诱导细胞毒性的治疗剂的制作方法

诱导细胞毒性的治疗剂
1.本技术是国际申请号pct/jp2015/077024，国际申请日2015年9月25日，中国申请号no.201580059938.3，发明名称为“诱导细胞毒性的治疗剂”的专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及多特异性抗原结合分子、其用途等等。


背景技术：

3.抗体由于其在血浆中的高稳定性和极少的不利反应而作为药物引人注目(非专利文献1和2)。已知抗体不仅引起抗原结合作用，激动作用，和拮抗作用，而且还引起效应子介导的细胞毒性活性(也被称为效应子功能)如抗体依赖性细胞细胞毒性(adcc)，抗体依赖性细胞噬菌作用(adcp)，和补体依赖性细胞毒性(cdc)，并且显示针对癌细胞的抗肿瘤作用(非专利文献3)。adcc是效应子细胞对抗体结合的靶癌细胞展现的细胞毒性，其经由抗体fc区与效应子细胞如nk细胞和巨噬细胞上存在的fc受体的结合。补体复合物结合抗体结构中存在的补体结合位点。cdc是由细胞破裂导致的细胞损伤，其中通过复合物中存在的补体组分在抗体结合细胞的细胞膜上形成孔从而促进水和离子流入细胞中。已经开发了若干显示优异抗肿瘤效果的治疗性抗体作为用于癌症治疗的药物(非专利文献4)；并且虽然现有的治疗性抗体已经显示优异的作用，但施用这些抗体所实现的治疗结果仍然不令人满意。
4.为了使抗体表达adcc、adcp和cdc，有必要的是抗体fc区，存在于效应子细胞如nk细胞和巨噬细胞上的抗体受体(fcγr)和各种补体组分结合。在人中，同种型fcγria、fcγriia、fcγriib、fcγriiia和fcγriiib作为fcγr蛋白家族的成员已被报道，并且也已经报道了各自的同种异型(非专利文献5)。在这些同种型中，fcγria、fcγriia和fcγriiia带有在胞内结构域中的被称为免疫受体基于酪氨酸的激活基序(itam)的结构域，并且发送激活信号。另一方面，仅fcγriib带有在胞内结构域中的被称为免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(itim)的结构域，并且发送抑制信号。已知每一种fcγr都经由通过免疫复合物等的交联来发送信号(非专利文献6)。当抗体实际上对癌细胞发挥效应子功能时，效应子细胞膜上的fcγr在癌细胞膜上结合的若干抗体的fc区处形成簇，并且效应子细胞发出激活信号。杀细胞作用因此被发挥，但是因为此时fcγr仅在癌细胞附近存在的效应子细胞中交联，所以显示免疫激活局部地发生在癌细胞中(非专利文献7)。
5.天然存在的免疫球蛋白在其可变区处结合抗原，并且在其恒定区处结合受体如fcγr、fcrn、fcαr和fcεr以及补体。fcrn是在igg fc区处相互作用的结合分子之一，并且因为抗体重链中的每个结合一个fcrn分子，据报道两个fcrn分子结合一个igg型抗体分子。然而，与fcrn等不同，fcγr在抗体铰链区和ch2结构域处相互作用，并且仅一个fcγr分子结合一个igg型抗体分子(非专利文献8)。此外，普通的天然存在的igg型抗体经由其可变区(fab)识别并结合单个表位；因此，其仅可以结合一个抗原。另一方面，已知多种蛋白质参与癌症和炎症，并且在这些蛋白质之间可能存在干扰。例如，已知若干炎症细胞因子(tnf、il1和il6)参与免疫学疾病(非专利文献9)。此外，已知在获得药物抗性方面，其他受体的激活
是癌症机制之一(非专利文献10)。在这样的情况中，识别单个表位的普通抗体将不能够抑制多种蛋白质。
6.利用一个分子结合两种以上抗原的抗体(双特异性抗体)作为抑制多个靶标的分子正在被研究。可能的是通过修饰天然存在的igg型抗体给予对两种不同抗原(第一抗原和第二抗原)的结合活性(非专利文献11)。因此，不仅存在单个分子中和两种以上的抗原，而且还存在由于具有细胞毒性活性的细胞与癌细胞之间的交联所致的抗肿瘤活性的增强。作为双特异性抗体的分子形式，目前已报道了包含添加到抗体的n或c末端的抗原结合位点的分子(dvd
‑
ig和scfv
‑
igg)，具有针对两种抗体fab区的不同序列的分子(共有l
‑
链双特异性抗体和杂交的杂交瘤)，一个fab区识别两种抗原的分子(二合一igg)，以及具有ch3区环位点作为新的抗原结合位点的分子(fcab)(非专利文献12和13)。因为所有双特异性抗体都在其fc区处与fcγr相互作用，所以抗体效应子功能得以保存。因此，双特异性抗体结合其识别的任何抗原并且同时结合fcγr，并且显示针对表达所述抗原的细胞的adcc活性。
7.如果双特异性抗体识别的所有抗原都是癌症中特异性表达的抗原，则所述双特异性抗体在其与任何所述抗原结合时显示对癌细胞的细胞毒性活性。因此，与识别一种抗原的常规抗体药物相比，由此种抗体可以预期更有效的抗肿瘤效果。然而，在双特异性抗体所识别的抗原中的任一种表达在正常组织或细胞中表达在免疫细胞上的情况中，由于与fcγr的交联而发生对正常组织的破坏或细胞因子的释放(非专利文献14)。结果，引起强烈的不利反应。
8.利用细胞毒性动员t细胞作为效应子细胞作为其抗肿瘤作用的机制的t细胞重新引导抗体作为双特异性抗体自1980年代起已为人所知(非专利文献15、16和17)。与利用adcc动员nk细胞或巨噬细胞作为效应子细胞作为其抗肿瘤作用的机制的抗体不同，t细胞重新引导抗体是针对构成t细胞上的t细胞受体(tcr)复合物的任一种亚基的抗体，并且具体是包含结合cd3ε链的抗体和结合靶癌细胞上的抗原的抗体的双特异性抗体。经由t细胞重新引导抗体同时结合cd3ε链和癌症抗原，t细胞接近癌细胞。结果，认为通过t细胞具有的细胞毒性活性发挥针对癌细胞的抗肿瘤作用。
9.已知作为t细胞重新引导抗体的卡妥索单抗(catumaxomab)在两个fab处各自结合癌症抗原(epcam)和t细胞上表达的cd3ε(cd3ε)链。卡妥索单抗通过同时结合癌症抗原和cd3ε引起t细胞介导的细胞毒性活性，并且通过同时结合癌症抗原和fcγr诱导由抗原递呈细胞如nk细胞和巨噬细胞介导的细胞毒性活性。通过利用这两种细胞毒性活性，卡妥索单抗通过腹膜内给药而显示对恶性腹水的高的疗效并且因此在欧洲已经被批准(非专利文献18)。此外，存在这样的例子，其中据报道施用卡妥索单抗产生癌细胞反应性抗体，这清楚地证明引起获得性免疫(非专利文献19)。由此结果，具有t细胞介导的细胞毒性活性和通过细胞如nk细胞或巨噬细胞的fcγr介导的作用的抗体(这些抗体被特别地称为三功能抗体)受到关注，因为可以预期强的抗肿瘤作用和引起获得性免疫。
10.然而，即使不存在癌症抗原，三功能抗体也同时结合cd3ε和fcγr并且因此即使在不存在癌细胞的环境中也会使表达cd3ε的t细胞与表达fcγr的细胞交联，这导致产生大量的多种细胞因子。此种不依赖于癌症抗原的多种细胞因子产生的引发限制了目前将三功能抗体施用于腹膜内途径(非专利文献20)。由于严重的细胞因子暴风雨样不利反应，三功能抗体的全身施用是非常困难的。实际上，在将卡妥索单抗全身性施用于非小细胞肺癌患者
的i期临床试验中，非常低的5μg/全身的剂量是可允许的最大剂量，并且据报道施用更大的剂量导致多种严重的不利反应(非专利文献21)。
11.同样，通过常规技术的双特异性抗体在其与fcγr结合时可以同时结合两种抗原，作为癌症抗原(epcam)的第一抗原和作为cd3ε的第二抗原；并因此，考虑到其分子结构，不可能避免由同时结合fcγr和第二抗原cd3ε引起的不利反应。
12.同时，不同于卡妥索单抗，bite由于不具有fcγ受体
‑
结合部位，因此不会癌抗原非依赖性地使表达于t细胞和诸如nk细胞和巨噬细胞等细胞上的受体发生交联。因此，显示出bite不会引起在给予了卡妥索单抗的情况下可观察到的癌抗原非依赖性的细胞因子的诱导。然而，由于bite为欠缺fc区的低分子量型的修饰抗体分子，因此与通常用作治疗用抗体的igg型抗体相比较，存在给予患者后的血中半衰期明显短的问题。实际上，已经显示：活体内给予的bite的血中半衰期为数小时左右(非专利文献22和23)。在blinatumomab的临床试验中，通过使用微泵(minipump)的持续静脉内输注来进行给药。这样的给药对于患者来说不仅为便利性明显差的给药法，也有装置故障等引起的医疗事故的潜在风险。因此，不能说这样的给药方法是理想的。
13.近几年，使用具有减小的fcγr结合活性的fc区已经能够保持bite所具有的强抗肿瘤活性和不以癌症抗原依赖性方式引起细胞因子风暴的优异安全性质，并且提供了在血液中具有长半衰期的新的多肽装配(专利文献1)。
14.另一方面，当通过常规技术表达双特异性抗体时，因为表达两种h链和两种l链，所以可预期十种组合。其中，产生的组合中仅一种具有想要的结合特异性。因此，为了获得想要的双特异性抗体，必须自十种抗体中纯化想要的一种抗体，这是非常低效且困难的。
15.通过将氨基酸置换引入igg h
‑
链ch3区中而优先分泌具有h链的异源二聚组合(例如，针对抗原a的h链和针对抗原b的h链的组合)的igg的方法已经作为用于解决该问题的方法被报道(专利文献2、3、4、5、6、7以及非专利文献24和25)。利用物理干扰即“突出(knob)”和“孔(hole)”的方法以及利用电荷排斥的方法已经作为此种方法被报道。
16.为了以更佳的效率获得目标分子，已经报道了使用能够结合两种不同抗原的l链(虽然所述l链具有相同的氨基酸序列)的方法(专利文献8和9)。然而，抗原亲和力可能随着共有l链的使用而极大下降，并且难以找到保持抗原亲和力的共有l链。
17.引用列表
18.[专利文献]
[0019]
[专利文献1]wo2012/073985
[0020]
[专利文献2]wo96/27011
[0021]
[专利文献3]wo2006/106905
[0022]
[专利文献4]wo2007/147901
[0023]
[专利文献5]wo2009/089004
[0024]
[专利文献6]wo2010/129304
[0025]
[专利文献7]wo2013/065708
[0026]
[专利文献8]wo98/050431
[0027]
[专利文献9]wo2006/109592
[0028]
[非专利文献]
[0029]
[非专利文献1]nat.biotechnol.(2005)23,1073
‑
1078
[0030]
[非专利文献2]eur j pharm biopharm.(2005)59(3),389
‑
396
[0031]
[非专利文献3]drug des devel ther(2009)3,7
‑
16
[0032]
[非专利文献4]clin cancer res.(2010)16(1),11
‑
20
[0033]
[非专利文献5]immunol.lett.(2002)82,57
‑
65
[0034]
[非专利文献6]nat.rev.immunol.(2008)8,34
‑
47
[0035]
[非专利文献7]ann.rev.immunol.(1988).6.251
‑
81
[0036]
[非专利文献8]j.bio.chem.,(20001)276,16469
‑
16477
[0037]
[非专利文献9]nat.biotech.,(2011)28,502
‑
10
[0038]
[非专利文献10]endocr relat cancer(2006)13,45
‑
51
[0039]
[非专利文献11]mabs.(2012)mar 1,4(2)
[0040]
[非专利文献12]nat.rev.(2010)10,301
‑
316
[0041]
[非专利文献13]peds(2010),23(4),289
‑
297
[0042]
[非专利文献14]j.immunol.(1999)aug 1,163(3),1246
‑
52
[0043]
[非专利文献15]nature(1985)314(6012),628
‑
31
[0044]
[非专利文献16]int j cancer(1988)41(4),609
‑
15.
[0045]
[非专利文献17]proc natl acad sci usa(1986)83(5),1453
‑7[0046]
[非专利文献18]cancer treat rev.(2010)oct 36(6),458
‑
67
[0047]
[非专利文献19]future oncol.(2012)jan 8(1),73
‑
85
[0048]
[非专利文献20]cancer immunol immunother.(2007)56(9),1397
‑
406
[0049]
[非专利文献21]cancer immunol immunother.(2007)56(10),1637
‑
44
[0050]
[非专利文献22]cancer immunol immunother.(2006)55(5),503
‑
14
[0051]
[非专利文献23]cancer immunol immunother.(2009)58(1),95
‑
109
[0052]
[非专利文献24]protein engineering.(1996)vol.9,p.617
‑
621
[0053]
[非专利文献25]nature biotechnology.(1998)vol.16,p.677
‑
681
[0054]
发明概述
[0055]
[发明解决的问题]
[0056]
考虑到以上情况而完成本发明。本发明的目的是提供多特异性抗原结合分子，所述多特异性抗原结合分子使t细胞接近靶癌细胞，并且可以通过t细胞针对含表达磷脂酰肌醇聚糖3的细胞的靶癌症组织的细胞毒性活性治疗癌症，并且是能够以高效率制备的分子形式；用于制备抗原结合分子的方法；和包含抗原结合分子作为活性成分的药物组合物。
[0057]
[解决问题的方式]
[0058]
本发明人发现了包含结合磷脂酰肌醇聚糖3的抗体可变区的结构域和包含结合t细胞受体复合物的抗体可变区的结构域所共有的l链，其中所述共有l链能够改善对两种抗原的亲和力。这允许制备可以高效率制备的分子形式，并且进一步发现保持t细胞重新引导抗体如bite所具有的强抗肿瘤活性和不以癌症抗原依赖性方式引起细胞因子风暴的优异安全性质的新的多特异性抗原结合分子，并且其在血液中还具有长的半衰期。此外，本发明人发现包含共有l链的多特异性抗原结合分子靶向表达磷脂酰肌醇聚糖3的癌细胞并且引起细胞损伤。基于该发现，本发明人阐明了本发明的多特异性抗原结合分子引起对含有表
达磷脂酰肌醇聚糖3的癌细胞的癌症组织的损伤。
[0059]
更具体地，本发明提供以下各项：
[0060]
[1]多特异性抗原结合分子，其包含：
[0061]
(1)包含具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区的结构域，
[0062]
(2)包含具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域，和
[0063]
(3)包含具有减小的对fcγ受体的结合活性的fc区的结构域，
[0064]
其中包含在(1)的可变区和(2)的可变区中的l链可变区具有共有氨基酸序列；其中所述多特异性抗原结合分子具有的细胞毒性活性等于或大于双特异性抗体gpc3_ery22_rce115的细胞毒性活性，所述双特异性抗体gpc3_ery22_rce115含有：包含seq id no:47和48的磷脂酰肌醇聚糖3结合结构域和包含seq id no:49和50的t细胞受体复合物结合结构域。
[0065]
[2][1]的多特异性抗原结合分子，其中细胞毒性活性是t细胞依赖性细胞毒性活性。
[0066]
[3][1]或[2]的多特异性抗原结合分子，其中t细胞受体复合物结合活性是对t细胞受体的结合活性。
[0067]
[4][1]至[3]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中t细胞受体复合物结合活性是对cd3ε链的结合活性。
[0068]
[5][1]至[4]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中[1]中的(1)的抗体可变区是包含选自以下(a1)至(a5)的h
‑
链cdr1、cdr2和cdr3的组合中任一个的抗体可变区，或与其功能等效的抗体可变区：
[0069]
(a1)与包含在seq id no:40中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0070]
(a2)与包含在seq id no:197中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0071]
(a3)与包含在seq id no:206中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0072]
(a4)与包含在seq id no:211中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和
[0073]
(a5)与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3。
[0074]
[6][1]至[4]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中[1]中的(2)的抗体可变区是包含选自以下(b1)至(b15)的h
‑
链cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列组合中任一个的抗体可变区，或与其功能等效的抗体可变区：
[0075]
(b1)与包含在seq id no:52中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0076]
(b2)与包含在seq id no:103中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0077]
(b3)与包含在seq id no:122中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0078]
(b4)与包含在seq id no:128中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0079]
(b5)与包含在seq id no:129中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0080]
(b6)与包含在seq id no:132中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0081]
(b7)与包含在seq id no:142中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0082]
(b8)与包含在seq id no:144中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0083]
(b9)与包含在seq id no:164中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0084]
(b10)与包含在seq id no:168中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0085]
(b11)与包含在seq id no:421中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0086]
(b12)与包含在seq id no:424中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0087]
(b13)与包含在seq id no:426中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0088]
(b14)与包含在seq id no:429中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和
[0089]
(b15)与包含在seq id no:430中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3。
[0090]
[7][1]至[4]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中[1]中的(1)和(2)的抗体可变区是包含选自以下(c1)至(c19)的h
‑
链cdr1、cdr2和cdr3的组合中任一个的抗体可变区，或与其功能等效的抗体可变区：
[0091]
(c1)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:40中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:52中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0092]
(c2)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:40中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:421中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0093]
(c3)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:40中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:426中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0094]
(c4)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:40中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:429中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0095]
(c5)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:40中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:430中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0096]
(c6)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:197中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:128中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0097]
(c7)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:206中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:142中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0098]
(c8)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:206中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:144中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0099]
(c9)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:206中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:164中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0100]
(c10)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:206中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:168中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0101]
(c11)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:211中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:142中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0102]
(c12)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:211中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:144中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0103]
(c13)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:211中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:164中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和
cdr3；
[0104]
(c14)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:211中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:168中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0105]
(c15)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:103中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0106]
(c16)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:122中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0107]
(c17)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:129中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0108]
(c18)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:132中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和
[0109]
(c19)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:424中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3。
[0110]
[8][5]至[7]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中cdr1、cdr2和cdr3是基于kabat编号的cdr1、cdr2和cdr3区。
[0111]
[9][1]至[4]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中[1]中的(1)的抗体可变区是包含选自以下(a1)至(a5)的h链可变区中任一的抗体可变区，或与其功能等效的抗体可变区：
[0112]
(a1)具有seq id no:40的氨基酸序列的h链可变区；
[0113]
(a2)具有seq id no:197的氨基酸序列的h链可变区；
[0114]
(a3)具有seq id no:206的氨基酸序列的h链可变区；
[0115]
(a4)具有seq id no:211的氨基酸序列的h链可变区；和
[0116]
(a5)具有seq id no:215的氨基酸序列的h链可变区。
[0117]
[10][1]至[4]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中[1]中的(2)的抗体可变区是包含选自以下(b1)至(b15)的h链可变区中任一的抗体可变区，或与其功能等效的抗体可变区：
[0118]
(b1)具有seq id no:52的氨基酸序列的h链可变区；
[0119]
(b2)具有seq id no:103的氨基酸序列的h链可变区；
[0120]
(b3)具有seq id no:122的氨基酸序列的h链可变区；
[0121]
(b4)具有seq id no:128的氨基酸序列的h链可变区；
[0122]
(b5)具有seq id no:129的氨基酸序列的h链可变区；
[0123]
(b6)具有seq id no:132的氨基酸序列的h链可变区；
[0124]
(b7)具有seq id no:142的氨基酸序列的h链可变区；
[0125]
(b8)具有seq id no:144的氨基酸序列的h链可变区；
[0126]
(b9)具有seq id no:164的氨基酸序列的h链可变区；
[0127]
(b10)具有seq id no:168的氨基酸序列的h链可变区；
[0128]
(b11)具有seq id no:421的氨基酸序列的h链可变区；
[0129]
(b12)具有seq id no:424的氨基酸序列的h链可变区；
[0130]
(b13)具有seq id no:426的氨基酸序列的h链可变区；
[0131]
(b14)具有seq id no:429的氨基酸序列的h链可变区；和
[0132]
(b15)具有seq id no:430的氨基酸序列的h链可变区。
[0133]
[11][1]至[4]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中[1]中的(1)和(2)的抗体可变区是包含选自以下(c1)至(c19)的h链可变区组合中任一个的抗体可变区，或与其功能等效的抗体可变区：
[0134]
(c1)具有seq id no:40的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:52的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0135]
(c2)具有seq id no:40的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:421的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0136]
(c3)具有seq id no:40的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:426的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0137]
(c4)具有seq id no:40的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:429的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0138]
(c5)具有seq id no:40的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:430的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0139]
(c6)具有seq id no:197的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:128的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0140]
(c7)具有seq id no:206的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:142的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0141]
(c8)具有seq id no:206的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:144的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变
区；
[0142]
(c9)具有seq id no:206的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:164的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0143]
(c10)具有seq id no:206的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:168的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0144]
(c11)具有seq id no:211的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:142的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0145]
(c12)具有seq id no:211的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:144的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0146]
(c13)具有seq id no:211的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:164的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0147]
(c14)具有seq id no:211的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:168的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0148]
(c15)具有seq id no:215的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:103的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0149]
(c16)具有seq id no:215的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:122的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0150]
(c17)具有seq id no:215的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:129的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；
[0151]
(c18)具有seq id no:215的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:132的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区；和
[0152]
(c19)具有seq id no:215的氨基酸序列的[1]中的(1)的抗体可变区中包含的h链可变区；和具有seq id no:424的氨基酸序列的[1]中的(2)的抗体可变区中包含的h链可变区。
[0153]
[12][1]至[11]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中[1]的共有l链是包含选自以下(d1)至(d11)的cdr1、cdr2和cdr3组合中任一个的共有l链，或与其功能等效的共有l链：
[0154]
(d1)与包含在seq id no:53中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0155]
(d2)与包含在seq id no:223中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0156]
(d3)与包含在seq id no:299中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0157]
(d4)与包含在seq id no:301中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0158]
(d5)与包含在seq id no:302中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0159]
(d6)与包含在seq id no:304中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0160]
(d7)与包含在seq id no:306中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0161]
(d8)与包含在seq id no:307中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0162]
(d9)与包含在seq id no:309中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0163]
(d10)与包含在seq id no:310中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和
[0164]
(d11)与包含在seq id no:319中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3。
[0165]
[13][1]至[11]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中[1]的l链可变区是选自以下(d1)至(d11)的l链氨基酸序列中任一个的可变区：
[0166]
(d1)包含seq id no:53的氨基酸序列的l链；
[0167]
(d2)包含seq id no:223的氨基酸序列的l链；
[0168]
(d3)包含seq id no:299的氨基酸序列的l链；
[0169]
(d4)包含seq id no:301的氨基酸序列的l链；
[0170]
(d5)包含seq id no:302的氨基酸序列的l链；
[0171]
(d6)包含seq id no:304的氨基酸序列的l链；
[0172]
(d7)包含seq id no:306的氨基酸序列的l链；
[0173]
(d8)包含seq id no:307的氨基酸序列的l链；
[0174]
(d9)包含seq id no:309的氨基酸序列的l链；
[0175]
(d10)包含seq id no:310的氨基酸序列的l链；和
[0176]
(d11)包含seq id no:319的氨基酸序列的l链。
[0177]
[14][1]至[4]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中[1]的(1)和(2)的抗体可变区和共有l链可变区是包含选自以下(e1)至(e25)的h
‑
链cdr1、cdr2和cdr3和l
‑
链cdr1、cdr2和cdr3的组合中任一个的抗体可变区，或与其功能等效的抗体可变区：
[0178]
(e1)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:197中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:128中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和
cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:53中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0179]
(e2)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:197中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:128中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:299中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0180]
(e3)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:197中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:128中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:310中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0181]
(e4)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:197中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:128中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:319中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0182]
(e5)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:206中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:142中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:223中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0183]
(e6)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:206中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:144中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:223中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0184]
(e7)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:206中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:164中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:223中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0185]
(e8)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:206中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:168中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:223中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0186]
(e9)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:211中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中
并且与包含在seq id no:142中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:223中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0187]
(e10)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:211中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:142中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:299中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0188]
(e11)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:211中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:144中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:223中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0189]
(e12)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:211中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:164中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:223中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0190]
(e13)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:211中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:168中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:223中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0191]
(e14)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:103中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:53中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0192]
(e15)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:103中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:299中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0193]
(e16)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:103中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:301中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0194]
(e17)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、
cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:103中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:302中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0195]
(e18)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:103中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:304中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0196]
(e19)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:103中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:306中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0197]
(e20)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:103中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:307中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0198]
(e21)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:103中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:309中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0199]
(e22)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:122中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:53中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0200]
(e23)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:129中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:53中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；
[0201]
(e24)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:132中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:53中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和
[0202]
(e25)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:215中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与包含在seq id no:424中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3；和包含在所述共有l链的抗体可变区中并且与包含在seq id no:53中的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列相同的cdr1、cdr2和cdr3。
[0203]
[15][1]至[4]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中[1]的(1)和(2)的抗体可变区和共有l链可变区是包含选自以下(f1)至(f26)的可变区组合中任一个的抗体可变区，或与其功能等效的抗体可变区：
[0204]
(f1)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:197的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:128的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:53中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0205]
(f2)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:197的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:128的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:299中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0206]
(f3)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:197的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:128的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:310中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0207]
(f4)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:197的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:128的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:319中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0208]
(f5)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:206的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:142的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:223中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0209]
(f6)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:206的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:144的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:223中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0210]
(f7)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:206的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:164的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:223中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0211]
(f8)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:206的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:168的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:223中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体
可变区；
[0212]
(f9)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:211的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:142的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:223中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0213]
(f10)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:211的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:142的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:299中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0214]
(f11)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:211的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:144的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:223中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0215]
(f12)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:211的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:164的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:223中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0216]
(f13)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:211的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:168的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:223中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0217]
(f14)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:215的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:103的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:53中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0218]
(f15)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:215的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:103的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:299中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0219]
(f16)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:215的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:103的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:301中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0220]
(f17)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:215的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:103的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:302中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0221]
(f18)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:215的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:103的氨基酸序列相
同的h链可变区；和与包含在seq id no:304中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0222]
(f19)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:215的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:103的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:306中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0223]
(f20)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:215的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:103的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:307中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0224]
(f21)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:215的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:103的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:309中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0225]
(f22)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:215的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:122的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:53中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0226]
(f23)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:215的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:129的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:53中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0227]
(f24)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:215的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:132的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:53中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；
[0228]
(f25)包含在[1]中的(1)的抗体可变区中并且与seq id no:215的氨基酸序列相同的h链可变区；包含在[1]中的(2)的抗体可变区中并且与seq id no:424的氨基酸序列相同的h链可变区；和与包含在seq id no:53中的可变区的氨基酸序列相同的共有l链的抗体可变区；和
[0229]
(f26)多特异性抗原结合分子，其结合与(f1)至(f25)中任一的多特异性抗原结合分子所结合的在磷脂酰肌醇聚糖3和t细胞受体复合物上的表位中的每个重叠的表位，并且具有共有l链。
[0230]
[16][1]至[15]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中[1]中的(3)的fc区是在seq id no:23至26(igg1至igg4)的fc区组成氨基酸中的任一个处具有氨基酸突变的fc区。
[0231]
[17][16]的多特异性抗原结合分子，其中[1]中的(3)的fc区是具有选自由eu编号指定的以下氨基酸位置的至少一个氨基酸的突变的fc区：
[0232]
位置220、位置226、位置229、位置231、位置232、位置233、位置234、位置235、位置236、位置237、位置238、位置239、位置240、位置264、位置265、位置266、位置267、位置269、
位置270、位置295、位置296、位置297、位置298、位置299、位置300、位置325、位置327、位置328、位置329、位置330、位置331和位置332。
[0233]
[18][16]的多特异性抗原结合分子，其中[1]中的(3)的fc区是包含选自由eu编号指定的以下氨基酸的至少一个氨基酸的fc区：
[0234]
氨基酸位置234处的arg，氨基酸位置235处的ala或arg，氨基酸位置239处的lys，和氨基酸位置297处的ala。
[0235]
[19][16]至[18]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中[1]中的(3)的fc区还包含用于促进形成异源二聚体fc区的氨基酸突变。
[0236]
[20][19]的多特异性抗原结合分子，其中所述异源二聚体fc区是以下(g1)或(g2)的氨基酸序列组合：
[0237]
(g1)与包含seq id no:57的氨基酸序列的恒定区的fc区相同的氨基酸序列和与包含seq id no:58的氨基酸序列的恒定区的fc区相同的氨基酸序列的组合；以及
[0238]
(g2)与包含seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的fc区相同的氨基酸序列和与包含seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的fc区相同的氨基酸序列的组合。
[0239]
[21][1]至[20]中任一项的多特异性抗原结合分子，其中所述多特异性抗原结合分子是双特异性抗体。
[0240]
[22]以下(h1)至(h25)中任一项的双特异性抗体：
[0241]
(h1)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:215的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:424的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:53的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0242]
(h2)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:215的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:103的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:53的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0243]
(h3)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:215的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:103的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:299的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0244]
(h4)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:215的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:103的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:301的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0245]
(h5)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:215的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3
结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:103的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:302的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0246]
(h6)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:215的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:103的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:304的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0247]
(h7)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:215的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:103的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:306的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0248]
(h8)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:215的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:103的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:307的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0249]
(h9)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:215的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:103的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:309的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0250]
(h10)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:215的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:122的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:53的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0251]
(h11)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:215的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:129的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:53的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0252]
(h12)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:215的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:132的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:53的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0253]
(h13)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:197的氨基酸
序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:128的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:299的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0254]
(h14)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:197的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:128的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:310的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0255]
(h15)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:197的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:128的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:319的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0256]
(h16)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:197的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:128的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:53的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0257]
(h17)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:211的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:142的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:299的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0258]
(h18)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:211的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:142的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:223的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0259]
(h19)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:211的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:144的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:223的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0260]
(h20)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:206的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:144的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:223的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0261]
(h21)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:206的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:142的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:223的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0262]
(h22)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:206的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:164的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:223的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0263]
(h23)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:206的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:168的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:223的氨基酸序列的共有抗体l链；
[0264]
(h24)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:211的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:164的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:223的氨基酸序列的共有抗体l链；和
[0265]
(h25)双特异性抗体，所述双特异性抗体具有：包含具有seq id no:211的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:61的氨基酸序列的恒定区的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链；包含具有seq id no:168的氨基酸序列的抗体h链可变区和具有seq id no:60或62的氨基酸序列的恒定区的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链；和具有seq id no:223的氨基酸序列的共有抗体l链。
[0266]
[23]编码[1]至[20]中任一项的多特异性抗原结合分子或[21]或[22]的双特异性抗体的核酸。
[0267]
[24]引入有[23]的核酸的载体。
[0268]
[25]包含[23]的核酸或[24]的载体的细胞。
[0269]
[26]通过培养[25]的细胞制备[1]至[20]中任一项的多特异性抗原结合分子或[21]或[22]的双特异性抗体的方法。
[0270]
[27]通过[26]的方法制备的多特异性抗原结合分子或双特异性抗体。
[0271]
[28]药物组合物，所述药物组合物包含：[1]至[20]中任一项的多特异性抗原结合分子或[21]或[22]的双特异性抗体，以及药用载体。
[0272]
[29][28]的药物组合物，其诱导细胞毒性。
[0273]
[30][29]的药物组合物，其中细胞毒性是t细胞依赖性细胞毒性。
[0274]
[31][28]的药物组合物，其用于施用给需要[1]至[20]中任一项的多特异性抗原结合分子或[21]或[22]的双特异性抗体的患者。
[0275]
此外，本发明涉及用于本发明的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含本发明的多
特异性抗原结合分子，或通过本发明的方法制备的多特异性抗原结合分子。本发明还涉及本发明的多特异性抗原结合分子或通过本发明的制备方法制备的多特异性抗原结合分子用于制备用于激活细胞毒性活性的药物组合物的用途。本发明还涉及用于本发明的方法的本发明的多特异性抗原结合分子或通过本发明的制备方法制备的多特异性抗原结合分子。本文中，多特异性抗原结合分子包括本发明的双特异性抗体。
[0276]
此外，本发明涉及包含以下结构域的多特异性抗原结合分子：
[0277]
(1)包含具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区的结构域；
[0278]
(2)包含具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域；
[0279]
其中包含在(1)和(2)的可变区中的l链可变区具有共有的氨基酸序列。本发明还涉及(1)的结构域，所述结构域更具体地是包含具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体重链和/或轻链可变区，并且包含在多特异性抗原结合分子中的结构域。本发明还涉及(2)的结构域，所述结构域更具体地是包含具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区，并且包含在多特异性抗原结合分子中的结构域。(1)和(2)的结构域的细节可以包括以上提及的[1]至[22]中描述的那些。多特异性抗原结合分子可以是双特异性抗体。此外，多特异性抗原结合分子还可以含有包含fc区的结构域，并且所述fc区可以具有减小的fcγ受体结合活性。包含fc区的结构域的细节可以包括以上提及的[1]至[22]中描述的那些。本发明涉及编码所述多特异性抗原结合分子或结构域的核酸，引入有所述核酸的载体，包含所述核酸或载体的细胞，通过培养所述细胞制备所述多特异性抗原结合分子的方法，和通过所述方法制备的多特异性抗原结合分子或包含具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性或t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域。此外，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含所述多特异性抗原结合分子和药用载体。所述药物组合物可以引起细胞损伤，所述细胞损伤可以是t细胞依赖性细胞细胞毒性，并且所述组合物可以用于施用给需要所述多特异性抗原结合分子的患者。
[0280]
本发明还提供结合与以上提及的[14]的(e1)至(e25)中任一的多特异性抗原结合分子所结合的磷脂酰肌醇聚糖3和t细胞受体复合物中的每个上的表位重叠和/或竞争的表位的多特异性抗原结合分子，以及结合与以上提及的[15]的(f1)至(f25)中任一的多特异性抗原结合分子所结合的磷脂酰肌醇聚糖3和t细胞受体复合物中的每个上的表位重叠和/或竞争的表位的多特异性抗原结合分子。
[0281]
关于以上提及的[20]的(g1)和(g2)，在两个fc区中，前一个fc区可以包含在具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链中，而后一个fc区可以包含在具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链中；或前一个fc区可以包含在具有t细胞受体复合物结合活性的抗体h链中，而后一个fc区可以包含在具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体h链中。
[0282]
[发明效果]
[0283]
本发明提供具有可以高效率制备的分子形式的新的多特异性抗原结合分子，其保持bite所具有的强抗肿瘤活性和不以癌症抗原依赖性方式引起细胞因子风暴的优异安全性质等，并且在血液中具有长的半衰期。包含本发明的多特异性抗原结合分子作为活性成分的激活细胞毒性活性的药物组合物靶向包含表达磷脂酰肌醇聚糖3的癌细胞的癌症组织从而引起细胞损伤，并且可以治疗或预防各种癌症。本发明使得不仅具有高水平的安全性而且还具有减小的身体负担并且对患者来说非常方便的理想治疗成为可能。
[0284]
附图简述
[0285]
图1显示a:ery22和b:ery27的示意图。
[0286]
图2是这样的图，其显示当将nci
‑
h446用作靶细胞时gpc3_ery22_rce115和gpc3_ery27_hce115的细胞毒性活性。实心菱形(
◆
)和实心三角形(
▲
)分别指示gpc3_ery22_rce115和gpc3_ery27_hce115的细胞毒性活性。
[0287]
图3是这样的图，其显示当将pc
‑
10用作靶细胞时gpc3_ery22_rce115和gpc3_ery27_hce115的细胞毒性活性。实心菱形(
◆
)和实心三角形(
▲
)分别指示gpc3_ery22_rce115和gpc3_ery27_hce115的细胞毒性活性。
[0288]
图4是这样的图，其显示当将nci
‑
h446用作靶细胞时优化的抗体的细胞毒性活性。
[0289]
图5是这样的图，其显示当将nci
‑
h446用作靶细胞时优化的抗体的细胞毒性活性。
[0290]
图6是这样的图，其显示当将nci
‑
h446用作靶细胞时优化的抗体的细胞毒性活性。
[0291]
图7是这样的图，其显示当将nci
‑
h446用作靶细胞时优化的抗体的细胞毒性活性。
[0292]
图8是这样的图，其显示当将nci
‑
h446用作靶细胞时优化的抗体的细胞毒性活性。
[0293]
图9是这样的图，其显示当将nci
‑
h446用作靶细胞时优化的抗体的细胞毒性活性。
[0294]
图10显示当将pc
‑
10用作靶细胞时优化的抗体的体内抗肿瘤作用。
[0295]
图11显示当将nci
‑
h446用作靶细胞时优化的抗体的体内抗肿瘤作用。
[0296]
图12显示组成igg1、igg2、igg3和igg4的fc区的氨基酸残基之间的关系以及kabat eu编号系统(本文中，也被称为eu索引)。
[0297]
图13
‑
1显示重链可变区序列及其根据kabat等的编号。
[0298]
图13
‑
2显示重链可变区序列及其根据kabat等的编号。
[0299]
图14显示轻链可变区序列及其根据kabat等的编号。
具体实施方式
[0300]
提供以下定义以帮助理解本文中阐述的发明。
[0301]
抗体
[0302]
在本说明书中，“抗体”是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成而制备的免疫球蛋白。抗体可从天然存在该抗体的血浆或血清等的天然资源、或者产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离。备选地，可通过使用基因重组等的技术部分或完全地合成。优选的抗体包括，例如，免疫球蛋白的同种型或这些同种型的亚类的抗体。已知人免疫球蛋白包括igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igd、ige、igm这9种类别(同种型)。本发明的抗体中，可包含这些同种型中的igg1、igg2、igg3、igg4。
[0303]
制作具有所需结合活性的抗体的方法是本领域技术人员已知的。下面，例示与属于gpi锚定型受体家族的磷脂酰肌醇聚糖
‑
3(下文中，也被称为gpc3)(int j cancer.(2003)103(4),455
‑
65)结合的抗体(抗gpc3抗体)的制作方法。与t细胞受体复合物结合的抗体也可以根据下述例示来制备。
[0304]
抗gpc3抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗gpc3抗体，可以优选制备来源于哺乳动物的单克隆抗体。这些来源于哺乳动物的单克隆抗体包含由杂交瘤产生的抗体或由宿主细胞所产生的抗体，所述宿主细胞通过基因工程技术用携带抗体基因的表达载体转化。
[0305]
产生单克隆抗体的杂交瘤，可以通过使用公知技术，例如以如下方式来制作。具体地，使用gpc3蛋白质作为致敏性抗原，按照常规的免疫方法对哺乳动物进行免疫。利用常规的细胞融合法使获得的免疫细胞与公知的亲本细胞相融合。然后，利用常规的筛选法，通过筛选产生单克隆抗体的细胞，可以选择产生抗gpc3抗体的杂交瘤。
[0306]
具体而言，单克隆抗体的制作例如以如下方式来进行。首先，通过表达在refseq登记号nm_001164617.1(seq id no:1)中公开了其核苷酸序列的gpc3基因，可以获得用作抗体获得的致敏性抗原的refseq登记号np_001158089.1(seq id no:2)所表示的gpc3蛋白质。即，通过将编码gpc3的基因序列插入到已知的表达载体中，适当的宿主细胞得以转化。用公知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化所需的人gpc3蛋白质。为了从培养上清中获得可溶型的gpc3，例如，代替seq id no:2所表达的gpc3蛋白质，使从seq id no:2所表示的gpc3多肽序列中缺失了构成相当于为了使gpc3锚定于细胞膜上所使用的gpi锚定序列的疏水区的564
‑
580氨基酸的蛋白质表达。另外，经纯化的天然的gpc3蛋白质也同样可以用作致敏性抗原。
[0307]
纯化的gpc3蛋白可被用作致敏性抗原以用于哺乳动物中的免疫。gpc3的部分肽也可被用作致敏性抗原。在此情况中，所述部分肽也可以通过化学合成自人gpc3氨基酸序列获得。此外，其也可以通过将gpc3基因的一部分整合到表达载体中并将其表达而获得。此外，其也可以通过使用蛋白酶将gpc3蛋白降解获得，但是用作部分肽的gpc3肽的区域和尺寸不特别地受限于具体实施方案。作为优选的区域，可以选择来自对应于seq id no:2的氨基酸序列中的位置524至563处的氨基酸的氨基酸序列的任何序列，或更优选地来自对应于seq id no:2的氨基酸序列中的位置537至563处的氨基酸的氨基酸序列的任何序列。优选地，可以自不含有对应于seq id no:2的氨基酸序列中的位置550至663处的氨基酸的氨基酸序列的区域的氨基酸序列选择任何序列。优选地，可以自对应于seq id no:2的氨基酸序列中的位置544至553的氨基酸序列选择任何序列，并且更优选地，可以自对应于seq id no:2的氨基酸序列中的位置546至551的氨基酸序列选择任何序列。组成被用作致敏性抗原的肽的氨基酸的数目为至少五个以上，或优选地例如，六个以上，或七个以上。更具体地，由8至50个残基或优选地10至30个残基组成的肽可被用作致敏性抗原。
[0308]
备选地，可以将gpc3蛋白质的所需的部分多肽或肽与不同的多肽融合而成的融合蛋白质作为致敏性抗原来利用。为了制备用作致敏性抗原的融合蛋白质，例如可以适当利用抗体的fc片段和肽标签等。表达融合蛋白质的载体可以通过使编码所需的两种或其以上的多肽片段的基因在符合读框内进行融合，该融合基因如上述插入到表达载体中来制作。融合蛋白质的制作方法记载于molecular cloning 2nd ed.(sambrook,j等,molecular cloning 2nd ed.,9.47
‑
9.58(1989)cold spring harbor lab.出版社)中。用作致敏性抗原的gpc3的获得方法和使用gpc3的免疫方法也具体地记载于wo2003/000883、wo2004/022754、wo2006/006693中。
[0309]
作为用该致敏性抗原免疫的哺乳动物，不限于特定的动物，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的适合性来进行选择。一般来说优选使用啮齿类的动物如小鼠、大鼠和仓鼠、兔和猴等。
[0310]
按照公知的方法利用致敏性抗原对上述的动物进行免疫。例如，作为一般的方法，通过向哺乳动物的腹腔内或皮下注射给予致敏性抗原来实施免疫。具体而言，使用pbs(磷
酸缓冲盐水)或生理盐水等以适当的稀释倍率稀释的致敏性抗原根据需要与常规的佐剂、例如弗氏完全佐剂进行混合、乳化后，将该致敏性抗原每隔4～21天数次给予哺乳动物。另外，在致敏性抗原的免疫时可以使用适当的载体。特别是在使用分子量较小的部分肽作为致敏性抗原的情况下，将与白蛋白、钥孔虫戚血兰素等的载体蛋白质结合而成的该致敏性抗原肽用于免疫有时也为理想的情况。
[0311]
另外，产生所需抗体的杂交瘤也可以使用dna免疫以如下方式来制作。dna免疫是指，在给予了以在免疫动物中使编码抗原蛋白质的基因能够表达的方式构建的载体dna的该免疫动物中，通过使致敏性抗原在该免疫动物的活体内表达，而赋予免疫刺激的免疫方法。与对免疫动物给予蛋白质抗原的一般免疫方法相比较，dna免疫期待以下的优越性：
[0312]
－维持gpc3这样的膜蛋白质的结构而能够赋予免疫刺激；以及
[0313]
－无需纯化免疫抗原。
[0314]
为了通过dna免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达gpc3蛋白质的dna。编码gpc3的dna可以通过pcr等公知的方法来合成。所得dna被插入到适当的表达载体中，对免疫动物进行给予。作为表达载体，可以适合利用例如pcdna3.1等市售的表达载体。作为将载体给予活体内的方法，可以利用通常使用的方法。例如，通过将吸附有表达载体的金颗粒用基因枪导入到免疫动物个体的细胞内来进行dna免疫。并且，识别gpc3的抗体的制作也可以使用国际公开wo2003/104453所记载的方法来制作。
[0315]
如此对哺乳动物进行免疫，确认到在血清中与gpc3结合的抗体效价提高后，从哺乳动物采取免疫细胞，供给于细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别是可以使用脾细胞。
[0316]
作为与上述免疫细胞相融合的细胞，可以使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标记。选择标记是指在特定的培养条件下能够(或者不能够)存活的特性。公知的选择标记有：缺乏次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤
‑
磷酸核糖转移酶(以下省略为缺乏hgprt)、或者缺乏胸苷激酶(以下省略为缺乏tk)等。具有缺乏hgprt或tk的细胞具有次黄嘌呤
‑
氨基蝶呤
‑
胸苷敏感性(以下省略为hat敏感性)。hat敏感性的细胞虽然在hat选择培养中不能进行dna合成而死亡，但如果与正常的细胞相融合，则利用正常细胞的补救途径可以持续dna的合成，因此在hat选择培养中也可以增殖。
[0317]
缺乏hgprt或缺乏tk的细胞分别可以在含有6
‑
硫鸟嘌呤、8
‑
氮鸟嘌呤(以下省略为8ag)、或者5'
‑
溴脱氧尿苷的培养基中选择。将这些嘧啶类似物摄入到dna中的正常细胞将死亡。同时，不摄入这些嘧啶类似物的、缺乏这些酶的细胞可以在选择培养中存活。此外被称为g418抗性的选择标记通过新霉素抗性基因赋予对2
‑
脱氧链霉胺类抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。适合于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是公知的。
[0318]
作为这样的骨髓瘤细胞，可以适合使用例如：
[0319]
p3(p3x63ag8.653)(j.immunol.(1979)123(4),1548
‑
1550)、
[0320]
p3x63ag8u.1(current topics in microbiology and immunology(1978)81,1
‑
7)、
[0321]
ns
‑
1(c.eur.j.immunol.(1976)6(7),511
‑
519)、
[0322]
mpc
‑
11(cell(1976)8(3),405
‑
415)、
[0323]
sp2/0(nature(1978)276(5685),269
‑
270)、
[0324]
fo(j.immunol.methods(1980)35(1
‑
2),1
‑
21)、
[0325]
s194/5.xx0.bu.1(j.exp.med.(1978)148(1),313
‑
323)、
[0326]
r210(nature(1979)277(5692),131
‑
133)等。
[0327]
基本上是按照公知的方法、例如kohler和milstein等人的方法(methods enzymol.(1981)73,3
‑
46)等，来进行上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。
[0328]
更具体而言，例如可以在细胞融合促进剂的存在下，在常规的营养培养液中实施上述细胞融合。使用例如聚乙二醇(peg)、仙台病毒(hvj)等作为融合促进剂，为了进一步提高融合效率，根据需要可以添加使用二甲亚砜等的辅助剂。
[0329]
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞优选使用1～10倍的免疫细胞。作为用于上述细胞融合的培养液，可以使用例如适合于上述骨髓瘤细胞株增殖的rpmi1640培养液、mem培养液、以及该种的细胞培养中使用的常规的培养液，并且可以适合添加胎牛血清(fcs)等的血清补液。
[0330]
就细胞融合而言，可以将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的规定量在上述培养液中充分混合，再以通常30％～60％(w/v)的浓度添加预先加热到37℃左右的peg溶液(例如平均分子量1,000～6,000左右)。通过对混合液进行缓慢混合可以形成所需的融合细胞(杂交瘤)。接着，逐渐添加上述例举的适当培养液，通过重复离心、除去上清的操作，可以除去不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。
[0331]
如此获得的杂交瘤可以用常规的选择培养液、例如hat培养液(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养液)进行培养来选择。使用上述hat培养液的培养持续到所需杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的足够时间(通常，所述足够的时间为数天至数周)。接着，可以利用常规的有限稀释法实施产生所需抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。
[0332]
如此获得的杂交瘤可以通过利用基于在细胞融合中使用的骨髓瘤所具有的选择标记的选择培养液来进行选择。例如具有缺乏hgprt或tk的细胞，可以通过用hat培养液(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养液)进行培养来选择。即，在将hat敏感性的骨髓瘤细胞用于细胞融合的情况下，在hat培养液中，与正常细胞成功进行细胞融合的细胞可以选择性地增殖。使用上述hat培养液的培养持续到使所需杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的足够时间。具体而言，通常可以通过数天至数周的培养，选择所需的杂交瘤。接着，可以利用常规的有限稀释法实施产生所需抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。
[0333]
所需抗体的筛选和单一克隆，可以通过基于公知的抗原抗体反应的筛选方法来适当地实施。例如，结合于gpc3的单克隆抗体，可以结合于在细胞表面表达的gpc3。这样的单克隆抗体，例如可以通过荧光激活细胞分选术(facs)进行筛选。facs是指通过用激光分析与荧光抗体接触的细胞，测定各细胞所发出的荧光进而使结合于细胞表面的抗体的测定成为可能的系统。
[0334]
为了通过facs对产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤进行筛选，首先制备表达gpc3的细胞。用于筛选的优选细胞为强制表达gpc3的哺乳动物细胞。通过将作为宿主细胞使用的未转化的哺乳动物细胞用作对照，可以选择性地检测对抗细胞表面的gpc3的抗体的结合活性。即，通过选择不结合于宿主细胞、结合于强制表达gpc3的细胞的产生抗体的杂交瘤，可以获得产生gpc3单克隆抗体的杂交瘤。
[0335]
或者，抗体对于固定的表达gpc3的细胞的结合活性可以基于elisa的原理进行评价。例如，使表达gpc3的细胞固定在elisa板的孔内。通过使杂交瘤的培养上清与孔内的固
定的细胞相接触，来检测结合于固定细胞上的抗体。当单克隆抗体为小鼠由来的情况下，结合于细胞上的抗体可以通过抗小鼠免疫球蛋白抗体来检测。通过上述筛选而选择的、具有抗原结合能的、产生所需抗体的杂交瘤，可以通过有限稀释法等进行克隆。
[0336]
如此制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常规的培养液中继代培养。另外，该杂交瘤可以在液态氮中长期保存。
[0337]
将该杂交瘤按照常规的方法进行培养，可以从其培养上清中获得所需的单克隆抗体。或者将杂交瘤给予与其具有适应性的哺乳动物并进行增殖，可以从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适合于获得高纯度的抗体。
[0338]
由从该杂交瘤等的抗体产生细胞克隆的抗体基因所编码的抗体也可以被适合地利用。通过将克隆的抗体基因插入到适当的载体并导入到宿主中，由该基因所编码的抗体得以表达。用于抗体基因的分离、向载体的导入、以及宿主细胞的转化的方法，例如通过vandamme等人已经确立(eur.j.biochem.(1990)192(3),767
‑
775)。如下所述，重组抗体的制备方法也是公知的。
[0339]
例如，可以从产生抗gpc3抗体的杂交瘤细胞中获得编码抗gpc3抗体的可变区(v区)的cdna。为此，通常先从杂交瘤中提取总rna。作为用于从细胞提取mrna的方法，可以利用例如以下所述的方法：
[0340]
－胍超速离心法(biochemistry(1979)18(24),5294
‑
5299)；
[0341]
－agpc法(anal.biochem.(1987)162(1),156
‑
159)。
[0342]
所提取的mrna可以使用mrna提纯试剂盒(ge healthcare bioscience)等来进行纯化。或者，如quickprep mrna提纯试剂盒(ge healthcare bioscience)等这样的用于从细胞直接提取总mrna的试剂盒也得以市售。可以使用这样的试剂盒从杂交瘤中获得mrna。可以使用逆转录酶由所得的mrna合成编码抗体v区的cdna。cdna可以通过amv reverse transcriptase first
‑
strand cdnasynthesis kit(生化学工业社)等来合成。另外，为了合成和扩增cdna，可以适当利用smart race cdna扩增试剂盒(clontech)和基于pcr的5'
‑
race法(proc.natl.acad.sci.usa(1988)85(23),8998
‑
9002；nucleic acids res.(1989)17(8),2919
‑
2932)。并且，在这样的cdna的合成的过程中，可以在cdna的两末端导入后述的适当的限制酶位点。
[0343]
由所得pcr产物纯化作为目标的cdna片段，接着使其与载体dna相连接。如此操作重组载体得以制作，将其导入到大肠杆菌等中，选择菌落后，可以由形成该菌落的大肠杆菌制备所需的重组载体。而且，关于该重组载体是否具有作为目标的cdna的核苷酸序列，可以利用公知的方法、例如双脱氧核苷酸链终止法等来确认。
[0344]
为了获得编码可变区的基因，利用使用了可变区基因扩增用引物的5'
‑
race法是简便的。首先以由杂交瘤细胞提取的rna为模板合成cdna，获得5'
‑
race cdna文库。5'
‑
race cdna文库的合成中可以适当使用smart race cdna扩增试剂盒等市售的试剂盒。
[0345]
以所得5'
‑
race cdna文库为模板，通过pcr法扩增抗体基因。基于公知的抗体基因序列可以设计小鼠抗体基因扩增用引物。这些引物是依赖于免疫球蛋白的亚类而不同的核苷酸序列。因此，预先使用iso strip小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(roche diagnostics)等的市售试剂盒来决定亚类是理想的。
[0346]
具体而言，例如当以获得编码小鼠igg的基因为目的时，可以利用能够扩增编码作
为重链的γ1、γ2a、γ2b、γ3、作为轻链的κ链和λ链的基因的引物。为了扩增igg的可变区基因，通常对于3'侧的引物可以利用在相当于与可变区相近的恒定区的部分退火的引物。另一方面，对于5'侧的引物则可以利用附属于5'race cdna文库制作试剂盒的引物。
[0347]
利用如此扩增的pcr产物，可以重构由重链和轻链的组合而组成的免疫球蛋白。以重构的免疫球蛋白的gpc3结合活性为指标，可以筛选所需的抗体。例如以获得对抗gpc3的抗体为目的时，进一步优选抗体与gpc3的结合为特异性的。与gpc3结合的抗体例如可以通过以下方式进行筛选：
[0348]
(1)将含有由杂交瘤获得的cdna所编码的v区的抗体与表达gpc3的细胞相接触的步骤；
[0349]
(2)检测表达gpc3的细胞与抗体结合的步骤；和
[0350]
(3)选择与表达gpc3的细胞结合的抗体的步骤。
[0351]
检测抗体与表达gpc3的细胞结合的方法是公知的。具体而言，可以通过前面所述的facs等方法检测到抗体与表达gpc3的细胞的结合。为了评价抗体的结合活性可以适当利用表达gpc3的细胞的固定标本。
[0352]
作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，也适合使用利用噬菌体载体的淘选方法。由多克隆的抗体表达细胞群将抗体基因以重链和轻链的亚类的文库形式获得的情况下，利用噬菌体载体的筛选方法是有利的。编码重链和轻链的可变区的基因可以通过用适当的接头序列进行连接来形成单链fv(scfv)。通过将编码scfv的基因插入到噬菌体载体可以获得scfv表达于表面的噬菌体。该噬菌体与所需的抗原接触后，通过回收与抗原结合的噬菌体，可以回收编码具有目标结合活性的scfv的dna。通过根据需要重复该操作，可以浓缩具有所需结合活性的scfv。
[0353]
获得编码目标抗gpc3抗体的v区的cdna后，通过识别插入到该cdna两末端的限制酶位点的限制酶，来消化该cdna。优选的限制酶识别并消化出现在构成抗体基因的核苷酸序列的频率低的核苷酸序列。并且为了将单拷贝的消化片段以正确的方向插入到载体中，优选插入赋予粘性末端的限制酶。通过将如此消化的编码抗gpc3抗体的v区的cdna插入到适当的表达载体中，可以获得抗体表达载体。此时，若编码抗体恒定区(c区)的基因与上述编码v区的基因符合读框的融合，则获得嵌合抗体。在此，嵌合抗体是指恒定区和可变区的由来不同。因此，除了小鼠
‑
人等的异种嵌合抗体之外，人
‑
人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。通过向预先具有恒定区的表达载体中插入上述v区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体而言，例如，可以向持有编码所需抗体恒定区(c区)的dna的表达载体的5'侧适当配置消化上述v区基因的限制酶的限制酶识别序列。通过使利用相同组合的限制酶消化的两者符合读框的融合来构建嵌合抗体表达载体。
[0354]
为了制备抗gpc3单克隆抗体，抗体基因被插入到表达载体中使其在表达控制区的控制下表达。用于表达抗体的表达控制区包含例如增强子和启动子。另外，为了使表达的抗体分泌到细胞外，可以在氨基末端附加适当的信号序列。在后面记载的实施例中，作为信号序列使用了具有氨基酸序列mgwsciilflvatatgvhs(seq id no:3)的肽，此外也附加了适合的信号序列。所表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切割、被切割的多肽可以作为成熟多肽分泌到细胞外。接着，通过用该表达载体来转化适当的宿主细胞，可以获得表达编码抗gpc3抗体的dna的重组细胞。
[0355]
为了表达抗体基因，编码抗体重链(h链)和轻链(l链)的dna分别被插入到不同的表达载体中。通过用插入有h链和l链的载体共转染相同的宿主细胞，可以表达具备h链和l链的抗体分子。或者通过使编码h链和l链的dna插入到单一的表达载体中，可以转化宿主细胞(参照国际公开wo 94/11523)。
[0356]
通过将所分离的抗体基因导入到适当的宿主用来制备抗体的宿主细胞与表达载体的多数组合是公知的。这些表达系均可以应用于包含本发明的抗体可变区的结构域的分离。在真核细胞用作宿主细胞的情况下，可以适当使用动物细胞、植物细胞、或者真菌细胞。具体而言，作为动物细胞，可以例示以下细胞：
[0357]
(1)哺乳类细胞：cho、cos、骨髓瘤、幼仓鼠肾(bhk)、hela、vero等；
[0358]
(2)两栖类细胞：非洲爪蟾卵母细胞等；和
[0359]
(3)昆虫细胞：sf9、sf21、tn5等。
[0360]
或者，作为植物细胞，烟草(nicotiana tabacum)等的烟草(nicotiana)属由来的细胞的抗体基因的表达系是公知的。对于植物细胞的转化，可以适当利用愈伤组织培养的细胞。
[0361]
并且，作为真菌细胞，可以利用以下的细胞：
[0362]
酵母：酿酒酵母(saccharomyces serevisiae)等的酵母(saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)等的毕赤酵母(pichia)属；
[0363]
丝状菌：黑曲霉(aspergillus niger)等的曲霉(aspergillus)属。
[0364]
另外，利用原核细胞的抗体基因的表达系也是公知的。例如，使用细菌细胞的情况下，可以适当利用大肠杆菌(e.coli)、枯草杆菌等的细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入包含目标抗体基因的表达载体。通过将所转化的细胞在体外进行培养，可以从该转化细胞的培养物中获得所需的抗体。
[0365]
对于重组抗体的产生，除了上述宿主细胞之外，也可以利用转基因动物。即，从导入了编码所需抗体的基因的动物可以获得该抗体。例如，抗体基因可以通过符合读框的插入到编码乳汁中固有产生的蛋白质的基因的内部来构建融合基因。作为分泌到乳汁中的蛋白质，可以利用例如山羊β酪蛋白等。含有插入了抗体基因的融合基因的dna片段被注入到山羊的胚胎中，该经注入的胚胎被导入到雌性山羊体内。由接受了胚胎的山羊生出转基因山羊，从该转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中可以作为与乳汁蛋白质的融合蛋白质获得所需抗体。另外，为了使转基因山羊产生的含有所需抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素(ebert,k.m等，bio/technology(1994),12(7),699
‑
702)。
[0366]
当将本文中所述的抗原结合分子施用于人时，来源于已被人工修饰而减小针对人等的异源抗原性的遗传重组抗体的结构域可被合适地用作包含抗体可变区的抗原结合分子的结构域。此种遗传重组的抗体包括，例如，人源化抗体。这些经修饰的抗体通过已知方法被合适地制备。
[0367]
为了制作本说明书中记载的包含抗体可变区的抗原结合分子的结构域而使用的抗体的可变区通常由夹在4个构架区(fr)的3个互补性决定区(complementarity
‑
determining region；cdr)构成。cdr实质上是决定抗体的结合特异性的区。cdr的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成fr的氨基酸序列，即使在具有不同的结合特异性的抗体之间，也大多显示出高的同一性。因此，通常认为通过移植cdr可以将某抗体的结合特异性移
植到其他抗体。
[0368]
人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物、例如小鼠抗体的cdr移植到人抗体的人源化抗体等是公知的。也已知为了获得人源化抗体的常规的基因重组方法。具体而言，作为将小鼠的抗体的cdr移植到人的fr的方法，例如重叠序列延伸pcr(overlap extension pcr)是公知的。在重叠序列延伸pcr中，在用于合成人抗体的fr的引物上附加想要移植的编码小鼠抗体的cdr的核苷酸序列。对于4个fr分别准备引物。通常认为当将小鼠cdr移植到人fr中时，选择与小鼠的fr同一性高的人fr对于维持cdr的功能是有利的。即，通常优选利用由与相邻于想要移植的小鼠cdr的fr的氨基酸序列同一性高的氨基酸序列组成的人fr。
[0369]
另外，要连接的核苷酸序列设计成相互符合读框的相接连。利用各自的引物合成各自的人fr。其结果，获得在各fr上附加了编码小鼠cdr的dna的产物。各产物的编码小鼠cdr的核苷酸序列设计成相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠的cdr部分相互退火来进行互补链合成反应。通过该反应人fr经由小鼠cdr的序列得以连接。
[0370]
最终，3个cdr和4个fr连接而成的v区基因利用在其5'末端和3'末端退火、附加了适当的限制酶识别序列的引物扩增其全长。通过将如上获得的dna与编码人抗体c区的dna以符合读框的融合形式插入到表达载体中，可以制备人源化抗体表达用载体。通过将该重组载体导入到宿主来确立重组细胞后，培养该重组细胞，使编码该人源化抗体的dna表达，由此使该人源化抗体在该培养细胞的培养物中产生(参照欧州专利公开ep239400、国际公开wo 1996/002576)。
[0371]
通过对如上制作的人源化抗体的抗原结合活性进行定性或定量地测定和评价，可以适合选择经由cdr连接时使该cdr形成良好的抗原结合部位的人抗体的fr。根据需要，也可以取代fr的氨基酸残基使重构人抗体的cdr形成适当的抗原结合部位。例如，应用小鼠cdr移植到人fr所使用的pcr法，可以将氨基酸序列的突变导入到fr中。具体而言，可以将部分核苷酸序列的突变导入到fr退火的引物中。核苷酸序列的突变被导入到利用这样的引物合成的fr中。通过将取代了氨基酸的突变型抗体的抗原结合活性利用上述的方法进行测定和评价，可以选择具有所需性质的突变fr序列(sato,k.等,cancer res,1993,53,851
‑
856)。
[0372]
另外，将具有人抗体基因的所有组成成分(repertorie)的转基因动物(参照国际公开wo1993/012227、wo1992/003918、wo1994/002602、wo1994/025585、wo1996/034096、wo1996/033735)作为免疫动物，通过dna免疫可以获得所需的人抗体。
[0373]
并且，使用人抗体文库，通过淘选获得人抗体的技术也被认知。例如，人抗体的v区作为单链抗体(scfv)通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择与抗原结合的表达scfv的噬菌体。通过分析所选择的噬菌体的基因，可以决定编码与抗原结合的人抗体的v区的dna序列。决定与抗原结合的scfv的dna序列。通过使该v区序列与所需人抗体c区的序列符合读框的融合后插入到适当的表达载体中，可以制作表达载体。将该表达载体导入到上述举出的适合的表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达来获得该人抗体。这些方法是已经公知的(参照国际公开wo1992/001047、wo1992/020791、wo1993/006213、wo1993/011236、wo1993/019172、wo1995/001438、wo1995/015388)。
[0374]
包含具有磷脂酰肌醇聚糖3(gpc3)结合活性的抗体可变区的结构域
[0375]
本文中，短语“包含具有磷脂酰肌醇聚糖3(gpc3)结合活性的抗体可变区的结构域”是指包含特异性结合上述gpc3蛋白或gpc3蛋白的部分肽的全部或部分，并且也与其互补的区域的抗体部分。包含抗体可变区的结构域可以来源于一个或多个抗体的可变结构域。优选地，包含抗体可变区的结构域包含抗体轻链和重链可变区(vl和vh)。此种包含抗体可变区的结构域的合适的实例包括“单链fv(scfv)”、“单链抗体”、“fv”、“单链fv 2(scfv2)”、“fab”、“f(ab’)2”等。
[0376]
包含具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域
[0377]
本文中，短语“包含具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域”是指结合t细胞受体复合物的抗体部分，其包含特异性结合t细胞受体复合物的全部或部分并且也与其互补的区域。t细胞受体复合物可以是t细胞受体自身，或与t细胞受体一起构成t细胞受体复合物的衔接头分子。cd3适合作为衔接头分子。
[0378]
包含具有t细胞受体结合活性的抗体可变区的结构域
[0379]
本文中，短语“包含具有t细胞受体结合活性的抗体可变区的结构域”是指通过包括特异性结合t细胞受体的全部或部分并且也与其互补的区域制备的结合t细胞受体的抗体部分。
[0380]
t细胞受体与本发明的结构域结合的部分可以是可变区或恒定区，但是存在于恒定区中的表位是优选的。恒定区序列的实例包括refseq登记号caa26636.1(seq id no:4)的t细胞受体α链，refseq登记号c25777(seq id no:5)的t细胞受体β链，refseq登记号a26659(seq id no:6)的t细胞受体γ1链，refseq登记号aab63312.1(seq id no:7)的t细胞受体γ2链，以及refseq登记号aaa61033.1(seq id no:8)的t细胞受体δ链。
[0381]
包含具有cd3结合活性的抗体可变区的结构域
[0382]
本文中，短语“包含具有cd3结合活性的抗体可变区的结构域”是指通过包括特异性结合cd3的全部或部分并且也与其互补的区域制备的结合cd3的抗体部分。优选地，所述结构域包含抗cd3抗体的轻链和重链可变区(vl和vh)。此种结构域的合适的实例包括“单链fv(scfv)”、“单链抗体”、“fv”、“单链fv 2(scfv2)”、“fab”、“f(ab’)2”等。
[0383]
本发明的包含具有cd3结合活性的抗体可变区的结构域可以是任何表位结合结构域，只要所述表位存在于构成人cd3的γ
‑
链、δ
‑
链或ε
‑
链序列中即可。在本发明中，优选地，合适地使用包含结合存在于人cd3复合物的ε链的胞外区中的表位的抗cd3抗体轻链可变区(vl)和抗cd3抗体重链可变区(vh)的结构域。除了实施例中描述的抗cd3抗体轻链可变区(vl)和抗cd3抗体重链可变区(vh)以外，多种已知的含有结合cd3的抗体轻链可变区(vl)和结合cd3的抗体重链可变区(vh)的cd3结合结构域以及okt3抗体的那些(proc.natl.acad.sci.usa(1980)77,4914
‑
4917)被合适地用作此种结构域。可以适当地使用来源于具有所需性质的抗cd3抗体的含抗体可变区的结构域，所述抗体是通过上述方法使用构成人cd3的γ
‑
链、δ
‑
链或ε
‑
链免疫目标动物获得的。如上所述的人抗体和合适地人源化的抗体可以被合适地用作抗cd3抗体以产生包含具有cd3结合活性的抗体可变区的结构域。关于构成cd3的γ
‑
链、δ
‑
链或ε
‑
链的结构，其多核苷酸序列显示在seq id no:9(nm_000073.2)、10(nm_000732.4)和11(nm_000733.3)中，并且其多肽序列显示在seq id no:12(np_000064.1)、13(np_000723.1)和14(np_000724.1)中(refseq登记号显示在括号中)。
[0384]
本发明的抗原结合分子中的含抗体可变区的结构域可以结合相同的表位。本文
中，相同的表位可以存在于包含seq id no:2或14的氨基酸序列的蛋白质中。备选地，本发明的抗原结合分子中的含抗体可变区的结构域可以分别结合不同的表位。本文中，不同的表位可以存在于包含seq id no:2或14的氨基酸序列的蛋白质中。
[0385]
特异性
[0386]
术语“特异性”表示参与特异性结合的分子之一不显示任何与不同于结合伙伴分子中的一个或数个的分子的显著结合。此外，在含抗体可变区的结构域对抗原中的多个表位中的特定表位具有特异性时，也使用该术语。当含抗体可变区的结构域所结合的表位被包含在数个不同抗原中时，包含含抗体可变区的结构域的抗原结合分子可以结合具有所述表位的各种抗原。
[0387]
表位
[0388]“表位”意指存在于抗原中的抗原决定簇，是指在本说明书中公开的包含抗体可变区的抗原结合分子的结构域所结合的抗原上的位点。因此，例如表位可以通过其结构来定义。另外，也可以根据识别该表位的抗原结合分子中的抗原结合活性来定义该表位。当抗原为肽或多肽的情况下，也可以根据构成表位的氨基酸残基来特定表位。另外，当表位为糖链时，也可以根据特定的糖链结构来特定表位。
[0389]
线型表位是包含识别氨基酸一次序列的表位的表位。典型的线型表位在固定序列中含有至少3个、以及最为常见的是至少5个、例如约8～10个或6～20个的氨基酸。
[0390]
与线型表位相对比，“构象表位”是指包含表位的氨基酸的一级序列不是被识别的表位的单一规定成分的表位(例如，氨基酸的一级序列不一定由规定表位的抗体识别的表位)。相对于线型表位，构象表位可能包含更多数目的氨基酸。关于构象表位的识别，抗体识别肽或蛋白质的三维结构。例如，在蛋白质分子折叠形成三维结构的情况下，形成构象表位的某氨基酸和/或多肽主链呈并列状态，使抗体识别表位成为可能。确定表位的立体结构的方法包含例如x射线结晶学、二维核磁共振分光学以及位点特异性的自旋标记和电子顺磁共振分光学，但不限于这些。例如参考epitope mapping protocols in methods in molecular biology(1996)、第66卷、morris(编)。
[0391]
以下示例用于确认包含含有具有gpc3结合活性的抗体可变区的结构域的测试抗原结合分子与表位结合的方法，并且也可以根据以下实施例合适地进行用于确认包含含有具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域的测试抗原结合分子与表位结合的方法。
[0392]
例如，以下可以确认包含含有具有gpc3结合活性的抗体可变区的结构域的测试抗原结合分子对存在于gpc3分子中的线性表位的识别。合成包含构成gpc3的胞外结构域的氨基酸序列的线性肽用于上述目的。所述肽可以是化学合成的。备选地，其可以通过使用编码对应于胞外结构域的氨基酸序列的gpc3的cdna中的区域的遗传工程方法获得。接下来，评估包含构成胞外结构域的氨基酸序列的线性肽和包含含有具有gpc3结合活性的抗体可变区的结构域的测试抗原结合分子之间的结合活性。例如，利用固定的线性肽作为抗原的elisa可以能够评估抗原结合分子对肽的结合活性。备选地，对线性肽的结合活性可以基于在抗原结合分子与表达gpc3的细胞的结合中由线性肽所导致的抑制水平来评估。这些测试可以阐明抗原结合分子对线性肽的结合活性。
[0393]
此外，以下可以确认包含含有具有gpc3结合活性的抗体可变区的结构域的测试抗
原结合分子对表位的三维结构的识别。制备表达gpc3的细胞以用于上述目的。例如，当包含含有具有gpc3结合活性的抗体可变区的结构域的测试抗原结合分子接触表达gpc3的细胞时，其与所述细胞紧密结合，但是另一方面，存在这样的情况，其中抗原结合分子基本上不结合固定的包含构成gpc3的胞外结构域的氨基酸序列的线性肽。在这些情况中，“基本上不结合”是指，相对于对表达人gpc3的细胞的结合活性，结合活性为80％以下，通常为50％以下，优选为30％以下，并且特别优选为15％以下。
[0394]
作为测定含有gpc3抗原结合结构域的测试抗原结合分子与表达gpc3的细胞的结合活性的方法，例如可以举出：antibodies：a laboratory manual记载的方法(ed harlow,david lane,cold spring harbor laboratory(1988)359
‑
420)。即，可以基于以表达gpc3的细胞为抗原的elisa或荧光激活细胞分选术(facs)的原理进行评价。
[0395]
在elisa格式中，含有gpc3抗原结合结构域的测试抗原结合分子与表达gpc3的细胞的结合活性，可以通过比较由酶反应生成的信号水平来定量地进行评价。即，在固定有表达gpc3的细胞的elisa板上加入测试抗原结合分子。然后，利用识别测试抗原结合分子的酶标记抗体检测与细胞结合的测试抗原结合分子。或者，当使用facs时，制作测试抗原结合分子的稀释系列，通过确定抗体与表达gpc3的细胞的结合效价(titer)，可以比较测试抗原结合分子与表达gpc3的细胞的结合活性。
[0396]
测试抗原结合分子与悬浮于缓冲液等中的在细胞表面上表达的抗原的结合，可以通过流式细胞仪来检测。作为流式细胞仪，已知例如以下的装置：
[0397]
facscanto
tm ii
[0398]
facsaria
tm
[0399]
facsarray
tm
[0400]
facsvantage
tm se
[0401]
facscalibur
tm
(均为bd biosciences的商品名)
[0402]
epics altra hypersort
[0403]
cytomics fc 500
[0404]
epics xl
‑
mcl adc epics xl adc
[0405]
cell lab quanta/cell lab quanta sc(均为beckman coulter的商品名)
[0406]
例如，作为含有gpc3抗原结合结构域的测试抗原结合分子与抗原的结合活性的适合的测定方法的一例，可以举出以下的方法。首先，使用识别与表达gpc3的细胞进行反应的测试抗原结合分子的fitc标记的二次抗体进行染色。通过用适当且适合的缓冲液稀释测试抗原结合分子，将该复合物制备成所需的浓度而使用。例如，以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度来使用。接着，使用facscalibur(bd)测定荧光强度和细胞数。抗体与该细胞的结合量，反映通过使用cell quest software(bd)进行分析而得到的荧光强度、即几何平均数的值。即，通过得到该几何平均数的值，可以测定由测试抗原结合分子的结合量表示的测试抗原结合分子的结合活性。
[0407]
含有gpc3抗原结合结构域的测试抗原结合分子，与某种抗原结合分子共有表位，这一点可以通过两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子之间的竞争由交叉阻断试验(cross
‑
blocking assay)等来检测。例如竞争elisa法为优选的交叉阻断试验。
[0408]
具体而言，在交叉阻断试验中，微量滴定板的孔上包被的gpc3蛋白质在作为候补
的竞争抗原结合分子的存在下或非存在下进行预培养后，添加测试抗原结合分子。与孔中的gpc3蛋白质结合的测试抗原结合分子的量、和与相同表位的结合相竞争的作为候补的竞争抗原结合分子的结合能间接性地相关联。即，竞争抗原结合分子与相同表位的亲和力越大，测试抗原结合分子与包被有gpc3蛋白质的孔的结合活性越降低。
[0409]
经由gpc3蛋白质与孔结合的测试抗原结合分子的量，通过预先标记抗原结合分子可以容易地测定。例如，生物素标记的抗原结合分子，通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶缀合化合物和适当的底物进行测定。利用过氧化物酶等的酶标记的交叉阻断试验特别被称为“竞争elisa法”。抗原结合分子可以利用检测或者测定可能的其他标记物质来标记。具体而言，放射标记或者荧光标记等是公知的。
[0410]
与在候补的竞争抗原结合分子的非存在下实施的对照试验中得到的结合活性相比较，如果竞争抗原结合分子可以将含有gpc3抗原结合结构域的测试抗原结合分子的结合阻断至少20％、优选至少20～50％、进一步优选至少50％，则该测试抗原结合分子为与竞争抗原结合分子实质上结合于相同表位、或为与相同表位的结合相竞争的抗原结合分子。
[0411]
在鉴定含有gpc3抗原结合结构域的测试抗原结合分子所结合的表位的结构的情况下，测试抗原结合分子与对照抗原结合分子共有表位，这一点可以通过比较上述两种抗原结合分子对向构成该表位的肽导入有氨基酸突变而成的肽的结合活性来进行评价。
[0412]
作为测定这样的结合活性的方法，例如，在上述的elisa格式中，可以通过比较测试抗原结合分子和对照抗原结合分子对导入有突变的线型肽的结合活性来测定。作为elisa以外的方法，对结合于柱上的该突变肽的结合活性，也可以通过定量测试抗原结合分子和对照抗原结合分子流过该柱后在洗脱液中洗脱的抗原结合分子来测定。使突变肽作为例如与gst的融合肽吸附于柱上的方法是公知的。
[0413]
另外，在所鉴定的表位是立体表位的情况下，测试抗原结合分子与对照抗原结合分子共有表位，这一点可以通过以下的方法来评价。首先，制备表达gpc3的细胞和在表位导入了突变的表达gpc3的细胞。这些细胞被悬浮于pbs等的适当的缓冲液中，向所得的细胞悬浮液中添加测试抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，向用适当缓冲液洗涤的细胞悬浮液中，添加可以识别测试抗原结合分子和对照抗原结合分子的fitc标记的抗体。用标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过facscalibur(bd)进行测定。测试多肽复合物和对照多肽复合物的浓度通过用适合的缓冲液进行适当稀释制备成所需的浓度而使用。例如，以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度来使用。标记抗体与该细胞的结合量，反映通过使用cell quest software(bd)进行分析而得到的荧光强度、即几何平均数的值。即，通过得到该几何平均数的值，可以测定由标记抗体的结合量表示的测试抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。
[0414]
在本方法中，例如“与表达突变gpc3的细胞实质上不结合”这一点可以通过以下的方法来判断。首先，与表达突变gpc3的细胞结合的测试抗原结合分子和对照抗原结合分子用标记抗体进行染色。接着，检测细胞的荧光强度。在荧光检测中使用facscalibur作为流式细胞术的情况下，所得的荧光强度可以使用cell quest software进行分析。通过从抗原结合分子存在下和非存在下的几何平均数的值，基于下述的计算式，算出该比较值(δgeo
‑
mean)，可以求出由于抗原结合分子的结合而导致的荧光强度的增加比例。
[0415]
δgeo
‑
mean＝geo
‑
mean(抗原结合分子存在下)/geo
‑
mean(抗原结合分子非存在
下)
[0416]
将通过分析得到的反映测试抗原结合分子对表达突变gpc3的细胞的结合量的几何平均数比较值(突变gpc3分子δgeo
‑
mean值)，与反映测试抗原结合分子对表达gpc3的细胞的结合量的δgeo
‑
mean比较值进行比较。在该情况下，在求出对表达突变gpc3的细胞和对表达gpc3的细胞的δgeo
‑
mean比较值时所使用的测试抗原结合分子的浓度，特别优选制备成彼此相同或实质上相同的浓度。将预先确认了识别gpc3中的表位的抗原结合分子作为对照抗原结合分子得以利用。
[0417]
如果测试抗原结合分子对表达突变gpc3的细胞的δgeo
‑
mean比较值较测试抗原结合分子对表达gpc3的细胞的δgeo
‑
mean比较值的至少80％、优选50％、更优选30％、特别优选15％小，则认为是“与表达突变gpc3的细胞实质上不结合”。求出geo
‑
mean值(几何平均数)的计算式记载于cell quest software user's guide(bd biosciences)中。若通过对比较值进行比较，而其程度为实质上同等，则可以评价为：测试抗原结合分子和对照抗原结合分子的表位是相同的。
[0418]
可变片段(fv)
[0419]
在本说明书中，术语“可变片段(fv)”是指包含一对抗体的轻链可变区(vl)和抗体的重链可变区(vh)的来源于抗体的抗原结合结构域的最小单位。在1988年skerra和pluckthun发现了：通过在细菌的信号序列的下游插入抗体的基因，在大肠杆菌中诱导该基因的表达，可以在均一且维持活性的状态下由大肠杆菌的周质组分进行制备(science(1988)240(4855),1038
‑
1041)。由周质组分制备的fv，以与抗原结合的方式缔合了vh和vl。
[0420]
在本说明书中，fv优选包括例如一对fv，其为包含以下的抗原结合分子：
[0421]
(1)二价的抗原结合结构域，其为二价的scfv，是将二价的scfv中的一个一价的scfv经由构成cd3结合结构域的重链fv片段与构成fc区的一个多肽相连接，另一个一价的scfv经由构成cd3结合结构域的轻链fv片段与构成fc区的另一个多肽相连接而成的二价的抗原结合结构域；
[0422]
(2)包含fc区的结构域，其为在igg1、igg2a、igg3或igg4的构成fc区的氨基酸中不具有fcγ受体
‑
结合活性的fc区；和
[0423]
(3)至少一价的cd3结合结构域，
[0424]
其中轻链和重链fv片段缔合以形成cd3结合结构域，以使其能够结合cd3抗原。
[0425]
scfv、单链抗体和sc(fv)2
[0426]
在本说明书中，“scfv”、“单链抗体”、或“sc(fv)2”这样的用语是指在单一的多肽链内，包含由来于重链和轻链两方的可变区，但缺乏恒定区的抗体片段。通常，单链抗体进一步包含被认为使抗原结合成为可能、使形成所需结构成为可能的、vh结构域和vl结构域之间的多肽接头。单链抗体在“the pharmacology of monoclonal antibodies,113卷,rosenburg和moore编,springer
‑
verlag,new york,269～315(1994)”中由pluckthun详细地论述。同样地，也可参照国际专利申请公开wo 1988/001649和美国专利第4,946,778号和同第5,260,203号。在特定的方案中，单链抗体可以为双特异性且/或被人源化。
[0427]
scfv是构成fv的vh和vl由肽接头连接而成的抗原结合结构域(proc.natl.acad.sci.u.s.a.(1988)85(16),5879
‑
5883)。由该肽接头可以维持vh和vl接近的状态。
[0428]
sc(fv)2为两个vl和两个vh的4个可变区由肽接头等的接头连接而构成一条链的单链抗体(j immunol.methods(1999)231(1
‑
2),177
‑
189)。这两个vh和vl也可以由来于不同的单克隆抗体。例如也适合举出：在journal of immunology(1994)152(11),5368
‑
5374中所公开的识别存在于相同抗原中的两种的表位的双特异性sc(fv)2。sc(fv)2可以通过本领域公知的方法来制作。例如，sc(fv)2可以通过将scfv用肽接头等的接头连接来制作。
[0429]
作为构成本说明书中的sc(fv)2的抗原结合结构域的构成，可以举出：两个vh和两个vl以一条链多肽的n末端侧为基点按照vh、vl、vh、vl([vh]
‑
接头
‑
[vl]
‑
接头
‑
[vh]
‑
接头
‑
[vl])的顺序排列为特征的抗体。两个vh和两个vl的顺序不特别限于上述的构成，而是以什么样的顺序排列都可以。例如，也可以举出以下这样的顺序的构成。
[0430]
[vl]
‑
接头
‑
[vh]
‑
接头
‑
[vh]
‑
接头
‑
[vl]；
[0431]
[vh]
‑
接头
‑
[vl]
‑
接头
‑
[vl]
‑
接头
‑
[vh]；
[0432]
[vh]
‑
接头
‑
[vh]
‑
接头
‑
[vl]
‑
接头
‑
[vl]；
[0433]
[vl]
‑
接头
‑
[vl]
‑
接头
‑
[vh]
‑
接头
‑
[vh]；
[0434]
[vl]
‑
接头
‑
[vh]
‑
接头
‑
[vl]
‑
接头
‑
[vh]。
[0435]
关于sc(fv)2的分子形态在wo2006/132352中也有详细的记载。本领域技术人员根据这些记载，为了制作本说明书中公开的抗原结合分子，可以适当制作所需的sc(fv)2。
[0436]
本发明的抗原结合分子还可以缀合peg等的载体高分子或抗癌剂等的有机化合物。另外，插入糖链附加序列，能够以糖链获得所需效果为目的适合地附加。
[0437]
作为结合抗体的可变区的接头，可以使用通过基因工程学导入的任意的肽接头、或合成化合物接头(参照例如protein engineering,9(3),299
‑
305,1996)所公开的接头等，但在本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别的限定，本领域技术人员可以根据目的适当选择，但优选的长度为5个氨基酸以上(对于上限没有特别的限定，通常为30个氨基酸以下、优选20个氨基酸以下)、特别优选15个氨基酸。sc(fv)2包含3个肽接头的情况下，可以全部使用相同长度的肽接头，也可以使用不同长度的肽接头。
[0438]
例如，肽接头的情况下，可以举出以下序列：
[0439]
ser
[0440]
gly
·
ser
[0441]
gly
·
gly
·
ser
[0442]
ser
·
gly
·
gly
[0443]
gly
·
gly
·
gly
·
ser(seq id no:15)
[0444]
ser
·
gly
·
gly
·
gly(seq id no:16)
[0445]
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(seq id no:17)
[0446]
ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(seq id no:18)
[0447]
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(seq id no:19)
[0448]
ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(seq id no:20)
[0449]
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(seq id no:21)
[0450]
ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(seq id no:22)
[0451]
(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(seq id no:17))n
[0452]
(ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(seq id no:18))n
[0453]
其中n为1以上的整数。但是，肽接头的长度和序列本领域技术人员可以根据目的适当选择。
[0454]
合成化学物接头(化学交联剂)是通常用于交联肽的交联剂，例如有：n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯(dss)、双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(bs3)、二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)(dsp)、二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯)(dtssp)、双(琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(egs)、双(磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(磺基
‑
egs)、二琥珀酰亚氨基酒石酸盐(dst)、二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸盐(磺基
‑
dst)、双[2
‑
(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(bsocoes)、以及双[2
‑
(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基
‑
bsocoes)等，这些交联剂均有销售。
[0455]
连接4个抗体可变区时，通常需要3个接头。多个接头可以使用相同的接头，也可以使用不同的接头。
[0456]
fab、f(ab')2和fab'
[0457]“fab”由一条轻链、以及一条重链的ch1区和可变区构成。fab分子的重链不能够与其他重链分子形成二硫键。
[0458]“f(ab')2”和“fab'”是指，通过将免疫球蛋白(单克隆抗体)用作为蛋白质分解酶的胃蛋白酶或者番木瓜蛋白酶等进行处理来制备，在存在于铰链区中的两条h链间的二硫键的前后被消化而生成的抗体片段。例如，可以将igg用番木瓜蛋白酶处理，在存在于铰链区中的两条h链间的二硫键的上游被切断，制备由vl(l链可变区)和cl(l链恒定区)组成的l链和由vh(h链可变区)和chγ1(h链恒定区中的γ1区)组成的h链片段在c末端区通过二硫键连接而成的同种的两个抗体片段。这些两个同种的抗体片段分别被称为fab'。
[0459]“f(ab')2”包含两条轻链和两条重链，所述两条重链包含ch1结构域和部分ch2结构域的恒定区以使链间的二硫键在两条重链间形成。构成本说明书中公开的抗原结合分子的f(ab')2可以适合如下获得：通过将具有所需抗原结合结构域的全长单克隆抗体等用胃蛋白酶等的蛋白质分解酶部分消化后，使fc片段吸附于蛋白a柱而除去。作为所述的蛋白质分解酶，只要是可以通过适当设定ph等的酶的反应条件来消化全长抗体有选择性地生成f(ab')2即可，没有特别的限定，例如，可以例示胃蛋白酶或无花果蛋白酶等。
[0460]
fc结构域
[0461]
构成本说明书公开的抗原结合分子的fc结构域可以适合如下获得：通过将单克隆抗体等的抗体用胃蛋白酶等的蛋白质分解酶部分消化后，使片段吸附于蛋白a柱或者蛋白g柱后，用适当的洗脱缓冲液等使其洗脱。作为所述的蛋白质分解酶，只要是可以通过适当设定ph等的酶的反应条件来消化单克隆抗体等的抗体即可，没有特别的限定，例如，可以例示胃蛋白酶或无花果蛋白酶等。
[0462]
本说明书所记载的抗原结合分子在igg1、igg2、igg3或igg4的构成fc区的氨基酸中含有fcγ受体
‑
结合活性降低的fc区。
[0463]
抗体的同种型由恒定区的结构决定。igg1、igg2、igg3、igg4的各同种型的恒定区分别被称为cγ1、cγ2、cγ3、cγ4。构成人cγ1、cγ2、cγ3、cγ4的fc区的多肽的氨基酸序列例示为seq id no:23、24、25、26。构成各氨基酸序列的氨基酸残基和kabat的eu编号(在本说明书中也被称为eu索引)之间的关系显示于图12中。
[0464]
fc结构域是指包含两条轻链和两条重链的除外f(ab')2的区，所述两条重链包含
ch1结构域和ch1和ch2结构域之间的区域的恒定区的一部分以使链间的二硫键在两条重链间形成。构成本说明书中公开的抗原结合分子的fc结构域可以适合如下获得：通过将igg1、igg2、igg3、igg4单克隆抗体等用胃蛋白酶等的蛋白质分解酶部分消化后，将吸附于蛋白a柱上的组分进再洗脱。作为所述的蛋白质分解酶，只要是可以通过适当设定ph等的酶的反应条件来消化全长抗体有选择性地生成f(ab')2即可，没有特别的限定，例如，可以例示胃蛋白酶或无花果蛋白酶等。
[0465]
fcγ受体
[0466]
fcγ受体是指可以结合于igg1、igg2、igg3、igg4单克隆抗体的fc区的受体，实质上也指fcγ受体基因所编码的蛋白质的家族的所有成员。对人而言，该家族中含有：包含亚型fcγria、fcγrib和fcγric的fcγri(cd64)；包含亚型fcγriia(包含异型h131和r131)、fcγriib(包含fcγriib
‑
1和fcγriib
‑
2)和fcγriic的fcγrii(cd32)；和包含亚型fcγriiia(包含异型v158和f158)和fcγriiib(包含异型fcγriiib
‑
na1和fcγriiib
‑
na2)的fcγriii(cd16)、以及也包含所有未发现的人fcγr类或fcγr亚型或异型。然而，fcγ受体不限于这些。fcγr含有人、小鼠、大鼠、兔和猴，但不限于这些。fcγr可以由来于任何生物。对小鼠fcγr类而言，也含有fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii(cd16)和fcγriii
‑
2(cd16
‑
2)、以及所有未发现的小鼠fcγr类或fcγr亚型或异型，但不限于这些。作为这样的fcγ受体的适合的例子，可以举出：人fcγri(cd64)、fcγriia(cd32)、fcγriib(cd32)、fcγriiia(cd16)和/或fcγriiib(cd16)。fcγri的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于seq id no:27(nm_000566.3)和28(np_000557.1)中、fcγriia的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于seq id no:29(bc020823.1)和30(aah20823.1)中、fcγriib的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于seq id no:31(bc146678.1)和32(aai46679.1)中、fcγriiia的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于seq id no:33(bc033678.1)和34(aah33678.1)中、以及fcγriiib的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于seq id no:35(bc128562.1)和36(aai28563.1)中(括号内表示refseq登记号)。fcγ受体在igg1、igg2、igg3、igg4单克隆抗体的fc区是否具有结合活性可以通过上述所记载的facs或elisa格式、以及利用alpha筛选(amplified luminescent proximity homogeneous assay)或基于表面等离子共振(spr)的biacore法等来确认(proc.natl.acad.sci.usa(2006)103(11),4005
‑
4010)。
[0467]
另外，“fc配体”或“效应配体”是指结合于抗体的fc区形成fc/fc配体复合物的、由来于任意生物的分子，优选为多肽。fc配体与fc的结合优选诱发一个或其以上的效应机能。fc配体包含fc受体、fcγr、fcαr、fcεr、fcrn、c1q、c3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌的蛋白a、葡萄球菌的蛋白质g和病毒的fcγr，但不限于这些。fc配体还包含与fcγr同种的为fc受体家族的fc受体同系物(fcrh)(davis等,(2002)immunological reviews 190,123
‑
136)。fc配体还可以包含结合于fc的未发现的分子。
[0468]
fcγ受体
‑
结合活性
[0469]
fc区对fcγi、fcγiia、fcγiib、fcγiiia和/或fcγiiib中任一个的fcγ受体
‑
结合活性降低，这一点可以通过上述所记载的facs或elisa格式、以及利用alpha筛选(amplified luminescent proximity homogeneous assay)或基于表面等离子共振(spr)的biacore法等来确认(proc.natl.acad.sci.usa(2006)103(11),4005
‑
4010)。
[0470]
alpha筛选通过使用供体和受体的两个珠的alpha技术，基于下述原理进行实施。结合于供体珠的分子与结合于受体珠的分子生物学上相互作用，仅在两个珠接近的状态时，检测到发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周边的氧气变换为激发状态的单态氧。单态氧向供体珠周边扩散，当到达接近的受体珠时引起珠内的化学发光反应，最终放出光。结合于供体珠的分子与结合于受体珠的分子不相互作用时，供体珠产生的单态氧不到达受体珠，因此不引起化学发光反应。
[0471]
例如，使生物素标记的抗原结合分子结合在供体珠上，使用谷胱甘肽s转移酶(gst)进行标签化的fcγ受体结合在受体珠上。在具有竞争的突变fc区的抗原结合分子的非存在下，具有野生型fc区的抗原结合分子与fcγ受体相互作用，产生520
‑
620nm的信号。具有非标签化的突变fc区的抗原结合分子和具有野生型fc区的抗原结合分子竞争与fcγ受体间的相互作用。通过定量竞争的结果出现的荧光的减少，可以决定相对的结合亲和力。将抗体等的抗原结合分子使用sulfo
‑
nhs
‑
生物素等进行生物素化是公知的。作为将fcγ受体用gst进行标签化的方法，可以适当采用以下方法：将编码fcγ受体的多核苷酸和编码gst的多核苷酸符合读框的融合，使所得融合基因在持有表达可能的载体的细胞等中表达，使用谷胱甘肽柱进行纯化的方法等。所得信号适合通过使用例如graphpad prism(graphpad；san diego)等的软件使其适应于利用非线性回归分析的单位点竞争(one
‑
site competition)模型来进行分析。
[0472]
若将观察相互作用的物质的一方(配体)固定于传感器芯片的金薄膜上，从传感器芯片的背侧照射光使其在金薄膜和玻璃的界面得以全反射，则在反射光的一部分形成反射强度降低的部分(spr信号)。若将观察相互作用的物质的另一方(分析物)流至传感器芯片的表面，使配体与分析物相结合，则得以固定的配体分子的质量增加，传感器芯片表面的溶剂的折射率发生变化。由于该折射率的变化，spr信号的位置发生移动(相反，若结合解离，则信号的位置还原)。biacore系统将上述的移动的量、即在传感器芯片表面的质量变化作为纵轴，将质量的时间变化作为测定数据来表示(传感图)。由传感图的曲线求得动力学参数(结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd))，由该两个常数之比求得亲和力(kd)。在biacore法中也适合使用抑制测定法。抑制测定法的例子记载于proc.natl.acad.sci.usa(2006)103(11),4005
‑
4010中。
[0473]
在本说明书中，“fcγ受体
‑
结合活性降低”是指，例如，基于上述的分析方法，与作为对照的抗原结合分子的竞争活性相比较，测试抗原结合分子的竞争活性显示50％以下、优选45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、15％以下、特别优选10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下的结合活性。
[0474]
作为对照的抗原结合分子，可以适当利用具有igg1、igg2、igg3或igg4单克隆抗体的fc区的抗原结合分子。该fc区的结构记载于seq id no:37(在refseq登记号aac82527.1的n末端附加a)、38(在refseq登记号aab59393.1的n末端附加a)、25(在refseq登记号caa27268.1的n末端附加a)、39(在refseq登记号aab59394.1的n末端附加a)。另外，将具有某特定的同种型的抗体的fc区的突变体的抗原结合分子作为测试物质使用的情况下，通过将具有该特定的同种型的抗体的fc区的抗原结合分子作为对照使用，验证该突变体所具有的突变对fcγ受体
‑
结合活性的效果。如上所述，可以适当制作fcγ受体
‑
结合活性降低得
以验证的具有fc区突变体的抗原结合分子。
[0475]
作为这样的突变体的例子，氨基酸即231a
‑
238s(按照eu编号)缺失突变体(wo 2009/011941)、以及突变体c226s,c229s,p238s,(c220s)(j.rheumatol(2007)34,11)、c226s和c229s(hum.antibod.hybridomas(1990)1(1),47
‑
54)、c226s,c229s,e233p,l234v和l235a(blood(2007)109,1185
‑
1192)等的突变体为公知的。
[0476]
即，适合举出：在构成特定的同种型抗体的fc区的氨基酸中，具有特定的下述任一种氨基酸：220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、或332位(按照eu编号)被取代的fc区的抗原结合分子。作为fc区起源的抗体的同种型没有特别限定，可以适当利用以igg1、igg2、igg3或igg4单克隆抗体为起源的fc区，但适合利用以igg1抗体为起源的fc区。
[0477]
例如，也可以适当使用：在构成igg1抗体的fc区的氨基酸中，具有施行了按照eu编号特定的下述任意取代(每个数字表示按照eu编号特定的氨基酸残基的位置；位于数字前的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基；位于数字后的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基)的fc区：
[0478]
(a)l234f、l235e、p331s；
[0479]
(b)c226s、c229s、p238s；
[0480]
(c)c226s、c229s；
[0481]
(d)c226s、c229s、e233p、l234v、l235a；
[0482]
(e)l234a、l235a或l235r、n297a；
[0483]
(f)l235a或l235r、s239k、n297a，
[0484]
以及缺失231位～238位的氨基酸序列的fc区的抗原结合分子。
[0485]
另外，优选的抗原结合分子还包括：在构成igg2抗体的fc区的氨基酸中，具有施行了按照eu编号特定的下述取代中任一个的fc区的抗原结合分子：
[0486]
(g)h268q、v309l、a330s和p331s；
[0487]
(h)v234a；
[0488]
(i)g237a；
[0489]
(j)v234a和g237a；
[0490]
(k)a235e和g237a；
[0491]
(l)v234a、a235e和g237a。每个数字表示按照eu编号特定的氨基酸残基的位置；位于数字前的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基；位于数字后的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基。
[0492]
另外，优选的抗原结合分子还包括：在构成igg3抗体的fc区的氨基酸中，具有施行了按照eu编号特定的下述取代中任一个的fc区的抗原结合分子：
[0493]
(m)f241a；
[0494]
(n)d265a；
[0495]
(o)v264a。每个数字表示按照eu编号特定的氨基酸残基的位置；位于数字前的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基；位于数字后的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基。
[0496]
另外，也可以适当使用：在构成igg4抗体的fc区的氨基酸中，具有施行了按照eu编号特定的下述取代中任一个的fc区的抗原结合分子：
[0497]
(p)l235a、g237a和e318a；
[0498]
(q)l235e；
[0499]
(r)f234a和l235a。每个数字表示按照eu编号特定的氨基酸残基的位置；位于数字前的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基；位于数字后的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基。
[0500]
作为其他优选的例子，可以举出：在构成igg1抗体的fc区的氨基酸中，具有特定的下述任一种氨基酸：233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、331位(按照eu编号)被对应的igg2或igg4中其eu编号所对应的氨基酸取代的fc区的抗原结合分子。
[0501]
作为其他优选的例子，可以适合举出：在构成igg1抗体的fc区的氨基酸中，具有特定的下述任意一个或其以上的氨基酸：234位、235位、297位(按照eu编号)被其他氨基酸取代的fc区的抗原结合分子。对于取代后存在的氨基酸的种类没有特别的限定，但特别优选具有234位、235位、297位的任意一个或其以上的氨基酸被丙氨酸取代的fc区的抗原结合分子。
[0502]
作为其他优选的例子，可以适合举出：在构成igg1抗体的fc区的氨基酸中，具有特定的下述任一种氨基酸：265位(按照eu编号)被其他氨基酸取代的fc区的抗原结合分子。对于取代后存在的氨基酸的种类没有特别的限定，但特别优选具有265位的氨基酸被丙氨酸取代的fc区的抗原结合分子。
[0503]
多特异性抗原结合分子
[0504]
本发明的“多特异性抗原结合分子”的优选实施方案的实例包括多特异性抗体。当将具有减小的fcγ受体结合活性的fc区用作多特异性抗体fc区时，可以合适地使用来源于多特异性抗体的fc区。作为本发明的多特异性抗体，双特异性抗体是特别优选的。在此情况中，双特异性抗体是具有两种不同特异性的抗体。igg型双特异性抗体可以由杂交的杂交瘤(quadroma)分泌，所述杂交的杂交瘤通过将产生igg抗体的两种类型的杂交瘤融合制备(milstein等，nature(1983)305，537
‑
540)。
[0505]
此外，igg型双特异性抗体通过以下方式分泌：将构成两种目的类型的igg的l链和h链的基因(即，总计四种基因)引入到细胞中，并将其共表达。然而，通过这些方法可以产生的igg的h链和l链的组合的数目在理论上是十种组合。因此，难以从十种类型的igg中纯化包含所需的h链和l链的组合的igg。此外，理论上，具有所需组合的igg的分泌量将显著减小，并且因此将需要大规模培养，并且生产成本将进一步增加。
[0506]
因此，用于促进h链之间以及具有所需组合的l链和h链之间的结合的技术可以应用于本发明的多特异性抗原结合分子。
[0507]
例如，通过在抗体h链的第二恒定区或第三恒定区(ch2或ch3)的界面处引入静电排斥以抑制非所需的h链缔合的技术可以应用于多特异性抗体缔合(wo2006/106905)。
[0508]
在通过在ch2或ch3的界面处引入静电排斥以抑制非所需的h链缔合的技术中，在h链的其他恒定区的界面处接触的氨基酸残基的实例包括对应于ch3区中的eu编号位置356、439、357、370、399和409处的残基的区域。
[0509]
更具体地，实例包括包括这样的抗体，所述抗体包含两种类型的h
‑
链ch3区，其中
选自以下(1)至(3)中指示的氨基酸残基对的第一h链ch3区中的一至三对氨基酸残基带有相同类型的电荷：(1)包含在h链ch3区中在eu编号位置356和439处的氨基酸残基；(2)包含在h链ch3区中在eu编号位置357和370处的氨基酸残基；和(3)包含在h链ch3区中在eu编号位置399和409处的氨基酸残基。
[0510]
此外，所述抗体可以是这样的抗体，其中不同于上述第一h链ch3区的第二h链ch3区中的氨基酸残基对选自上述(1)至(3)的氨基酸残基对，其中对应于上述第一h链ch3区中的带有相同类型电荷的上述(1)至(3)的氨基酸残基对的一至三对氨基酸残基带有与上述第一h链ch3区中对应的氨基酸残基相反的电荷。
[0511]
以上(1)至(3)中指示的各氨基酸残基在缔合期间彼此接近。本领域技术人员可以通过同源性建模等使用可商购的软件找到所需的h链ch3区或h链恒定区中对应于上述(1)至(3)的氨基酸残基的位置，并且这些位置的氨基酸残基可以进行适当修饰。
[0512]
在上述抗体中，“带电荷的氨基酸残基”优选地选自例如以下各组之一中包括的氨基酸残基：
[0513]
(a)谷氨酸(e)和天冬氨酸(d)；和
[0514]
(b)赖氨酸(k)、精氨酸(r)和组氨酸(h)。
[0515]
在上述抗体中，短语“带有相同的电荷”表示，例如，两个以上的氨基酸残基都选自上述组(a)和(b)之一中包括的氨基酸残基。短语“带有相反的电荷”表示，例如，当两个以上的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基选自上述组(a)和(b)中的任一个中包括的氨基酸残基时，剩余的氨基酸残基选自其他组中包括的氨基酸残基。
[0516]
在优选的实施方案中，上述抗体可以具有通过二硫键交联的第一h链ch3区和第二h链ch3区。
[0517]
在本发明中，进行修饰的氨基酸残基不限于上述抗体可变区或抗体恒定区的氨基酸残基。本领域技术人员可以通过同源性建模等使用可商购的软件确定在突变体多肽或异源多聚体中形成界面的氨基酸残基；并且这些位置的氨基酸残基之后可以进行修饰以调节缔合。
[0518]
其他已知的技术也可以用于本发明的多特异性抗体的缔合。包含不同氨基酸的含fc区的多肽可以通过以下方式有效地彼此缔合：用较大的侧链(突出)取代抗体的h
‑
链fc区之一中存在的氨基酸侧链，并且用较小的侧链(孔)取代其他h链的相应fc区中存在的氨基酸侧链，从而允许将突出置于孔内(wo1996/027011；ridgway jb等，protein engineering(1996)9，617
‑
621；merchant a.m.等nature biotechnology(1998)16，677
‑
681；和us20130336973)。
[0519]
此外，其他已知的技术也可以用于形成本发明的多特异性抗体。具有不同序列的多肽的缔合可以通过以下方式有效地引起：使用通过将抗体的一个h链ch3的部分变成相应的来源于iga的序列产生的链互换改造的结构域ch3并且将相应的来源于iga的序列引入到另一条h链ch3的互补部分的ch3的互补缔合(protein engineering design&selection，23；195
‑
202，2010)。该已知的技术也可用于有效地形成目的多特异性抗体。
[0520]
此外，如wo 2011/028952、wo2014/018572和nat biotechnol.2014 feb；32(2):191
‑
8中所述的利用抗体ch1和cl的缔合和vh和vl的缔合的抗体制备技术；如wo2008/119353和wo2011/131746中所述的组合地利用分开制备的单克隆抗体来制备双特异性抗体
的技术(fab臂交换)；如wo2012/058768和wo2013/063702中所述的调节抗体重链ch3之间的缔合的技术；如wo2012/023053中所述的制备由两种类型的轻链和一种类型的重链组成的双特异性抗体的技术；如christoph等(nature biotechnology vol.31，p 753
‑
758(2013))所述的使用分别表达包含单个h链和单个l链的抗体链之一的两种细菌细胞株制备双特异性抗体的技术；等等，可以用于多特异性抗体的形成。
[0521]
备选地，即使当不能有效形成目的多特异性抗体时，本发明的多特异性抗体也可以通过自制备的抗体分离和纯化目的多特异性抗体来获得。例如，已经报道了能够通过离子交换色谱法通过将氨基酸置换引入到两种类型的h链的可变区中以产生等电点差异纯化目的抗体的同源多聚和异源多聚形式的两种类型的方法(wo2007114325)。目前，作为纯化异源多聚抗体的方法，已经报道了使用a蛋白来纯化包含结合a蛋白的小鼠igg2a h链和不结合a蛋白的大鼠igg2b h链的异源二聚体抗体的方法(wo98050431和wo95033844)。此外，异源二聚体抗体本身可以通过以下方式被有效纯化：使用包含在作为igg
‑
a蛋白结合位点的eu编号位置435和436处的利用作为产生不同a蛋白亲和力的氨基酸的tyr、his等的氨基酸残基置换的h链，或使用根据参比例5的方法获得的具有不同a蛋白亲和力的h链，以改变各h链与a蛋白的相互作用，然后使用a蛋白柱。
[0522]
备选地，可以获得能够给多个不同h链提供结合能力的共有l链并将其用作多特异性抗体的共有l链。多特异性igg的有效表达可以通过将此种共有l链和多个不同h链的基因引入到细胞中以表达igg来实现(nature biotechnology(1998)16，677
‑
681)。当选择共有h链时，也可以使用用于选择对不同h链中的任一种显示强结合能力的共有l链的方法(wo 2004/065611)。
[0523]
此外，fc区c端异源性已被改善的的fc区可以被合适地用作本发明的fc区。更具体地，本发明提供通过以下方法制备的fc区：使如由eu编号指示的位置446处的甘氨酸和位置447处的赖氨酸从构成来源于igg1、igg2、igg3或igg4的fc区的两种多肽的氨基酸序列中缺失。
[0524]
这些技术中的多个(如两个以上的)可以组合使用。此外，这些技术可以合适地且分别地应用于要缔合的两条h链。此外，这些技术可以与上述对fcγ受体具有减小的结合活性的fc区组合使用。此外，基于进行上述修饰的抗原结合分子，本发明的抗原结合分子可以是分开制备的分子，以致其具有相同的氨基酸序列。
[0525]
合适的本发明的多特异性抗原结合分子包含：
[0526]
(1)包含具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区的结构域；
[0527]
(2)包含具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域；和
[0528]
(3)包含上述具有减小的fcγ受体结合活性的fc区的结构域，其结构没有限制。
[0529]
在本发明中，上述各结构域可以直接通过肽键连接。例如，当使用f(ab’)2作为(1)和(2)的包含抗体可变区的结构域，并且使用这些fc区作为(3)的包含具有减小的fcγ受体结合活性的fc区的结构域时，通过肽键连接(1)和(2)的含抗体可变区的结构域和(3)的含fc区的结构域形成的多肽将形成抗体结构。此种抗体可以通过自上述杂交瘤培养基中纯化制备，并且也可以通过自稳定地带有编码构成抗体的多肽的多核苷酸的所需的宿主细胞的培养基中纯化抗体而制备。
[0530]
含在具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区中的本发明优选的抗体h链可
变区的实例包括表1的抗体h链可变区，或具有cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列与表1的h链可变区中含有的cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列相同的cdr序列的抗体h链可变区，或与上述可变区功能等效的抗体h链可变区。
[0531]
表1
[0532][0533]
本发明优选的具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的实例包括具有t细胞受体结合活性的抗体可变区。在t细胞受体中，cd3是优选的，并且cd3ε是特别优选的。含在此种抗体可变区中的抗体h链可变区的实例包括表2中的抗体h链可变区，具有cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列与表2的抗体h链可变区中含有的cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列相同的cdr序列的抗体h链可变区，以及与上述可变区功能等效的抗体h链可变区。
[0534]
表2
[0535][0536]
构成抗体h链氨基酸序列的氨基酸残基的cdr区与kabat编号之间的关系显示在图13中。
[0537]
对于本发明的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区和具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区中含有的抗体l链可变区，优选的是获得可以给具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的h链提供结合活性并且可以给具有t细胞受体复合物的h链提供结合活性的共有l链，并且将此用作多特异性抗原结合分子的共有l链可变区。
[0538]
本发明中使用的共有l链可变区的实例包括表3的l链可变区，具有cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列与表3的抗体l链可变区中含有的cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列相同的cdr序列的抗体l链可变区，以及与上述可变区功能等效的抗体l链可变区。
[0539]
表3
[0540][0541]
构成抗体l链氨基酸序列的氨基酸残基的cdr区与kabat编号之间的关系显示在图
14中。
[0542]
在本发明中，短语“功能等效”表示对抗原的结合亲和力是等效的，或备选地，该短语表示当将其用作多特异性抗原结合分子时，针对表达磷脂酰肌醇聚糖3的细胞或含有这些细胞的组织是等效的。结合亲和力和细胞毒性活性可以基于本文中的描述测量。用于测量细胞毒性活性的细胞可以是所需的表达gpc3的细胞或所需的含有这些细胞的组织，并且例如，可以使用作为表达gpc3的人癌细胞系的pc
‑
10或nci
‑
h446。关于抗体恒定区，该短语可以表示fcγ受体结合活性的降低是等效的。
[0543]
例如，与本文中描述的抗体h链可变区(即，原h链可变区)功能等效的抗体h链可变区表示当将其与同原h链成对的本文中描述的抗体l链可变区组合时该区域具有相同的结合亲和力，或备选地当被用于多特异性抗原结合分子时所述区域具有相同的对表达磷脂酰肌醇聚糖3的细胞或含有这些细胞的组织的细胞毒性活性。此外，与本文中所述的抗体l链可变区(即，原l链可变区)功能等效的抗体l链可变区表示当将其与同原l链成对的本文中描述的抗体h链可变区组合时该区域具有相同的结合亲和力，或备选地当被用于多特异性抗原结合分子时所述区域具有相同的对表达磷脂酰肌醇聚糖3的细胞或含有这些细胞的组织的细胞毒性活性。
[0544]
术语“等效”不一定表示相同的活性程度，并且活性可以被增强。具体地，对于抗原结合亲和力，实例包括这样的情况，其中通过与充当对照的抗体可变区的结合亲和力(亲本kd值)比较获得的值(kd值/亲本kd值)为1.5以下。kd值/亲本kd值的值优选为1.3以下，更优选为1.2以下、1.1以下、1.0以下、0.9以下、0.8以下、0.7以下、0.6以下或0.5以下。虽然没有下限，但实例包括10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5或10
‑6。更具体地，在本发明中，kd值/亲本kd值的值优选为10
‑6至1.5x10
‑0，更优选为10
‑6至10
‑1，甚至更优选为10
‑6至10
‑2，并且甚至更优选为10
‑6至10
‑3。对于细胞毒性活性，实例包括这样的情况，其中通过与充当对照的多特异性抗原结合分子的细胞生长抑制率(亲本细胞生长抑制率)比较获得的值(细胞生长抑制率/亲本细胞生长抑制率)为0.7以上。添加的多特异性抗原结合分子的浓度可以被合适地确定，但是优选为，例如，0.01nm、0.05nm、0.1nm、0.5nm或1nm；并且优选地，在0.05nm或0.1nm进行测量。细胞生长抑制率/亲本细胞生长抑制率的值优选为0.8以上，更优选为0.9以上、1.0以上、1.2以上、1.5以上、2以上、3以上、5以上、10以上或20以上。虽然没有上限，但所述值可以为10、102、103、104、105或106。
[0545]
此外，对于细胞毒性活性，实例包括这样的情况，其中通过与50％细胞生长抑制所需的原多特异性抗原结合分子的浓度(50％细胞生长抑制所需的亲本浓度)比较获得的值(50％细胞生长抑制所需的浓度/50％细胞生长抑制所需的亲本浓度)为1.5以下。50％生长抑制浓度是指与未添加多特异性抗原结合分子时相比细胞增殖速率降低至一半所需的多特异性抗原结合分子的浓度。“50％细胞生长抑制所需的浓度/50％细胞生长抑制所需的亲本浓度”的值优选为1.3以下，更优选为1.2以下、1.1以下、1.0以下、0.9以下、0.8以下、0.7以下、0.6以下或0.5以下。虽然没有下限，但所述值可以例如为10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5或10
‑6。具体地，所述值优选为10
‑6至1.5x10
‑0，更优选为10
‑6至10
‑1，甚至更优选为10
‑6至10
‑2，并且甚至更优选为10
‑6至10
‑3。
[0546]
关于包含具有gpc3结合活性的抗体可变区的结构域，对gpc3(例如，人gpc3)的kd值可以为，例如，5x10
‑9m以下，优选地4x10
‑9m以下，如3x10
‑9m以下、2x10
‑9m以下、1x10
‑9m以
下、8x10
‑
10
m以下、5x10
‑
10
m以下、4x10
‑
10
m以下、3x10
‑
10
m以下、2x10
‑
10
m以下、1x10
‑
10
m以下、8x10
‑
11
m以下、5x10
‑
11
m以下、4x10
‑
11
m以下、3x10
‑
11
m以下、2x10
‑
11
m以下、1x10
‑
11
m以下、8x10
‑
12
m以下、5x10
‑
12
m以下、4x10
‑
12
m以下、3x10
‑
12
m以下、2x10
‑
12
m以下、1x10
‑
12
m以下、8x10
‑
13
m以下、5x10
‑
13
m以下、4x10
‑
13
m以下、3x10
‑
13
m以下、2x10
‑
13
m以下或1x10
‑
13
m以下。
[0547]
关于包含具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域，对人t细胞受体复合物如人t细胞受体，或更具体地例如人cd3ε的kd值可以为，例如，2x10
‑7m以下，优选地1.5x10
‑7m以下，如1.4x10
‑7m以下、1.3x10
‑7m以下、1.2x10
‑7m以下、1x10
‑7m以下、3x10
‑8m以下、2x10
‑8m以下、1x10
‑8m以下、8x10
‑9m以下、5x10
‑9m以下、4x10
‑9m以下、3x10
‑9m以下、2x10
‑9m以下、1x10
‑9m以下、8x10
‑
10
m以下、5x10
‑
10
m以下、4x10
‑
10
m以下、3x10
‑
10
m以下、2x10
‑
10
m以下、1x10
‑
10
m以下、8x10
‑
11
m以下、5x10
‑
11
m以下、4x10
‑
11
m以下、3x10
‑
11
m以下、2x10
‑
11
m以下、1x10
‑
11
m以下、8x10
‑
12
m以下、5x10
‑
12
m以下、4x10
‑
12
m以下、3x10
‑
12
m以下、2x10
‑
12
m以下或1x10
‑
12
m以下。
[0548]
本发明的多特异性抗原结合分子具有的对人gpc3和人t细胞受体复合物(例如，人cd3ε链)的kd值优选分别为5x10
‑9m以下和2x10
‑7m以下，并且更优选分别为1x10
‑9m以下和5x10
‑8m以下。
[0549]
在本发明中，“功能等效的”抗体可变区不受特别限制，只要其是满足上述条件的抗体h
‑
链和/或抗体l链可变区即可。此种抗体可变区的实例包括通过将一个以上氨基酸(例如，1、2、3、4、5或10个氨基酸)的置换、缺失、添加和/或插入引入到上述表1至3的可变区的氨基酸序列中产生的区域。本领域技术人员熟知的用于将一个以上氨基酸置换、缺失、添加和/或插入引入到氨基酸序列中的方法是将突变引入蛋白质中的方法。例如，本领域技术人员可以通过使用方法如定点诱变合适地将突变引入到氨基酸序列中制备与具有上述功能的抗体可变区功能等效的可变区(hashimoto
‑
gotoh,t.,mizuno,t.,ogasahara,y.和nakagawa,m.(1995)an oligodeoxyribonucleotide
‑
directed dual amber method for site
‑
directed mutagenesis(用于定点诱变的寡脱氧核糖核酸定向的双琥珀法).gene 152,271
‑
275；zoller,m.j.和smith,m.(1983)oligonucleotide
‑
directed mutagenesis of dnafragments cloned into m13 vectors(克隆到m13载体中的dna片段的寡核苷酸定向诱变).methods enzymol.100,468
‑
500；kramer,w.,drutsa,v.,jansen,h.w.,kramer,b.,pflugfelder,m.和fritz,h.j.(1984)the gapped duplex dnaapproach to oligonucleotide
‑
directed mutation construction(用于寡核苷酸定向突变构建的空隙双dna法).nucleic acids res.12,9441
‑
9456；kramer,w.和fritz,h.j.(1987)oligonucleotide
‑
directed construction of mutations via gapped duplex dnamethods(经由空隙双dna法的寡核苷酸定向突变构建).enzymol.154,350
‑
367；以及kunkel,t.a.(1985)rapid and efficient site
‑
specific mutagenesis without phenotypic selection(无表型选择的快速有效定点诱变).proc natl acad.sci.u s a.82,488
‑
492)。
[0550]
当氨基酸残基被改变时，氨基酸优选被突变成保留氨基酸侧链性质的不同的氨基酸。氨基酸侧链性质的实例有：疏水性氨基酸(a、i、l、m、f、p、w、y和v)、亲水性氨基酸(r、d、n、c、e、q、g、h、k、s和t)、含脂肪族侧链的氨基酸(g、a、v、l、i和p)、含有含羟基侧链的氨基酸(s、t和y)、含有含硫原子侧链的氨基酸(c和m)、含有含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(d、n、e和
q)、含碱性侧链的氨基酸(r、k和h)以及含芳香性侧链的氨基酸(h、f、y和w)(括号中氨基酸由单字母编码表示)。这些组中的每个内的氨基酸置换被称为保守性置换。已知的是，含有修饰的氨基酸序列(其中给定氨基酸序列中的一个以上氨基酸残基被缺失、添加和/或置换成其他氨基酸)的多肽可以保持原生物学活性(mark,d.f.等,proc.natl.acad.sci.usa；(1984)81:5662
‑
6；zoller,m.j.和smith,m.,nucleic acids res.(1982)10:6487
‑
500；wang,a.等,science(1984)224:1431
‑
3；dalbadie
‑
mcfarland,g.等,proc.natl.acad.sci.usa(1982)79:6409
‑
13)。含此种氨基酸修饰的本发明的可变区的氨基酸序列与修饰前的可变区的cdr序列、fr序列或整个可变区的氨基酸序列具有至少70％，更优选地至少75％，甚至更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，并且最优选地至少95％的同一性。本文中，序列同一性被定义为序列比对后确定的与原h链可变区或l链可变区的氨基酸序列中的残基相同的残基的百分比，并且当需要时适当地引入空隙以最大化序列同一性。氨基酸序列的同一性可以通过下述方法确定。
[0551]
此外，“功能等效的抗体可变区”可以例如获得自在严格条件下与包含编码上述表1至3中的可变区的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸杂交的核酸。用于分离在严格条件下与包含编码可变区的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸杂交的核酸的严格杂交条件包括，例如，6m尿素，0.4％sds，0.5xssc和37℃的条件，或与其严格等效的杂交条件。在更严格的条件(例如，6m尿素，0.4％sds，0.1x ssc和42℃的条件)下，预期可以分离具有更高同源性的核酸。杂交后的洗涤条件为，例如，在60℃使用0.5x ssc(1xssc是0.15m nacl和0.015m柠檬酸钠ph7.0)和0.1％sds的洗涤，更优选为在60℃使用0.2x ssc和0.1％sds的洗涤，甚至更优选为在62℃使用0.2x ssc和0.1％sds的洗涤，甚至更优选为在65℃使用0.2x ssc和0.1％sds的洗涤，并且更优选为在65℃使用0.1x ssc和0.1％sds的洗涤。分离的核酸的序列可以通过下述的已知方法确定。分离的核酸的整体核苷酸序列同源性为至少50％以上，优选地70％以上，并且更优选为90％以上(例如，95％、96％、97％、98％、99％以上)序列同一性。
[0552]
在严格条件下与包含编码可变区的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸杂交的核酸也可以通过使用杂交技术、基因扩增方法如利用基于编码可变区氨基酸序列的核苷酸序列的信息合成的引物的聚合酶链反应(pcr)代替上述方法来分离。
[0553]
一个核苷酸序列或氨基酸序列与另一个核苷酸序列或氨基酸序列的同一性可以使用karlin和altschul(proc.natl.acad.sci.usa(1993)90:5873
‑
7)的算法blast确定。基于该算法开发出了被称为blastn和blastx的程序(altschul等,j.mol.biol.(1990)215:403
‑
10)。为了根据基于blast的blastn分析核苷酸序列，将参数设定为，例如，得分＝100和字词宽度＝12。另一方面，用于通过基于blast的blastx分析氨基酸序列的参数包括，例如，得分＝50和字词宽度＝3。当使用blast和gapped blast程序时使用各程序的缺省参数。用于此种分析的具体技术是本领域中已知的(参见national center for biotechnology information(ncbi)的网站，basic local alignment search tool(blast)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
[0554]
如包含在本发明的多特异性抗原结合分子中的具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区和具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的组合不受特别限制只要其具有上述活性即可。然而，在本发明中，多特异性抗原结合分子的细胞毒性活性优选为等于或
大于实施例3中所述的双特异性抗体gpc3_ery22_rce115的细胞毒性活性。此处，术语“等效的”不一定表示与上述相同程度的活性，并且活性可以被增强。与gpc3_ery22_rce115等效是，例如，当相对于gpc3_ery22_rce115的细胞生长抑制率(细胞生长抑制率(gpc3_ery22_rce115))的值(细胞生长抑制率/细胞生长抑制率(gpc3_ery22_rce115))为0.7以上，优选地0.8以上、0.9以上、1.0以上、1.2以上、1.5以上、2以上、3以上、5以上、10以上或20以上。虽然没有上限，所述值可以为，例如，10、102、103、104、105或106。添加的多特异性抗原结合分子的浓度可以适当地确定，但是优选为，例如，0.01nm、0.05nm、0.1nm、0.5nm或1nm；并且优选地，在0.05nm或0.1nm进行测量。
[0555]
此外，实例包括以下的情况，其中通过与gpc3_ery22_rce115细胞的50％生长抑制浓度(50％细胞生长抑制浓度(gpc3_ery22_rce115))比较获得的值(50％细胞生长抑制浓度/50％细胞生长抑制浓度(gpc3_ery22_rce115))为1.5以下。“50％细胞生长抑制浓度/50％细胞生长抑制浓度(gpc3_ery22_rce115)”的值优选为1.3以下，更优选为1.2以下、1.1以下、1.0以下、0.9以下、0.8以下、0.7以下、0.6以下或0.5以下。虽然没有下限，但所述值可以为例如，10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5或10
‑6。具体地，所述值优选为10
‑6至1.5x10
‑0，更优选为10
‑6至10
‑1，甚至更优选为10
‑6至10
‑2，并且甚至更优选为10
‑6至10
‑3。
[0556]
对于人gpc3和人t细胞受体复合物(例如，人cd3ε链)，优选的具体kd值也是如上所述的。显示gpc3表达的理想细胞或包含这些细胞的理想组织可以用于所述细胞，并且例如，可以使用作为表达gpc3的人癌细胞系的pc
‑
10或nci
‑
h446。
[0557]
具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区和具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的此种组合的实例包括表4中所示的抗体h链可变区的组合，cdr序列的cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列与表4的抗体h链可变区所带有的cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列相同的抗体h链可变区的组合，以及与这些可变区功能等效的抗体h链可变区的组合。此处，“功能等效”具有与上述相同的含义。
[0558]
表4
[0559]
gpc3侧/t细胞受体复合物侧seq id no：h0000/hce115ha40/52h0000/ce115ha25140/500h0000/ce115ha23640/429h0000/tr01h00240/421h0000/ce115ha12240/426h0610/rce115h215/424h0610/tr01h040215/103h0610/tr01h061215/122h0610/tr01h068215/129h0610/tr01h071215/132gch054/tr01h067197/128gch094/tr01h082211/142gch094/tr01h084211/144gch065/tr01h084206/144
gch065/tr01h082206/142gch094/tr01h109211/164gch065/tr01h109206/164gch094/tr01h113211/168gch065/tr01h113206/168
[0560]
用于具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区和具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的此种组合的优选的共有l链包括，例如，l0000、l0011、l0201、l0203、l0204、l0206、l0208、l0209、l0211、l0212、l0222，以及具有的cdr序列(cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列)与以上共有l链中的cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列相同的共有l链。具体组合包括，例如，表5中所示的抗体h链可变区和共有l链的组合，具有的cdr序列(cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列)与表5的抗体可变区和共有l链所带有的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列相同的抗体可变区的组合，以及与这些可变区功能等效的抗体h链可变区和共有l链的组合。此处，“功能等效”具有与上述相同的含义。
[0561]
表5
[0562]
gpc3侧/t细胞受体复合物侧/共有l链seq id no：h0610/rce115h/l0000215/424/53h0610/tr01h040/l0000215/103/53h0610/tr01h040/l0201215/103/299h0610/tr01h040/l0203215/103/301h0610/tr01h040/l0204215/103/302h0610/tr01h040/l0206215/103/304h0610/tr01h040/l0208215/103/306h0610/tr01h040/l0209215/103/307h0610/tr01h040/l0211215/103/309h0610/tr01h061/l0000215/122/53h0610/tr01h068/l0000215/129/53h0610/tr01h071/l0000215/132/53gch054/tr01h067/l0201197/128/299gch054/tr01h067/l0212197/128/310gch054/tr01h067/l0222197/128/319gch054/tr01h067/l0000197/128/53gch094/tr01h082/l0201211/142/299gch094/tr01h082/l0011211/142/223gch094/tr01h084/l0011211/144/223gch065/tr01h084/l0011206/144/223gch065/tr01h082/l0011206/142/223gch094/tr01h109/l0011211/164/223gch065/tr01h109/l0011206/164/223gch094/tr01h113/l0011211/168/223
gch065/tr01h113/l0011206/168/223
[0563]
包含在本发明的多特异性抗原结合分子中的fc区不受特别限制，只要其是具有减弱的fcγ受体结合活性的fc区即可，但是本发明的fc区的优选实例包括e22hh的fc区部分和e22hk的fc区部分的组合，e2702gsksc的fc区部分和e2704sepsc的fc区部分的组合，以及e2702sksc的fc区部分和e2704sepsc的fc区部分的组合。
[0564]
本发明的多特异性抗原结合分子的优选实例包括具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区和具有cd3ε结合活性的抗体可变区的双特异性抗体。更优选地，细胞毒性活性等于或大于gpc3_ery22_rce115双特异性抗体的细胞毒性活性。此种双特异性抗体的实例包括包含表13中所述的h和l链的双特异性抗体，以及结合与以上抗体所结合的表位重叠的表位并且含有具有减小的fcγ受体结合活性的fc区的双特异性抗体。
[0565]
抗体是否识别与另一个抗体所识别的表位重叠的表位可以通过两个针对所述表位的抗体之间的竞争来确认。抗体之间的竞争可以通过竞争性结合测定使用手段如酶联免疫吸附测定(elisa)、荧光能量转移法(fret)和荧光计微体积测定技术(fmat(注册商标))来评估。与抗原结合的抗体的量与竞争性结合重叠的表位的候选竞争性抗体(测试抗体)的结合能力间接相关。换言之，当测试抗体的量或针对重叠的表位的亲和力增加时，与抗原结合的抗体的量减少，并且与抗原结合的测试抗体的量增加。具体地，将适当标记的抗体和待评估的抗体同时添加至抗原，并且使用所述标记检测因此结合的抗体。与抗原结合的抗体的量可以容易地通过预先标记抗体来确定。该标记不受特别限制，并且可以根据使用的测定技术来选择标记方法。具体地，标记方法包括荧光标记、放射性标记、酶标记等。
[0566]
例如，荧光标记的抗体和未标记的抗体或测试抗体被同时添加至固定有gpc3或cd3ε的小珠，并且通过荧光计微体积测定技术来检测标记的抗体。
[0567]
本文中，“结合重叠的表位的抗体”是指在使结合的标记的抗体的量减少50％的未标记的抗体的浓度(ic
50
)的通常100倍，优选地80倍，更优选地50倍，甚至更优选地30倍，并且更优选地10倍的浓度，使结合的标记的抗体的量下降至少50％的测试抗体。
[0568]
具有结合与上述抗体所结合的表位重叠的表位的抗体的抗原结合位点的多特异性抗原结合分子可以产生优异的细胞毒性活性。
[0569]
本发明的多特异性抗原结合分子通过与上述用于制备重组抗体的技术相同的技术制备。
[0570]
本发明还涉及编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸，并且其可以被插入到任意表达载体中。合适的宿主可以被转化以所述表达载体从而产生表达抗原结合分子的细胞。所述多核苷酸编码的抗原结合分子可以通过培养表达所述抗原结合分子的细胞，并且自培养物上清收集表达产物来获得。即，本发明涉及包含编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸的载体，带有此种载体的细胞，以及用于制备所述抗原结合分子的方法，所述方法包括培养所述细胞并自培养物上清收集抗原结合分子。这些可以通过与上述用于重组抗体的那些技术类似的技术获得。
[0571]
药物组合物
[0572]
从另一个角度，本发明提供包含作为活性成分的多特异性抗原结合分子的药物组合物，所述多特异性抗原结合分子包含：(1)包含具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区的结构域，(2)包含具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域，和(3)包含
具有减小的对fcγ受体的结合活性的fc区的结构域。此外，本发明涉及引起细胞损伤的药物组合物，所述药物组合物包含所述抗原结合分子作为活性成分。引起所述细胞损伤特别是t细胞依赖性细胞毒性的本发明的药物组合物优选被施用于患有需要预防或治疗所述活性的疾病的对象，或所述疾病可能复发的对象。
[0573]
此外，在本发明中，包含多特异性抗原结合分子作为活性成分的细胞毒性引发剂和细胞生长抑制剂可以呈现为用于引起细胞损伤的方法，所述方法包括向对象施用所述抗原结合分子的步骤，或其可以呈现为所述抗原结合分子在制备细胞毒性引发剂和细胞生长抑制剂中的用途，所述多特异性抗原结合分子包含：
[0574]
(1)包含具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区的结构域，
[0575]
(2)包含具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域，和
[0576]
(3)包含具有减小的对fcγ受体的结合活性的fc区的结构域。
[0577]
在本发明中，“包含多特异性抗原结合分子作为活性成分，所述多特异性抗原结合分子包含(1)包含具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区的结构域，(2)包含具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域，和(3)包含具有减小的对fcγ受体的结合活性的fc区的结构域”表示包含所述抗原结合分子作为主要活性组分，其中对所述抗原结合分子的含量比没有限制。
[0578]
如果需要，本发明的多特异性抗原结合分子可以被包封在微胶囊(例如，由羟甲基纤维素、明胶和聚(甲基丙烯酸甲酯)制成的微胶囊)中，或被结合成胶状药物递送系统(例如，脂质体、清蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)的组分(参见，例如，“remington’s pharmaceutical science第16版”,oslo ed.(1980))。用于将药剂制成受控释放药剂的方法也是已知的，并且此种方法可以应用于本发明的多特异性抗原结合分子(j.biomed.mater.res.(1981)15:267
‑
277；chemtech.(1982)12:98
‑
105；美国专利号3,773,719；欧洲专利申请公布号ep 58,481和ep 133,988；biopolymers(1983)22:547
‑
556)。
[0579]
本发明的药物组合物或细胞毒性引发剂和细胞生长抑制剂可以通过口服或肠胃外给药施用给患者，并且肠胃外给药是优选的。给药方法的具体实例包括注射给药、经鼻给药、经肺给药和经皮给药。注射给药的实例包括静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射和皮下注射。本发明的药物组合物或细胞毒性引发剂和细胞生长抑制剂可以全身或局部施用，例如，通过注射给药。可以根据患者的年龄和症状适当地选择给药方法。对于单次给药，可以自0.0001mg至1000mg/公斤体重的范围选择剂量。备选地，例如，所述剂量可以选自0.001mg/身体至100000mg/身体/患者的范围。然而，本发明的药物组合物或细胞毒性引发剂和细胞生长抑制剂不限于这些剂量。
[0580]
本发明的药物组合物或细胞毒性引发剂和细胞生长抑制剂可以根据常规方法配制(例如，remington’s pharmaceutical science,最新版,mark publishing company,easton,u.s.a)，并且还可以含有药用载体和添加剂。实例包括，但不限于表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等张剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂和调味剂；并且可以合适地使用其他常用的载体。载体的具体实例包括轻质无水硅酸、乳糖、晶体纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、聚乙烯缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。
[0581]
本发明还提供用于损害表达磷脂酰肌醇聚糖3抗原的细胞或含表达所述抗原的细胞的肿瘤组织的方法，或用于抑制这些细胞或肿瘤组织生长的方法，所述方法是通过将表达磷脂酰肌醇聚糖3抗原的细胞与结合所述抗原的本发明的多特异性抗原结合分子接触。结合所述抗原的多特异性抗原结合分子是如以上对于包含在本发明的细胞毒性引发剂和细胞生长抑制剂中的结合所述抗原的本发明的抗原结合分子所述的。结合所述抗原的本发明的多特异性抗原结合分子所结合的细胞不受特别限制，只要其是表达所述抗原的细胞即可。
[0582]
在本发明中，例如通过将结合所述抗原的本发明的多特异性抗原结合分子添加至体外培养的表达gpc3抗原的细胞的培养基中来进行“接触”。在此情况中，通过冻干等获得的液体或固体可以被合适地用作添加的抗原结合分子的形式。当作为水溶液添加时，其可以是简单地仅含有本发明的多特异性抗原结合分子的水溶液，或其可以是还含有，例如，上述表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等张剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂和调味剂的溶液。进行添加的浓度不受特别限制，但是培养溶液中合适的终浓度优选为1pg/ml至1g/ml，更优选为1ng/ml至1mg/ml，并且甚至更优选为1μg/ml至1mg/ml。
[0583]
此外，在另一个实施方案中，本发明的“接触”还通过将本发明的抗原结合分子施用于体内移植有表达gpc3抗原的细胞的非人动物，以及带有固有表达所述抗原的细胞的动物来进行。给药方法可以是口服或肠胃外的，并且肠胃外给药是特别优选的。给药方法的具体实例包括注射给药、经鼻给药、经肺给药和经皮给药。注射给药的实例包括静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射和皮下注射。本发明的药物组合物或细胞毒性引发剂和细胞生长抑制剂可以全身或局部施用，例如，通过注射给药。可以根据测试动物的年龄和症状适当地选择给药方法。当作为水溶液给药时，可以使用仅简单地含有本发明的多特异性抗原结合分子的水溶液，或可以使用还含有上述表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等张剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂和调味剂等的溶液。对于单次给药，可以自0.0001mg至1000mg/公斤体重的范围选择剂量。备选地，例如，所述剂量可以选自0.001mg/身体至100000mg/身体/患者的范围。然而，施用的本发明的多特异性抗原结合分子的量不限于这些剂量。
[0584]
以下方法被合适地用作用于评估或测量作为将表达磷脂酰肌醇聚糖3抗原的细胞与本发明的多特异性抗原结合分子接触的结果、构成抗原结合分子的包含具有磷脂酰肌醇聚糖3结合活性的抗体可变区的结构域结合的所述细胞中引起的细胞损伤的方法。用于体外评估或测量细胞毒性活性的方法的实例包括用于测量细胞毒性t细胞活性的方法等。本发明的多特异性抗原结合分子是否具有t细胞细胞毒性可以通过已知方法(例如，current protocols in immunology,第7章.immunologic studies in humans,编辑,john e.coligan等,john wiley&sons,inc.,(1993)等)测量。对于活性测量，结合不同于磷脂酰肌醇聚糖3的抗原(其是在用于检查的细胞中不表达的抗原)的抗原结合分子可以与本发明的多特异性抗原结合分子相同的方式用作对照，并且当与在将所述抗原结合分子用作对照时相比，本发明的多特异性抗原结合分子显示更强的细胞毒性活性时，可以确定存在活性。
[0585]
为了体外评估或测量细胞毒性活性，例如，将表达磷脂酰肌醇聚糖3抗原的细胞经皮内或皮下移植到非人测试动物中，然后自移植之日或第二天起每日或以数日为间隔静脉
内或腹膜内施用测试抗原结合分子。可以通过测量肿瘤大小和观察肿瘤大小变化的差异确定细胞毒性活性。以与体外评估类似的方式，当施用对照抗原结合分子显示进行本发明的抗原结合分子给药的组中的肿瘤大小显著小于进行对照抗原结合分子给药的组中的肿瘤大小时，可以确定存在本发明的抗原结合分子的细胞毒性活性。
[0586]
作为用于评估或测量对表达磷脂酰肌醇聚糖3抗原的细胞的增殖的抑制效果的方法，可以合适地使用测量同位素标记的胸苷到细胞中的吸收的方法或mtt法。作为用于体内评估或测量细胞增殖抑制活性的方法，可以合适地使用上述用于体内评估或测量细胞毒性活性的相同方法。
[0587]
本发明还提供用于本发明方法的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的多特异性抗原结合分子或通过本发明的制备方法制备的多特异性抗原结合分子。此外，所述试剂盒在其包装中可以包含药用载体、溶剂和描述使用方法的使用说明。
[0588]
本发明还涉及用于本发明的方法的本发明的多特异性抗原结合分子或通过本发明的制备方法制备的多特异性抗原结合分子。
[0589]
本发明还涉及具有gpc3结合活性的分子，所述分子含有包含本发明的多特异性抗原结合分子的具有gpc3结合活性的抗体可变区的结构域。此外，本发明涉及具有gpc3结合活性的分子，所述分子包含含在所述分子中的分别包含h和l链的三个cdr(总共六个cdr)的h和l链的抗体可变区。本发明还涉及具有t细胞受体复合物结合活性的分子，所述分子含有本发明的多特异性抗原结合分子的包含具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域。此外，本发明涉及具有t细胞受体复合物结合活性的分子，所述分子包含含在所述分子中的分别包含h和l链的三个cdr(总共六个cdr)的h和l链的抗体可变区。此种分子可以是抗体或包含抗体的抗原结合片段的多肽。本发明还涉及抗体，所述抗体结合与这些分子或包含其抗原结合片段的多肽重叠或竞争的表位。此种包含抗体的抗原结合片段的多肽的合适实例包括scfv、单链抗体、fv、单链fv 2(scfv2)、fab和f(ab’)2。此外，这些分子不一定是多特异性的(双特异性的)，并且可以仅结合gpc3或t细胞受体复合物(例如，cd3ε链)。
[0590]
这些分子包括包含本文实施例中所详细例示的多特异性抗原结合分子(其包含具有gpc3结合活性的h链可变区和共有l链可变区)的包含具有gpc结合活性的抗体可变区的结构域的分子，包含本文实施例中所例示的多特异性抗原结合分子(其包含具有t细胞受体复合物结合活性的h链可变区和共有l链可变区)的包含具有t细胞受体复合物结合活性的抗体可变区的结构域的分子，并且还包括这样的分子，所述分子具有与相同抗原性的蛋白质(gpc3或t细胞受体复合物)结合的活性，其包含含在以上分子中的h和l链中每个的三个cdr(总共六个cdr)。
[0591]
这些分子具有的cdr与本发明的多特异性抗原结合分子的cdr一样；并且因此，预期其结合与本发明的多特异性抗原结合分子的表位重叠的表位。因此，当与本发明的多特异性抗原结合分子共存时，这些分子可以与本发明的多特异性抗原结合分子竞争。因此，这些分子可以被用作，例如，抑制本发明的多特异性抗原结合分子的活性(如抗原结合活性、细胞毒性活性和抗肿瘤活性)的调节剂。此外，此种分子可以预先结合靶蛋白(gpc3或t细胞受体复合物)，并且当添加本发明的多特异性抗原结合分子时，可以检测通过竞争解离的分子。以此方式，所述分子可用作用于检测本发明的多特异性抗原结合分子与靶蛋白的结合的试剂。此处，此种分子可以被适当地标记以荧光物质等。备选地，这些分子可用于筛选结
合与本发明的多特异性抗原结合分子所结合的表位重叠的表位的新抗体。如上所述，此种分子可以预先结合靶蛋白(gpc3或t细胞受体复合物)，并且当添加测试抗体时，如果结合的分子解离，则测试抗体为结合与本发明的多特异性抗原结合分子所结合的表位重叠的表位的抗体的候选。这将使新多特异性抗原结合分子的有效筛选成为可能。
[0592]
作为本文实例作为本发明的多特异性抗原结合分子的各cdr的组合呈现的组合可以被直接用作这些分子中的h
‑
链和l链可变区的cdr的具体组合。这些分子的抗原亲和力(kd值)优选为本文中例示为本发明的多特异性抗原结合分子的kd值的值，但是不限于此。
[0593]
本发明还涉及编码这些分子的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述核酸或载体的细胞，通过培养所述细胞制备所述分子的方法，以及通过这些方法制备的分子。
[0594]
本文中引用的所有现有技术文献都通过引用结合在本说明书中。
[0595]
实施例
[0596]
下文中，将关于实施例来具体描述本发明，但是本发明不视为限于此。
[0597]
[实施例1]制备gpc3_ery22_rce115和测量细胞毒性活性
[0598]
(1
‑
1)制备gpc3_ery22_rce115
[0599]
使用针对癌症抗原(gpc3)的igg作为基础结构，制备fab之一被替代为cd3ε结合结构域的分子。在此情况中，用作基础结构的igg fc是沉默的fc，其具有减弱的对fcgr(fcγ(fc gamma)受体)的亲和力。将抗gpc3抗体h0000(seq id no:40)/gl4(seq id no:41)用作gpc3结合结构域。将抗cd3抗体rce115h/rce115l(seq id no:42/seq id no:43)用作cd3结合结构域。
[0600]
将通过除去igg1的c端处的gly和lys制备的g1d用作抗体h链恒定区，并将此与h0000/gl4和rce115h/rce115l组合使用。当抗体h链恒定区被命名为h1时，对应于可变区中携带h0000的抗体的h链的序列被显示为h0000
‑
h1。此处，氨基酸改变被显示为，例如，d356k。第一个字母(对应于d356k中的d)是修饰前的氨基酸残基的单字母编码表示，之后的数字(对应于d356k中的356)是eu编号所指示的修饰的位置，并且最后的字母(对应于d356k中的k)是修饰后的氨基酸残基的单字母编码表示。通过除去igg1的c端处的gly和lys制备的g1dh(seq id no:44)，通过将l234a/l235a/y349c/t366w突变引入g1dh中制备的ery22_hk(seq id no:45)，以及通过将l234a/l235a/d356c/t366s/l368a/y407v突变引入g1dh中制备的ery22_hh(seq id no:46)根据参比例1的方法制备。l234a和l235a突变被引入到相应的h链中以减弱对fcgr(fcγ受体)的亲和力，并且y349c/t366w和d356c/t366s/l368a/y407v突变被引入以在生产包含两种类型的h链的异源二聚体抗体时有效地形成各h链的杂聚体。
[0601]
通过用针对gpc3的fab的vh和vl结构域置换而制备的异源二聚体抗体gpc3_ery22_rce115是根据参比例1制备的(图1a)。
[0602]
插入有编码gl4
‑
ery22_hk(seq id no:47)，h0000
‑
ery22_l(seq id no:48)，rce115h
‑
ery22_hh(seq id no:49)，和rce115l
‑
k0(seq id no:50)中的每个的多核苷酸的一系列表达载体是通过本领域技术人员已知的方法制备的，如使用添加有与上述方法中的那些序列类似的适当序列的引物的pcr法。
[0603]
将表达载体的以下组合引入到freestyle 293
‑
f细胞中用于瞬时表达各靶分子。
[0604]
靶分子：gpc3_ery22_rce115
[0605]
由插入到表达载体中的多核苷酸编码的多肽：gl4
‑
ery22_hk，h0000
‑
ery22_l，rce115h
‑
ery22_hh，rce115l
‑
k0
[0606]
(1
‑
2)纯化gpc3_ery22_rce115
[0607]
将获得的培养物上清添加至抗flag m2柱(sigma)，然后洗涤所述柱，之后使用0.1mg/ml的flag肽(sigma)洗脱。将含目的分子的级分添加至histrap hp柱(ge healthcare)，然后洗涤所述柱，之后使用咪唑浓度梯度洗脱。使用超滤膜将含目的分子的级分浓缩，然后将所述级分添加至superdex 200柱(ge healthcare)，并且通过仅从洗脱的溶液收集单体的级分获得各纯化的目的分子。
[0608]
(1
‑
3)使用人外周血单核细胞测量gpc3_ery22_rce115的细胞毒性活性
[0609]
评测gpc3_ery22_rce115的体外细胞毒性活性。
[0610]
(1
‑3‑
1)制备人外周血单核细胞(pbmc)溶液
[0611]
使用预先装载有100μl 1,000单位/ml肝素溶液(注射用novo heparin，5000单位，novo nordisk)的注射器，自每个健康的志愿者(成年个体)收集50ml外周血。将该外周血两倍稀释于pbs(
‑
)中，分成四个等分试样，并将其添加到已装载有15ml ficoll
‑
paque plus并预先进行离心的用于淋巴细胞分离的leucosep管(货号227290，greiner bio
‑
one)中。将该分离管离心(2150rpm，十分钟，室温)，然后收集单核细胞级分。将单核细胞级分中的细胞用含10％fbs的dulbecco’s modified eagle’s medium(sigma制造，下文中称为10％fbs/d
‑
mem)洗涤一次，然后使用10％fbs/d
‑
mem制备成具有4x106个细胞/ml的细胞密度。将以此方式制备的细胞悬浮液用作以下实验中的人pbmc溶液。
[0612]
(1
‑3‑
2)测量细胞毒性活性
[0613]
使用xcelligence实时细胞分析仪(roche diagnostics)根据细胞生长抑制率来评价细胞毒性活性。将表达人gpc3的nci
‑
h446人癌细胞系或pc
‑
10人癌细胞系用作靶细胞。使nci
‑
h446或pc
‑
10从培养皿解离，然后将细胞以100μl/孔的等分试样置于e
‑
plate 96(roche diagnostics)中，调节细胞至1x104个细胞/孔，并且使用xcelligence实时细胞分析仪开始活细胞测量。在第二天，将平板自xcelligence实时细胞分析仪中取出，并将50μl制备成各浓度(0.004、0.04、0.4、4或40nm)的相应的抗体添加到平板中。室温反应15分钟后，加入50μl(1
‑
2)中制备的人pbmc溶液(2x105个细胞/孔)，并且通过将平板再次置于xcelligence实时细胞分析仪中开始活细胞测量。反应在5％二氧化碳气体、37℃的条件下进行，并且由加入人pbmc后72小时获得的细胞指标值(cell index value)使用以下等式确定细胞生长抑制率(％)。计算中使用的细胞指标值是标准化值，其中抗体添加前即刻的细胞指标值被定义为1。
[0614]
细胞生长抑制率(％)＝(a
‑
b)x 100/(a
‑
1)
[0615]
a表示未添加抗体(仅含靶细胞和人pbmc)的孔中细胞指标值的平均值，而b表示各孔中细胞指标值的平均值。一式三份地进行检测。
[0616]
当将由人血液制备的外周血单核细胞(pbmc)用作效应子细胞以测量gpc3_ery22_rce115的细胞毒性时，观察到极强的活性(图2)。
[0617]
[实施例2]抗cd3抗体rce115的h链的人源化以及共有l链的共享(2
‑
1)设计hce115ha，人源化的rce115 h链可变区
[0618]
将抗cd3抗体rce115的h链可变区(seq id no:42)人源化。确定如kabat(kabat编
号)限定的cdr和fr。
[0619]
首先，通过将数据库中的人抗体可变区序列与rce115大鼠可变区序列比较，选择人fr序列。将imgt database(http://www.imgt.org/)和ncbi genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)用作所述数据库。通过将rce115可变区的h链cdr序列与选择的人fr序列相连，设计人源化的h链可变区序列。这产生人源化的h链可变区序列，hce115hl(seq id no:51)。
[0620]
kabat编号指示的位置93处的氨基酸残基在所选的人h
‑
链fr3序列中是ala，但是在rce115可变区序列中是arg。使用大鼠和人生殖细胞系序列数据库(imgt database(http://www.imgt.org/))，发现仅若干序列在该位点处含arg。据报道，kabat编号指示的位置94处的氨基酸残基有助于通过形成上部核心而稳定抗体结构(ewert等.methods.2004oct；34(2):184
‑
99)。基于此信息，重新设计人源化的h链可变区序列，其中h链fr3中的kabat位置93和94处的氨基酸残基被置换成rce115可变区序列中存在的那些残基。这即为人源化的h链可变区序列hce115ha(seq id no:52)。
[0621]
(2
‑
2)设计rce115抗cd3抗体和抗gpc3抗体的共有l链l0000
[0622]
进行rce115抗cd3抗体的l链可变区rce115l(seq id no:43)和抗gpc3抗体的l链可变区gl4(seq id no:41)的fr/cdr改组(shuffling)。
[0623]
将gl4的fr序列选为l链fr序列。对于rce115l和gl4，l链cdr2是相同的。分别地，l链cdr1选自gl4的cdr序列，并且l链cdr3选自rce115l的cdr序列。此外，重新设计通过将所选l链cdr3的kabat位置94处的氨基酸残基asp置换为gl4存在的val残基制备的l链cdr3。
[0624]
通过连接上述选择的fr和cdr，设计人源化的l链可变区序列。这提供人源化的l链可变区序列l0000(seq id no:53)。
[0625]
(2
‑
3)评估对人gpc3的亲和力
[0626]
当使用gl4(seq id no:41)和l0000(seq id no:53)作为l链可变区时，评估结合人gpc3的活性。这使用通过突出入孔技术(knobs
‑
into
‑
hole technique)异源二聚化的人igg1的fc区处具有单个fab的单臂抗体的分子形式进行。将h0000(seq id no:40)用于抗gpc3抗体h链可变区。
[0627]
抗gpc3抗体对抗原的亲和力和结合速率常数是通过表面等离子共振测定的多循环动力学方法、使用biacore
tm
‑
t200(ge healthcare japan)测量的。将hbs
‑
ep+(ge healthcare japan)用于运行缓冲液，并将胺偶联试剂盒(ge healthcare japan)用于使a/g蛋白共价结合至cm5芯片(羧甲基葡聚糖涂覆的芯片)。准备各抗gpc3抗体以使a/g蛋白将捕获约100ru。使用hbs
‑
ep+将用作分析物的人gpc3制备成8、16、32、64和128nm。通过以下方式进行测量：首先允许a/g蛋白捕获抗体溶液，然后以30μl/min的流速注射人gpc3溶液达三分钟以允许反应发生。然后，将溶液换成hbs
‑
ep+并测量解离相达15分钟。在完成解离相测量后，通过用10mm gly
‑
hcl ph 1.5洗涤将传感器芯片再生。通过以下方式类似地进行在0浓度的测量：允许a/g蛋白捕获抗体溶液，进行三分钟的hbs
‑
ep+注射以允许反应发生，然后换成hbs
‑
ep+以测量解离相达15分钟。在完成解离相测量后，通过用10mm gly
‑
hcl ph 1.5洗涤将传感器芯片再生。使用biacore专门的数据分析软件biacore t200 evaluation software version 1.0来进行动力学分析，从而自获得的感应图谱计算结合速率常数(ka)，解离速率常数(kd)，以及速率常数比。结果显示在表6中。
[0628]
表6
[0629][0630]
(2
‑
4)评估对人cd3的亲和力
[0631]
当使用hce115ha(seq id no:52)作为h链可变区并且使用l0000(seq id no:53)作为l链可变区时，评估结合人cd3的活性。这使用通过突出入孔技术异源二聚化的人igg1的fc区处具有单个fab的单臂抗体的分子形式进行。
[0632]
通过表面等离子共振测定的单循环动力学方法，使用biacore
tm
‑
t200(ge healthcare japan)测量抗cd3抗体对抗原的亲和力和结合速率常数。将hbs
‑
ep+(ge healthcare japan)用于运行缓冲液，并将胺偶联试剂盒(ge healthcare japan)用于使人cd3共价结合至cm4芯片(羧甲基葡聚糖涂覆的芯片)。使用hbs
‑
ep+将用作分析物的抗cd3抗体制成5和20μg/ml。通过以下方式进行测量：首先连续地以20μl/min的流速注射5
‑
和20
‑
μg/ml抗cd3抗体溶液中的每种达三分钟以允许反应发生。然后，将溶液换成hbs
‑
ep+并测量解离相达3分钟。在完成解离相测量后，通过用10mm gly
‑
hcl ph 1.5洗涤将传感器芯片再生。通过以下方式进行在0浓度的测量：将三分钟hbs
‑
ep+注射中的每个相继地进行两次以允许反应发生，然后换成hbs
‑
ep+以测量解离相达3分钟。在完成解离相测量后，通过用10mm gly
‑
hcl ph 1.5洗涤将传感器芯片再生。使用biacore专门的数据分析软件biacore t200 evaluation software version 1.0来进行动力学分析，从而自获得的感应图谱计算结合速率常数(ka)，解离速率常数(kd)，以及速率常数比。结果显示在表7中。
[0633]
表7
[0634][0635]
(2
‑
5)制备gpc3_ery27_hce115
[0636]
将针对癌症抗原(gpc3)的igg4用作基础结构以制备ery27分子(图1b)，其中fab中的一个的h链可变区被替换成cd3ε结合结构域，并且l链为两个fab共有。在此情况中，用作基础结构的igg4 fc是沉默的fc，其具有减弱的对fcgr(fcγ受体)的亲和力。将h0000(seq id no:40)用作gpc3结合结构域的h链可变区，并将hce115ha(seq id no:52)用作cd3结合结构域的h链可变区。将l0000(seq id no:53)用作l链可变区。当制备包含两种类型的h链的异源二聚体抗体时，引入被引入到相应h链中的d356k和k439e突变以用于各h链的有效的异源聚合体形成(wo2006/106905)。h435r是妨碍与a蛋白的结合的修饰，并且被引入以用于有效分离异源聚合体和同源聚合体(wo/2011/078332)。
[0637]
通过已知的方法制备插入有编码h0000
‑
ery27_hk(seq id no:54)、hce115ha
‑
ery27_he(seq id no:55)和l0000
‑
k0(seq id no:56)中的每一个的多核苷酸的一系列表达载体。
[0638]
将表达载体的以下组合引入到freestyle 293
‑
f细胞中以用于瞬时表达各靶分子。
[0639]
靶分子：gpc3_ery27_hce115
[0640]
插入到表达载体中的多核苷酸编码的多肽：h0000
‑
ery27_hk、hce115ha
‑
ery27_he和l0000
‑
k0
[0641]
(2
‑
6)纯化gpc3_ery27_hce115
[0642]
通过实施例1
‑
2中所述的方法纯化各目的分子。
[0643]
(2
‑
7)使用人外周血单核细胞测量细胞毒性活性
[0644]
(2
‑7‑
1)制备人外周血单核细胞(pbmc)溶液
[0645]
通过实施例1
‑3‑
1中所述的方法制备所述溶液。
[0646]
(2
‑7‑
2)测量细胞毒性活性
[0647]
通过实施例1
‑3‑
2中所述的方法测量细胞毒性活性。
[0648]
当将由人血液制备的pbmc用作效应子细胞以测量gpc3_ery27_hce115的细胞毒性时，作为rce115的h链的人源化和共有l链的共享的结果，观察到活性减小(图2)。
[0649]
[实施例3]制备和评估人源化的双特异性抗体变体以改善各种性质
[0650]
实施例2中获得的人源化的抗人cd3ε(cd3 epsilon)链和抗人gpc3双特异性抗体gpc3_ery27_hce115(seq id no:54、55和56)的t细胞依赖性细胞毒性活性低于gpc3_ery22_rce115(seq id no:47、48、49和50)的t细胞依赖性细胞毒性活性。这可能是由于作为人源化和共有l链的共享的结果的对gpc3和cd3ε链的亲和力减弱所致。关于具有独立序列的gpc3和cd3ε链抗原，目前没有关于通过使用共有抗体l链增强了t细胞依赖性细胞毒性活性并且提高了对两种抗原的亲和力的人源化的双特异性抗体的报道。因此认为，获得具有双重特异性并且显示等于或大于gpc3_ery22_rce115的药物效力的药物效力的人源化抗体是困难的。
[0651]
在此种情况下，申请人通过本领域技术人员已知的方法制备了对人gpc3和人cd3ε链具有改良的亲和力的经修饰的人源化的双特异性抗体，所述方法包括将抗体基因编码的氨基酸残基全面置换以产生针对人gpc3和人cd3ε
‑
链抗原两者的抗体变体，以及通过筛选进行各种评估。此外，使用类似方法来产生具有改良的理化性质的经修饰的人源化的双特异性抗体。此外，通过组合对改良亲和力和理化性质有效的氨基酸残基的置换，在人源化之前制备tdcc活性等于或大于gpc3_ery22_rce115的t细胞依赖性细胞细胞毒性的优化的双特异性抗体。
[0652]
通过与实施例1和2中的那些类似的方法进行人源化的双特异性抗体的优化中的点突变的引入、抗体的表达和纯化、抗原亲和力测量以及t细胞依赖性细胞细胞毒性的确定。根据kabat定义(kabat编号)确定cdr和fr。
[0653]
根据目的，将以下用作抗体h链恒定区(数字指示eu编号)：通过将l234a/l235a/n297a/d356c/t366s/l368a/y407v/g446缺失/k447缺失突变引入到人igg1中制备的e22hh(seq id no:57)；通过将l234a/l235a/n297a/y349c/t366w/g446缺失/k447缺失突变和在位置118之前紧挨着的ser
‑
ser插入突变引入到人igg1中制备的e22hk(seq id no:58)；通过将d356c/t366s/l368a/y407v/g446缺失/k447缺失突变引入到人igg1中制备的g1dh；通过将118
‑
215缺失和c220s/y349c/t366w/h435r突变引入到人igg1中制备的none
‑
hi
‑
kn010g3；通过将l235r/s239k/n297a/e356k/r409k/h435r/l445p/g446缺失/k447缺失突变引入到人igg4中制备的e2702gsksc(seq id no:60)；通过将k196q/l235r/s239k/n297a/r409k/k439e/l445p/g446缺失/k447缺失突变引入到人igg4中制备的e2704sepsc(seq id no:61)；和通过将l235r/s239k/n297a/e356k/r409k/l445p/g446缺失/k447缺失突变引入到人igg4中制备的e2702sksc(seq id no:62)。此外，将通过将r108a/t109s突变引入到人κ链中制备的人κ(kappa)链k0(seq id no:63)和e22l(seq id no:432)用作抗体l链恒定区。
[0654]
当制备异源多聚抗体时，在eu编号位置356处用cys置换asp的突变，在eu编号位置366处用ser置换the的突变，在eu编号位置368处用ala置换leu的突变，在eu编号位置407处用val置换tyr的突变，在eu编号位置349处用cys置换tyr的突变，在eu编号位置366处用trp置换thr的突变，以及在位置118之前紧邻地插入ser
‑
ser的突变是用于有效形成各h链的异源二聚体分子的突变。类似地，当制备异源多聚抗体时，在eu编号位置356处用lys置换glu的突变和在eu编号位置439处用glu置换lys的突变也是用于有效形成各h链的异源二聚体分子的突变。预期其提高双特异性抗体生产的效率。
[0655]
在eu编号位置234处用ala置换leu的突变，在eu编号位置235处用ala或arg置换leu的突变，在eu编号位置239处用lys置换ser的突变，以及在eu编号位置297处用ala置换asn的突变是用于减弱对fcγ受体和补体(c1q)的亲和力的突变。预期其抑制fab与cd3的结合以及fc介导的fcγ受体或补体的交联，并且避免伴随非特异性效应子功能增强的细胞因子释放综合征。
[0656]
在eu编号位置118至215处引入有缺失突变的h链可以与全长h链序列组合以产生仅具有一个fab的抗体(单价抗体)，并且其可用于亲和力评估。
[0657]
在eu编号位置409处用lys置换arg的突变和在eu编号位置435处用arg置换his的突变是用于改变抗体性质以分别与人igg1和人igg3的性质接近的突变。
[0658]
(3
‑
1)通过点突变改变人源化的抗cd3抗体的亲和力
[0659]
首先，将点突变引入到实施例2中制备的人源化的抗人cd3ε链抗体序列hce115ha
‑
ery27_he(seq id no:55)的fr1、fr2、fr3、cdr1、cdr2和cdr3中以制备修饰的抗体。接下来，确定这些修饰的抗体对可溶性人cd3ε链的亲和力。将具有亲和力增强效果的位点组合，产生具有表8中所示亲和力的修饰的抗体。
[0660]
表8
[0661]
[0662]
[0663][0664]
(3
‑
2)改变人源化的抗gpc3抗体的亲和力
[0665]
首先，将点突变引入到实施例2中制备的抗人gpc3双特异性抗体序列h0000
‑
ery27_hk(seq id no:54)的cdr1、cdr2和cdr3中以制备修饰的抗体。接下来，确定这些修饰
的抗体对可溶性人gpc3的亲和力。将具有亲和力增强效果的位点组合，产生具有表9中所示亲和力的修饰的抗体。
[0666]
表9
[0667]
[0668]
[0669][0670]
(3
‑
3)通过点突变改变pi
[0671]
在双特异性抗体的商业制备中，要求高水平的纯度。据报道，当使用离子交换色谱
法时，改变分子等电点(pi)是有效的(plos one.2013；8(2):e57479)。因此，将用于改变pi的点突变引入到实施例2中制备的人源化的抗人gpc3抗体序列h0000
‑
ery27_hk(seq id no:54)的cdr1、cdr2和cdr3中以制备修饰的抗体。接下来，确定这些修饰的抗体对可溶性人gpc3的亲和力。
[0672]
结果发现，可以降低pi同时保持对人gpc3的亲和力的氨基酸改变是根据kabat编号的位置19、43、53和61处的氨基酸。
[0673]
将显示保持对人gpc3的亲和力并降低pi的效果的位点组合，产生具有表10中所示亲和力和pi值的抗体。
[0674]
表10
[0675][0676]
(3
‑
4)通过点突变改变胞外基质结合能力
[0677]
已报道，与胞外基质(ecm)等的非特异性结合可能对药物动力学有影响(mabs.2012nov
‑
dec；4(6):753
‑
60)。因此，通过参比例4中所述的方法确定实施例中获得的修饰的抗体的ecm结合能力。结果，确认人源化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体gpc3_ery27_hce115(seq id no:54、55和56)具有高ecm结合能力。因此，经研究实施例3
‑
1、3
‑
2和3
‑
3中对于人源化的抗人cd3ε链抗体序列hce115ha
‑
ery27_he(seq id no:55)所检测的任一点突变是减小ecm结合能力的一种组合。结果，发现kabat编号位置11、16、52a、53、98和100处的氨基酸有助于保持对cd3ε的亲和力并且对ecm结合能力的减小有影响，并且获得与人源化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体的抗体变体gpc3_ery27_hce115的ecm结合能力相比具有减小的ecm结合能力的抗体(表11)。
[0678]
表11
[0679][0680]
(3
‑
5)通过点突变改变与sure
tm
配体的结合能力
[0681]
抗体与a蛋白的结合取决于其可变区序列(vh3)的实例是已知的(j biomol tech.2011 jul；22(2):50
‑
2)。在人源化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体的a蛋白纯化中，去除同源多聚抗cd3抗体对于抑制经由cd3的非特异性反应是重要的。因此认为需要抑制同源多聚抗cd3抗体与a蛋白的结合。推测起来，商业生产中将使用sure
tm
配体，并且因此将针对sure
tm
配体结合的点突变引入到人源化的抗cd3抗体h
‑
链变体tr01h082
‑
e2702gsksc和tr01h084
‑
e2702gsksc(seq id no:398和399)的cdr2中，以制备修饰的抗体。这些修饰的抗体与sure
tm
配体的结合能力通过参比例5中所述的方法确定。结果发现，kabat编号的位置19、57和59处的氨基酸有助于保持对cd3ε的亲和力并且对sure
tm
配体结合能力有影响，并且获得与tr01h082
‑
e2702gsksc/l0011
‑
k0(seq id no:398和410)或tr01h084
‑
e2702gsksc/l0011
‑
k0(seq id no:399和410)的sure
tm
配体结合能力相比具有减小的sure
tm
配体结合能力的抗体(表12)。
[0682]
表12
[0683][0684]
(3
‑
6)通过组合导致各种性质改善的点突变，制备优化的双特异性抗体
[0685]
可以通过组合如实施例3
‑
1至3
‑
5中所述的导致各种性质改善的点突变来制备优化的修饰的抗体。作为此种修饰的抗体的实例，制备表13中所述的抗体，并使用与实施例1的方法类似的方法对其进行t细胞依赖性细胞细胞毒性(tdcc)评估。结果显示在图4至9中。结果获得显示t细胞依赖性细胞细胞毒性等于或大于人源化前的gpc3_ery22_rce115的t细胞依赖性细胞细胞毒性的优化的人源化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体。
[0686]
表13
[0687][0688]
实施例3
‑
1至3
‑
6显示以下氨基酸残基，例如，对于保持显示t细胞依赖性细胞细胞毒性等于或大于人源化前的gpc3_ery22_rce115的t细胞依赖性细胞细胞毒性的优化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体的性质是重要的。
[0689]
在抗人cd3ε链抗体中，所述实例为位置11处的leu，位置16处的gly，位置52a处的asp，位置53处的gln，位置72处的ala，位置78处的ile，位置98处的ala，位置100处的gly和位置102处的ile。在抗人gpc3抗体中，所述实例为位置19处的thr，位置43处的glu，位置52a处的gly，位置53处的pro或glu，位置55处的pro，和位置61处的glu。此外，在共有抗体l链中，所述实例为位置25处的pro，位置27a处的pro，位置27b处的pro，位置33处的ile，位置34处的gln，位置56处的arg或trp，和位置89处的tyr。(所有位置都由kabat编号指示)。
[0690]
[实施例4]评估体内效力
[0691]
使用荷瘤模型评估一些上述抗体的体内效力。
[0692]
对由实施例3
‑
6中所述的体外测定确认为具有细胞毒性活性的表13所示的那些抗体中的代表性抗体进行体内效力评估。在体内效力评估中，考虑由肿瘤聚集体形成所致的微环境的差异引起的对评估结果的任何影响。因此，将对抗体药物效力有不同敏感度的两种类型的人癌细胞系(即，pc
‑
10和nci
‑
h446)用于评估，即使这些细胞系的gpc3表达水平基本相同。将所述细胞系移植到nod scid小鼠中，并对确认形成有肿瘤的nod scid小鼠进行
通过体外培养人pbmc生长的t细胞的移植。通过施用优化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体来处理所述小鼠(被称为t细胞注射模型)。
[0693]
更具体地，在使用pc
‑
10t细胞注射模型的优化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体的药物效力测试中，进行以下测试。使用分离自从健康志愿者收集的血液的pbmc和t细胞活化/扩增试剂盒/人(macs miltenyi biotec)，将t细胞扩增培养。将人癌细胞系pc
‑
10(1x107个细胞)与matrigel
tm basement membrane matrix(bd)混合，并移植到nod scid小鼠(cleajapan，雌性，6周)的腹股沟皮下区域。移植的当天被定义为第0天。在移植前一天，将抗asialo
‑
gm1抗体(wako pure chemicals)以0.2mg/小鼠腹膜内地施用于小鼠。在移植后的第13至15天，将小鼠根据其体重和肿瘤尺寸分组，并再次将抗asialo
‑
gm1抗体以0.2mg/小鼠腹膜内地施用于小鼠。在次日，将通过前述扩增培养获得的t细胞以3x107个细胞/小鼠腹膜内移植。t细胞移植后四小时，通过尾静脉以1mg/kg静脉内施用优化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体。优化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体仅施用一次。
[0694]
结果，与溶剂施用组相比，在优化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体施用组中，更明显地观察到抗肿瘤活性(图10a、b)。
[0695]
通过类似方法进行nci
‑
h446 t细胞注射模型上的优化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体的药物效力测试。针对nci
‑
h446通过尾静脉以5mg/kg静脉内施用优化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体一次。
[0696]
结果，与溶剂施用组相比，在优化的抗人cd3ε链和抗人gpc3双特异性抗体施用组中，更明显地观察到抗肿瘤活性(图11a、b)。
[0697]
参比例
[0698]
[参比例1]抗体表达载体的制备以及抗体表达和纯化
[0699]
通过本领域技术人员已知的方法，如使用quikchange定点诱变试剂盒(site
‑
directed mutagenesis kit)(stratagene)、pcr或in
‑
fusion advantage pcr克隆试剂盒(takara)，引入氨基酸置换以构建表达载体。通过本领域技术人员已知的方法确定获得的表达载体的核苷酸序列。将制备的质粒瞬时引入到来源于人胚胎肾癌的细胞系hek293h(invitrogen)或freestyle293(invitrogen)的细胞中以表达抗体。使用rprotein asepharose
tm fast flow(ge healthcare)通过本领域技术人员已知的方法从获得的培养物上清纯化抗体。使用分光光度计测量纯化的抗体溶液在280nm处的吸光度，并且使用通过pace法(protein science 1995；4:2411
‑
2423)计算的吸收系数从所确定的值计算抗体浓度。
[0700]
[参比例2]各测试抗体的使用人外周血单核细胞作为效应子细胞的adcc活性
[0701]
根据以下方法确定各测试抗体的adcc活性。
[0702]
将人外周血单核细胞(下文中称为人pbmc)用作效应子细胞以如下测量各测试抗体的adcc活性。
[0703]
(1)制备人pbmc溶液
[0704]
使用预装填有200μl 1000单位/ml肝素溶液(novo
‑
heparin injection 5000单位，novo nordisk)的注射器，自chugai pharmaceutical co.ltd.的健康志愿者(成年男性)收集50ml外周血。将外周血用pbs(
‑
)稀释两倍，分成四个等分试样，并且添加到已装填有15ml ficoll
‑
paque plus并提前进行离心的leucosep淋巴细胞分离管(greiner bio
‑
one)中。将该含外周血等分试样的分离管以2150rpm在室温离心十分钟，然后收集单核细胞级分。将各级分中的细胞用含10％fbs的dulbecco’s modified eagle's medium(sigma)(下文中称为10％fbs/d
‑
mem)洗涤一次，然后以5x106个细胞/ml的细胞密度悬浮在10％fbs/d
‑
mem中。在培养箱中在37℃孵育一小时后，将细胞用10％fbs/d
‑
mem洗涤一次，并将细胞悬浮在10％fbs/d
‑
mem中以产生2x105个细胞/ml的细胞密度。将所述细胞悬浮液作为靶细胞进行以下实验。
[0705]
(2)铬释放测定(adcc活性)
[0706]
根据铬释放法由铬释放比速率评估adcc活性。首先，将制备成各浓度(0、0.004、0.04、0.4、4和40μg/ml)的抗体溶液以50μl/孔添加到96孔u形底平板中。接下来，将靶细胞以50μl/孔(1x104个细胞/孔)接种，并使其在室温静置15分钟。将(1)中制备的人pbmc溶液以100μl/孔(5x105个细胞/孔)添加，并将平板静置于37℃的5％二氧化碳气体培养箱达四小时，之后离心。使用γ计数器测量平板各孔中的100μl培养物上清的放射性。基于以下等式确定铬释放比速率：
[0707]
铬释放比速率(％)＝(a
‑
c)x100/(b
‑
c)
[0708]
在该等式中，a表示各孔中的100μl培养物上清的放射性(cpm)的平均值；b表示其中已经向靶细胞添加了100μl 2％np
‑
40水溶液(nonidet p
‑
40，nacalai tesque)和50μl 10％fbs/d
‑
mem的孔中的100μl培养物上清的放射性(cpm)的平均值；而c表示已经向靶细胞添加了150μl 10％fbs/d
‑
mem的孔中的100μl培养物上清的放射性(cpm)的平均值。一式三份地进行检测并且计算各测试抗体的反映adcc活性的上述检测中铬释放比速率(％)的平均值和标准差。
[0709]
[参比例3]通过差异扫描荧光计评估修饰的抗体的tm
[0710]
在该检测中，通过差异扫描荧光计使用rotor
‑
gene q(qiagen)评估修饰的抗体的tm(热变性温度)值。据报道，该方法与使用作为用于评估抗体的热稳定性的方法而广为人知的差异扫描量热计的tm评估具有有利的关联性(journal of pharmaceutical science 2010；4:1707
‑
1720)。
[0711]
将5000x浓缩的sypro
tm
橙(molecular probes)用pbs(sigma)稀释，然后与抗体溶液混合以制备测量样品。将20μl等分试样的各样品置于测量管中，并使温度以240℃/hr的升温速率从30℃增加至99℃。在470nm(激发波长)/555nm(荧光波长)检测随温度升高的荧光变化。
[0712]
使用rotor
‑
gene q series软件(qiagen)分析数据以计算观察到荧光跃迁的温度，并将该温度定义为tm。
[0713]
[参比例4]评估ecm结合能力
[0714]
根据wo2012093704中所述的方法进行所述评估。具体地，使用tbs(takara，#t903)将bd matrigel(bd biosciences，#356237)制成2mg/ml，将此以5μl/孔分配到96孔测量平板(meso scale discovery,#l15xb
‑
3(high bind))中，然后使其在凉的平板中静置过夜。然后，将150μl ecl封闭缓冲液(含0.05％tween20，0.5％bsa和0.01％叠氮化钠的pbs)分配到平板的各孔中，然后使其在室温静置两小时以上。
[0715]
利用msd sulfo
‑
tag nhs ester(meso scale discovery，#r91an
‑
2)通过附带的使用说明对山羊抗人igg(γ)(invitrogen，#628400)进行钌标记。将此稀释在ecl稀释缓冲
液(含0.01％tween20，0.1％bsa和0.01％叠氮化钠的pbs)中至终浓度2μg/ml。此外，将标准抗体和测试抗体稀释在pbs
‑
t(含0.05％tween 20和0.01％叠氮化钠的pbs)中至终浓度3μg/ml。
[0716]
向96孔反应平板(thermo scientific，nunc#145399)相继加入10μlecl稀释缓冲液，20μl标准抗体和测试抗体(3μg/ml)，以及30μl钌标记的抗体(2μg/ml)，并使其在室温在黑暗中在搅拌下反应一小时。
[0717]
通过倾斜将ecl封闭缓冲液从96孔测量平板中除去，加入来自96孔反应平板的50μl样品溶液，并使其在黑暗中在室温静置一小时。这之后通过倾斜将样品溶液从96孔测量平板中除去，并且在添加150μl 2x t缓冲液(使用ecl稀释缓冲液两倍稀释的4x msd read buffer t(meso scale discovery))后立即进行ecl测量。将sectorimager 2400(meso scale discovery)用于进行测量。
[0718]
通过将测试抗体的荧光强度除以标准抗体的荧光强度，通过将标准抗体的值限定为1计算并比较强度来进行分析。
[0719]
[参比例5]评估sure
tm
配体结合能力
[0720]
通过使用biacore
tm
‑
t200(ge healthcare japan)来评估与sure
tm
配体结合的能力。将hbs
‑
ep+(ge healthcare japan)用于运行缓冲液，并将胺偶联试剂盒(ge healthcare japan)用于使mab select sure
tm
配体(ge healthcare japan)共价结合至cm5芯片(羧甲基葡聚糖涂覆的芯片)。使用hbs
‑
ep+将用作分析物的抗体制成5μg/ml。通过以下方式进行测量：首先以10μl/min的流速注射5
‑
μg/ml抗体溶液达3分钟，然后换成hbs
‑
ep+，并在允许继续流动0.5分钟后测量响应(ru)。在完成测量后，通过用10mm gly
‑
hcl ph 1.5洗涤将传感器芯片再生。对于对照流式细胞，在不使配体共价结合至芯片的情况下进行类似实验，并且通过获得响应(ru)之间的差异来分析对sure
tm
配体的亲和力。
[0721]
对应于本文中提及的seq id no的序列显示在下表中。
[0722]
表14
[0723]
[0724][0725]
工业实用性
[0726]
本发明提供新的多特异性抗原结合分子，其保持bite所具有的强抗肿瘤活性和不
独立于癌症抗原地引起细胞因子风暴等的优异安全性质，并且还在血液中具有长的半衰期。包含本发明的抗原结合分子作为活性成分的细胞毒性引发剂可以靶向表达磷脂酰肌醇聚糖3的细胞和含有这些细胞的肿瘤组织并且引起细胞损伤。向患者施用本发明的多特异性抗原结合分子使得理想的治疗成为可能，所述治疗不仅具有高水平的安全性而且还具有减小的身体负担，并且是高度方便的。