一种铁粒幼红细胞性贫血检测引物组合物及应用的制作方法

1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测铁粒幼红细胞性贫血基因的引物组合物及其应用。


背景技术：

2.铁粒幼红细胞贫血(sideroblastic anemia，sa)是由不同病因引起的血红素合成障碍和铁利用不良所致的一组罕见的异质性疾病，其共同特征为骨髓中出现大量环形铁粒幼细胞、红系无效造血、组织铁增高和外周血出现不同比例低色素性红细胞。铁粒幼细胞贫血可分为遗传性和获得性两类，不同类型的sa治疗策略和转归存在差异。遗传性铁粒幼红细胞贫血多为x染色体性联遗传，患者贫血程度差别很大，有些轻度贫血者不做家系调查极易漏诊，应用药理剂量的吡多醇治疗alas2导致的遗传性sa部分患者可获益。获得性铁粒幼细胞贫血可近一步分为原发性和继发性。继发性铁粒幼细胞贫血可由于服用药物、饮酒和铅、锌等中毒所致。原发性铁粒幼贫血主要包括骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼细胞(myelodysplastic syndrome with ring sideroblasts，mds
‑
rs)等，该疾病可进展为急性白血病。偶见有明显家族性发病的铁粒幼细胞贫血患者出现骨髓增生异常综合征的情况。铁过多是sa常见的并发症，尤其在疾病晚期，严重者可危及生命导致死亡。此外，还可见肝脾肿大、糖尿病、皮肤色素沉着、心律失常、免疫功能低下等并发症。
3.目前，对sa的诊断尚无明确诊断指南参考，其临床表现及实验室检查项目缺乏特异性。患者有明确的家族史有助于遗传性sa的诊断。遗传性sa发病年龄轻，除少数典型病例于出生后或婴儿时期出现贫血，大多数患者于10
‑
20岁左右出现贫血，偶有至50
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60岁后才被发现；遗传性sa常见为小细胞低色素性贫血，偶有大细胞性贫血；同时，遗传性sa患者血清含铁更高。因此，患者发病年龄、贫血性质、铁代谢等指标对于遗传性sa的诊断有重要的提示意义。由于骨髓铁染色均表现有大量环形铁粒幼细胞，年龄、小细胞或大细胞贫血、铁代谢等指标均不具有明确的特异性，临床上较难鉴别遗传性sa和获得性sa尤其是mds
‑
rs。而基因突变分析是遗传性sa诊断的重要标准，目前可检测出30
‑
70％的遗传性sa患者。
4.目前检测sa的方法主要涉及血常规、细胞形态及分子生物学等。其中分子生物学的实验方法主要有巢式pcr、一代测序等。pcr方法不能直观的得到具体的突变序列，而一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域。而二代测序作为一种高通量的检测方法，可以一次性准确测量多个基因的外显子序列，使精准治疗成为可能。目前对于sa在应用二代测序的方法进行基因检测鉴别方面的研究屈指可数，而sa在基因诊断水平的检测尤为重要。
5.专利cn108192880a公开了一种人的δ
‑
氨基酮戊酸合成酶突变蛋白及其应用，根据该δ
‑
氨基酮戊酸合成酶突变蛋白制备基因芯片、单克隆抗体和elisa试剂盒，为x连锁遗传性铁粒幼细胞贫血和x连锁红细胞生成性血卟啉病的基因诊断提供指引作用，但所述方法仅针对人的δ
‑
氨基酮戊酸合成酶突变蛋白，其检出率较低。
6.因此，亟需一种精确度、准确性更高的sa检测试剂盒及方法，以弥补临床sa在分子
诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等指导方面的不足。


技术实现要素：

7.针对上述不足，本发明提供了一种用于检测铁粒幼红细胞贫血基因的引物组合物及其应用。采用本发明所述的引物组合物，检测铁粒幼红细胞贫血相关基因，具有操作简便、精确度、准确性、灵敏度高的优点，可弥补临床sa在分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等指导方面的不足。
8.为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
9.一方面，本发明提供了一种用于检测铁粒幼红细胞贫血基因的引物组合物，所述的铁粒幼红细胞贫血基因为alas2或sf3b1中的一种或多种。
10.具体地，所述的铁粒幼红细胞贫血基因的突变位点如下表1所示。
11.表1铁粒幼红细胞贫血基因突变位点
12.13.14.[0015][0016]
进一步具体地，所述的引物组合物如下表2所示。
[0017]
表2引物组合物
[0018]
[0019]
[0020][0021]
具体地，所述的引物覆盖整个基因的全部外显子序列。
[0022]
另一方面，本发明提供了上述引物组合物在制备检测铁粒幼红细胞贫血基因的产品中的应用。
[0023]
又一方面，本发明提供了一种检测铁粒幼红细胞贫血基因的产品，所述的产品包括上述引物组合物。
[0024]
具体地，所述的产品还包括dna聚合酶、buffer、ddh2o、dntp。
[0025]
具体地，所述的产品为独立试剂或试剂盒。
[0026]
又一方面，本发明提供了上述引物组合物或产品在检测铁粒幼红细胞贫血基因中的应用。
[0027]
又一方面，本发明提供了一种检测铁粒幼红细胞贫血基因的方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，所述方法包括利用上述引物组合物或产品对待测样品中铁粒幼红细胞贫血基因进行检测。
[0028]
具体地，所述的方法包括以下步骤：
[0029]
(1)基因组dna提取；
[0030]
(2)多重pcr：用上述引物组合物对步骤(1)得到的基因组dna进行扩增；
[0031]
(3)建库；
[0032]
(4)文库测序及数据处理。
[0033]
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
[0034]
(1)本发明提供了一种检测铁粒幼红细胞贫血基因的引物组合物，利用本发明提供的与sa相关基因突变的基因群，结合高通量测序技术，可以实现在骨髓形态学和血常规检查之外对sa进行辅助诊断，特别是对于疾病后续的治疗方向和效果做出预判具有特殊的优势，可弥补临床sa在分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等指导方面的不足。
[0035]
(2)本发明所述的引物组合物检测铁粒幼红细胞贫血相关基因，具有操作简便、精确度、准确性、灵敏度高等优点，解决了目前监测准确性低，检测方法局限的技术缺陷。
[0036]
(3)本发明所述的引物组合物可一次性检测所述2个基因的342个基因突变位点，覆盖面广，检测效率高。
附图说明
[0037]
图1为alas2基因c.1355g>a核苷酸突变示意图。
具体实施方式
[0038]
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039]
实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
[0040]
实施例1铁粒幼红细胞贫血基因、突变位点及其引物组合物
[0041]
(1)采用dbsnp数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，千人基因组数据库1000genomes(http://www.1000genomes.org/)，外显子组整合数据库exac(http://exac.broadinstitute.org/)和人类基因突变数据库hgmd(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)，以及功能预测工具polyphen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和sift(http://sift.jcvi.org/)，并采用以下原则筛选致病突变位点：(1)根据突变所在的基因组位置和类型，过滤掉对蛋白产物序列不产生影响的突变；(2)利用1000genomes数据和exac数据，注释每个突变在人群中的比例，如果比例小于等于1％则不认为是多态性位点；(3)检索人类基因突变数据库，查询一个突变在hgmd中是否有记载，其出现在sa等相关疾病中；(4)利用蛋白质功能预测软件polyphen
‑
2和sift预测该突变是否影响蛋白功能；(5)如果经过(2)(3)(4)后，一个突变满足“非多态性”、“sa记载过”和“影响蛋白功能”这三条中至少两条的，将被判为与疾病可能相关；(6)如果一个突变虽然不满足(5)但是在hgmd中有记录，则被判读为意义不明的突变；如果一个突变在文献中被明确记载与疾病高度相关，则直接判为热点突变。
[0042]
最终筛选得到以下基因：(1)alas2基因：遗传性铁粒幼细胞贫血多为x染色体性联遗传，是由于5
‑
氨基酮戊酸合成酶(aminolevulinate synthase 2，alas2)基因突变引起的；(2)sf3b1基因：rna剪接基因，其突变与骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼细胞(myelodysplastic syndrome with ring sideroblasts，mds
‑
rs)密切相关。
[0043]
具体突变位点如下表3所示。
[0044]
表3突变位点
[0045]
[0046]
[0047]
[0048][0049]
(2)根据上述基因及突变位点设计引物组合物及其浓度如下表4所示。
[0050]
表4引物组合物
[0051]
[0052]
[0053]
[0054][0055]
(3)复合体系pcr扩增：将上述引物混合至一个反应体系中，并选择在保证模板浓度一定的条件下最合适的引物浓度，使复合体系中的每对引物尽量做到最优扩增。
[0056]
实施例2一种用于检测sa的试剂盒及其使用方法
[0057]
1.复合扩增体系中的扩增引物
[0058]
复合扩增体系中，各基因及突变位点的正反向扩增引物如上表4所示，为使每个基因及突变位点的扩增效率尽可能的一致，通过调整复合体系中每对引物的浓度，最终调整后的引物浓度如上表4所示。
[0059]
2.dna提取：利用dna提取试剂盒提取外周血或骨髓样本的全基因组dna。
[0060]
3.根据实施例1提供的引物组合物对提取的dna进行复合pcr扩增。
[0061]
其中，复合扩增体系如下表5所示。
[0062]
表5复合扩增体系
[0063]
成分体积agriseq
tm amplification mix2μlion ampliseq
tm primer pool5μl稀释后dna样本(10ng/μl)3μl
[0064]
dna来源于所测样本，primer pool为上述引物的混合物，各引物浓度如表4所示。
[0065]
复合扩增反应程序如下：99℃，2min；99℃，15s，62℃，4min，2cycles；99℃，15s，60℃，8min，14cycles；10℃，贮存。
[0066]
4.采用试剂盒将扩增产物制备成可供测序平台测序的dna文库，完成建库。
[0067]
4.1对扩增产物进行酶切。酶切体系如下表6所示。
[0068]
表6酶切体系
[0069]
步骤3复合扩增产物20μlpre
‑
ligation2μl
[0070]
酶切反应程序如下：50℃，20min；55℃，20min；60℃，20min；10℃，贮存。反应结束后对产物进行磁珠法纯化。
[0071]
其中，pre
‑
ligation购自thermofisherscientific，货号为a34141。
[0072]
4.2末端修复&加a。反应体系如下表7所示。
[0073]
表7末端修复&加a
[0074]
酶切产物40μlend repair&a
‑
tailing enzyme4μlend repair&a
‑
tailing buffer6μl
[0075]
反应程序如下：20℃，30min；65℃，30min；4℃，贮存。
[0076]
其中，end repair&a
‑
tailing enzyme及end repair&a
‑
tailing buffer购自那昂达，货号1002103。
[0077]
4.3接头连接。反应体系如下表8所示。
[0078]
表8接头连接
[0079]
end repair and a
‑
tailing reaction product50μlidt udi接头(15μm)2μlligation buffer26μldnaligase2μl
[0080]
反应程序如下：20℃，20min。反应结束后对产物进行磁珠法纯化。
[0081]
其中，idt udi接头(15μm)、ligation buffer、dna ligase购自那昂达，货号1003227，ligase货号1002103。
[0082]
4.4文库富集。反应体系如下表9所示。
[0083]
表9文库富集
[0084][0085][0086]
扩增反应程序如下：98℃，2min；98℃，15s，60℃，30s，72℃，30s，7cycles；72℃，2min；4℃，贮存。反应结束后对产物进行磁珠法纯化。
[0087]
其中，2x hifi pcr master mix购自那昂达，货号1002103。
[0088]
5.将dna文库进行模板制备以用于测序，得到下机数据，并对下机数据进行生物学分析。
[0089]
实施例3重复性检测
[0090]
选取一例经临床症状和相关实验室检查诊断为sa的患者，其中，经一代测序检测为alas2基因c.1355g>a核苷酸突变，其氨基酸突变为p.r452h。
[0091]
采用本技术所述的引物组合物及试剂盒重复检测该样本三次，具体步骤及检测方法如下：
[0092]
1.dna提取：利用天根dna提取试剂盒(货号：dp318
‑
03)提取骨髓样本的全基因组dna。
[0093]
2.根据实施例1和2提供的引物组合物及试剂盒对提取的dna进行复合pcr扩增。
[0094]
3.将扩增产物制备成可供ion torrent测序平台测序的dna文库，具体操作步骤详见life公司试剂盒(名称：ion ampliseqtm library kit，货号：4480441)的使用说明书。
[0095]
4.对所获得的dna文库进行模板制备，进而测序，得到下机数据：将构建好的文库经油包水处理后在ion torrent平台上进行高通量测序，油包水处理方法和高通量测序方法参考高通量测序仪ion torrent以及其配套设备one touch的使用说明书进行。
[0096]
5.对下机数据进行生物信息学分析：首先，使用ion report软件(v4.6,thermo fisher,carlsbad,ca,usa)过滤低质量的测序片段，并将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html)，使用torrent variant caller(v4.6.0.7)子程序检测突变位点，软件参数使用的是默认的设置。此软件已经被优化用于处理ion torrent测序平台特有的错误类型。最后对找出的突变包括snp和indel使用annovar(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)软件进行注释，注释内容包括突变在基因组中的位置，关联的基因，基因外显子编号，核苷酸水平变异，对应的蛋白水平变异，以及该突变在dbsnp数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，千人基因组数据库1000genomes(http://www.1000genomes.org/)，外显子组整合数据库exac(http://exac.broadinstitute.org/)和人类基因突变数据库hgmd(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)中的注释，polyphen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和sift(http://sift.jcvi.org/)功能预测结果等。
[0097]
其中，如下表10所示，三次检测结果均为alas2基因c.1355g>a核苷酸突变阳性，检测结果如图1所示，表明本技术所述的引物组合物及试剂盒具有较好的重复性。
[0098]
表10重复性检测结果
[0099]
检测结果第一次第二次第三次突变基因alas2alas2alas2核苷酸改变c.1355g>ac.1355g>ac.1355g>a氨基酸改变p.r452hp.r452hp.r452h突变位置nm_000032:exon9nm_000032:exon9nm_000032:exon9测序reads数893751322897641696890480291靶标区域覆盖度98.56％98.56％98.55％平均测序深度(
×
)109110961087均一性98.56％98.55％98.53％
[0100]
实施例4特异性检测
[0101]
4.1.利用实施例1给出的引物及浓度，采用实施例2给出的扩增体系和扩增程序对实施例3提取的dna样本进行扩增，使用ion torrent进行测序，并进一步分析。
[0102]
4.2.将实施例1给出的引物浓度均修改为0.05μm，采用相同的扩增体系和扩增程序对实施例3提取的dna样本进行扩增，使用ion torrent进行测序，并进一步分析。
[0103]
4.3.将实施例1给出的引物浓度均修改为0.2μm，采用相同的扩增体系和扩增程序对实施例3提取的dna样本进行扩增，使用ion torrent进行测序，并进一步分析。
[0104]
上述4.1、4.2、4.3的检测结果如下表11所示。
[0105]
表11特异性检测结果
[0106][0107][0108]
由表7的检测结果可知，引物浓度过低或过高其测序reads数、测序深度及均一性等结果都较差。
[0109]
实施例5灵敏度检测
[0110]
根据实施例2提供的试剂盒，分别采用实施例3提取的不同浓度的dna样本进行扩增，使用ion torrent进行测序，并进一步分析。其中，dna模板浓度分别为：5ng/μl、2.5ng/μl、1.25ng/μl、0.625ng/μl、0.3125ng/μl、0.15625ng/μl。
[0111]
检测结果如下表8所示：
[0112]
表8灵敏度检测结果
[0113][0114]
由该结果可知：本发明提供的复合扩增体系可以对浓度为0.15625ng/μl的样本进行准确检测，灵敏度为0.64％，远优于一代测序的10％，识别能力强。
[0115]
实施例6准确性检测
[0116]
选取在见康华美医学诊断中心经临床症状和相关实验室检查诊断为sa的患者共30例，各收集3ml患者外周血提取基因组dna待测，该检测经过中心伦理委员会批准，并经患者同意。
[0117]
根据实施例2提供的试剂盒及其使用方法进行样本检测，检测结果如下表9所示。
[0118]
表9准确性检测结果
[0119]
[0120][0121]
由上表可知，上述30例患者中检测到均为sa，其中alas2基因突变的遗传性铁粒幼细胞贫血患者19例，sf3b1基因突变的获得性铁粒幼细胞贫血患者11例，而且得出的结论与临床最终诊断相一致。由此可见，使用该检测试剂盒能够有效地对铁粒幼细胞贫血患者进行诊断，具有诊断快速、准确、获得信息量大的特点。
[0122]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。