源修复供体质粒puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
cd2v
‑
bghpa、puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
p54
‑
bghpa、puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
p72
‑
bghpa和
puc19
‑
gi/gehm
‑
cagp30
‑
bghpa；使用scaⅰ或ecorⅰ限制性内切酶，对上述四种同源修复供体质粒进行线性化；
[0035]
将prv基因组dna，s2中制备的px459
‑
tk、px459
‑
gi/ge，s5中线性化的puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
cd2v
‑
bghpa、puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
p72
‑
bghpa同时共转染至pk15细胞中，获得表达cd2v和p72蛋白的重组伪狂犬病毒prvtk
‑
/gi
‑
/ge
‑
‑
cd2v
+
/p72
+
；
[0036]
或；将prv基因组dna，s2中制备的px459
‑
tk、px459
‑
gi/ge，s5中线性化的puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
p54
‑
bghpa、puc19
‑
gigehm
‑
cag
‑
p30
‑
bghpa同时共转染至pk15细胞中，获得表达p54和p30蛋白的重组伪狂犬病毒prvtk
‑
/gi
‑
/ge
‑
‑
p54
+
/p30
+
。
[0037]
优选地，所述sgrna
‑
tk,sgrna
‑
gi/ge的核苷酸序列见seqidno.1和no.2；
[0038]
所述tkhml的核苷酸序列见seqidno.3；
[0039]
所述tkhmr的核苷酸序列见seqidno.4；
[0040]
所述gi/gehml的核苷酸序列见seqidno.5；
[0041]
所述gi/gehmr的核苷酸序列见seqidno.6；
[0042]
所述cag
‑
bghpa的核苷酸序列见seqidno.7；
[0043]
所述cd2v的核苷酸序列见seqidno.8；
[0044]
所述p30的核苷酸序列见seqidno.9；
[0045]
所述p54的核苷酸序列见seqidno.10；
[0046]
所述p72的核苷酸序列见seqidno.11。
[0047]
本发明还公开了一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组病毒毒株，在制备治疗或预防预防prv和asfv感染的药物或疫苗中的应用。
[0048]
本发明至少具有以下有益效果之一：本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组病毒毒株的构建方法。该法相较于传统的单基因编辑以及引入荧光筛选标记再去除筛选标记的方法，本发明借助crispr/cas9高编辑效率，一步敲除prv三个毒力基因，并分别插入两个asfv蛋白的表达盒，构建两株表达asfv蛋白的重组prv毒株。此过程不引入荧光标记基因，也无需筛选构建成功后，删除荧光标记基因。该法新颖、高效、快速、精准，大大减少了操作流程和时间。本发明为预防asfv和prv的感染提供了一种疫苗候选毒株以及新型疫苗研发的方法及思路。
[0049]
同时和背景技术中的文献有以下优点：
[0050]
(1)现有技术均未在prv野毒变异株基础上进行基因编辑，而是先通过构建bac质粒和双基因缺失毒株后，再进行重组病毒的构建，过程复杂。本发明直接对prv野毒变异分离株进行操作。
[0051]
(2)现有技术为了方便筛选重组病毒，会加入筛选标记，加入筛选标记后，就需要把它去除。而在缺乏针对外源蛋白的抗体时，会加蛋白标签，以方便构建后验证病毒是否表达插入的外源基因，但是标签的加入属于一个多余的序列，在临床应用上还是需要评估风险的，具有一定的安全风险。本发明利用crispr/cas9系统的高效率编辑，直接将表达asfv的蛋白，未引入任何标签和筛选标记，避免了去标记的步骤。
[0052]
(3)现有技术在prv基因组上仅插入了单个asfv基因，在一次转染中，同时进行两处位点的编辑和插入，效率如何，是否能够同时完成，都有待评估。本发明的构建方法能够直接在缺失三基因的同时，插入asfv的两个基因，快速获得表达两个asfv蛋白的prv三基因
缺失毒株。
附图说明
[0053]
图1(a)，(b)分别为本发明的同源臂质粒puc19
‑
tkhm、puc19
‑
gi/gehm；
[0054]
图2(a)，(b)分别为本发明的中间质粒puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
bghpa、 puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
bghpa；
[0055]
图3(a)，(b)分别为本发明的同源修复供体质粒puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
cd2v
‑
bghpa、puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
p72
‑
bghpa；
[0056]
图4(a)，(b)分别为本发明的同源修复供体质粒 puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
p54
‑
bghpa、puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
p30
‑
bghpa；
[0057]
图5是背景技术中feng等的构建策略图；
[0058]
图6是背景技术中德国学者的技术路线图。
具体实施方式
[0059]
为了进一步具体阐述本发明，下面将对本发明实施例中的技术方案进行具体清晰描述，以下所描述的实施例仅仅是本发明内的一部分实施例，本发明内容不仅仅局限于以下实验例。所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实验方法若无特殊说明，均为常规方法。需要说明的是gi/ge表示为相邻位置的gi和ge的两处基因，在编辑时该两个基因作为一个整体被缺失。
[0060]
本发明提供了一种表达asfv的cd2v(或p54)和p72(或p30)蛋白的tk/gi/ge三基因缺失prv载体、重组prv毒株及其构建方法，具体包括以下步骤：可结合图1
‑
4。
[0061]
1、利用常规病毒学和分子生物学技术分离、鉴定一野外流行变异株 prv毒株。具体地，采集有典型prv临床症状和病理变化的病猪的病变器官，提取总dna，进行pcr鉴定。阳性病料匀浆过滤后，接种pk15细胞，盲传三代，出现特征性病变后，进行三轮噬斑纯化，获得prv毒株。
[0062]
2、利用蔗糖密度梯度离心对分离生产的prv进行超离纯化，通过酚氯仿法提取prv基因组dna，利用nanopore测序技术获得prv基因组全长序列。
[0063]
3、靶向伪狂犬病毒gi/ge基因和tk基因的sgrna的设计及质粒构建
[0064]
(1)根据测序获得的tk基因和gi/ge基因序列，用在线sgrna设计软件(https://zlab.bio/guide
‑
design
‑
resources)设计sgrna序列，分别命名为 sgrna
‑
tk和sgrna
‑
gi/ge。在此基础上设计合成正反向sgrna单链序列(表 1)，使用t4 pnk对其进行磷酸化修饰后，退火形成双链dna。具体反应条件为：37℃反应30min进行磷酸化；95℃反应5min以灭活酶及充分变性核酸单链；每分钟降低5℃，缓慢退火直至25℃，形成有粘性末端的sgrna双链， 4℃暂时保存。
[0065]
表1
[0066][0067]
(2)sgrna退火产物稀释200倍后，使用t4 dna连接酶与经bbsⅰ限制性内切酶线性化的px459载体进行连接反应，反应条件为：25℃，30min。将连接产物转化至top10感受态细胞中，涂布含氨苄青霉素的lb平板，并挑取单克隆菌落，进行测序验证。鉴定成功的阳性克隆扩大培养，使用无内毒质粒提取试剂盒抽提质粒，制备sgrna与cas9蛋白共质粒的载体px459
‑
tk 和px459
‑
gi/ge。
[0068]
4、同源修复供体质粒的构建
[0069]
(1)构建中间质粒puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
bghpa、 puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
bghpa
[0070]
根据tk、gi/ge基因序列及其上下游序列，设计引物(见表2)扩增上下游的同源臂序列。具体过程如下，以prv基因组dna为模板，利用neb q5 hot
‑
start超保真dna聚合酶和tkhml
‑
f/r、tkhmr
‑
f/r、gi/gehml
‑
f/r、 gi/gehmr
‑
f/r四对引物进行pcr扩增(参照neb官方说明书)。电泳后进行胶回收纯化，获得的tk基因左右同源臂片段命名为tkhml和tkhmr，获得的gi/ge基因左右同源臂片段命名为gi/gehml和gi/gehmr。对puc19 载体及各同源臂片段进行双酶切反应。使用t4 dna连接酶将puc19、 tkhml、tkhmr进行三片段的连接反应，获得同源臂质粒puc19
‑
tkhm。使用t4 dna连接酶将puc19、gi/gehml、gi/gehmr进行三片段的连接反应，获得同源臂质粒puc19
‑
gi/gehm。从实验室保存的真核表达质粒上利用双酶切反应切下cag
‑
bghpa元件，连接至同源臂质粒puc19
‑
tkhm、 puc19
‑
gi/gehm，构建中间质粒puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
bghpa、 puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
bghpa。
[0071]
(2)puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
cd2v
‑
bghpa、puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
p54
‑
bghpa、 puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
p72
‑
bghpa、puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
p30
‑
bghpa的构建
[0072]
合成asfv cd2v、p72和p54和p30基因序列，利用酶切连接或无缝克隆技术将cd2v和p72序列、p54和p30序列分别插入 puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
bghpa、puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
bghpa，得到四种同源修复供体质粒puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
cd2v
‑
bghpa、 puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
p54
‑
bghpa和puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
p72
‑
bghpa、puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
p30
‑
bghpa，并提取无内毒质粒。
[0073]
表2
[0074]
[0075][0076]
4.猪疱疹病毒1型prv tk
‑
/gi
‑
/ge
‑
‑
cd2v
+
/p72
+
的构建
[0077]
(1)线性化同源修复供体质粒：使用scaⅰ限制性内切酶线性化 puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
cd2v
‑
bghpa和puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
p72
‑
bghpa。
[0078]
(2)转染：总量为5μg的混合dna，含prv基因组dna、线性化的 puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
cd2v
‑
bghpa、线性化的 puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
p72
‑
bghpa、px459
‑
tk、px459
‑
gi/ge按质量比1：1： 1：1：1，使用lipofectamine
tm
3000 reagent共转染至pk15细胞中，培养48 小时后，观察病变。
[0079]
(3)空斑纯化：收获病变细胞，进行多轮空斑纯化，每一轮利用pcr 方法对cd2v、p72、tk、gi/ge基因进行检测；直至cd2v及p72基因能稳定检测，而tk、gi/ge基因无法检出。
[0080]
5.猪疱疹病毒1型prv tk
‑
/gi
‑
/ge
‑
‑
p54
+
/p30
+
的构建
[0081]
(1)线性化同源修复供体质粒：使用ecorⅰ限制性内切酶线性化 puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
p54
‑
bghpa、puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
p30
‑
bghpa。
[0082]
(2)转染：总量为5μg的混合dna，含prv基因组dna、线性化的 puc19
‑
tkhm
‑
cag
‑
p54
‑
bghpa、线性化的puc19
‑
gi/gehm
‑
cag
‑
p30
‑
bghpa、 px459
‑
tk、px459
‑
gi/ge按质量比1：1：1：1：1，使用lipofectamine
tm
3000reagent共转染至pk15细胞中，培养48小时后，观察病变。
[0083]
(3)空斑纯化：收获病变细胞，进行多轮空斑纯化，每一轮利用pcr 方法对p54、p30、tk、gi/ge基因进行检测，直至p54及p30基因能稳定检测，而tk、gi/ge基因无法检出。
[0084]
本实施例将prv三个非必需毒力基因tk、gi和ge基因删除，降低其毒性，再利用同源重组修复，在tk和gi/ge基因的位置分别定点插入具有可诱导中和抗体的asfv cd2v和p72，或，p54和p30的蛋白表达盒，为预防prv 和asfv的感染提供了一种疫苗候选毒株，所建立的方法为新型疫苗的研发提供了新的方法及思路。
[0085]
以上所选取并具体描述的实施例仅用于帮助详尽阐述本发明，不是全部实施例，并未详尽叙述本发明的所有的细节。在本说明书内容的基础上，可以进一步做一些修改和变化。但在非创造性前提下所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。