Dt11染色体区段及该区段包含的分子标记组合在调控棉花黄萎病抗性中的应用

dt11染色体区段及该区段包含的分子标记组合在调控棉花黄萎病抗性中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，尤其涉及dt11染色体区段及该区段包含的分子标记组合在调控棉花黄萎病抗性中的应用。


背景技术：

2.棉花是重要经济作物和纺织工业原料，其全产业链涉及数千万产业工人、棉农等从业人员，因此，棉花产业发展十分重要。高产优质是棉花生产的永恒主题，抗病是高产优质重要保障。培育抗病、优质、高产新品种是我国棉花产业发展的重大需求。近年来，枯萎病和黄萎病依然严重，是棉花高产稳产的重大障碍；育种家常常选择综合性状好的材料通过杂交回交进行品种选育，造成推广品种遗传基础越来越窄，加之对现有性状突出的种质资源遗传背景了解有限、特异种质匮乏，严重制约了突破性抗病新品种的育成。
3.棉花与黄萎病菌互作是一个极其复杂的过程，挖掘控制棉花抗病性状的重要区段或基因是培育抗病品种的重要基础。有关陆地棉对黄萎病的抗性遗传研究存在多种不同结论，主要有如下观点：(1)陆地棉对单一黄萎病菌系的抗性为质量性状遗传，受主效基因控制(潘家驹等,1994；马峙英等,1998；l
ü
dersl et al.,2008)。(2)陆地棉对黄萎病的抗性遗传为数量性状以加性效应为主，其次是显性效应(韩祥铭等,2001；王红梅等,2005)。多数研究认为棉花对黄萎病的抗性位点主要位于d亚基因组，存在有抗病qtl簇和抗黄萎病基因组热点区域(abdelraheem et al.,2107)。前人在上述研究中，定位出一些棉花抗黄萎病qtl，但基于的作图群体绝大多数是陆海或陆陆杂种f2、f2:3群体、回交低世代(bc1，bc2，bc2s1)群体、ril群体，这些作图群体遗传背景复杂，存在qtl之间的互作、上位性效应及qtl与遗传背景间的互作，很难对单个qtl进行准确鉴定和定位(ferreira et al.,2006)。其次，定位这些qtl的遗传图谱是根据传统的遗传连锁分析获得的，标记与qtl间的位置关系实际上是特定群体中的一种连锁不平衡状态，由于不同研究所利用的分离群体及分子标记彼此各异，难以进行遗传图谱的整合和不同qtl定位结果的比较。再有，上述定位研究所用的群体多是由陆海或陆陆杂交后代衍化而来，虽然陆海杂种的遗传图谱已相对饱和，但对于栽培陆地棉和海岛棉而言，二者在抗病性、产量、纤维品质等多方面具有明显差异，而且海陆杂交后代容易分离，性状难以稳定，使得利用异源四倍体棉种的图谱鉴定与定位的棉花重要农艺性状难于直接应用(shappleyzwet al.,1998；ulloa et al.,2000；ulloa et al.,2002)。另一方面，由于陆地棉品种间的遗传差异少，分子标记多态性低，导致陆地棉种内遗传图谱覆盖率低且标记数远少于种间图谱，定位出的qtl与标记间距离较远(fang et al.,2017)，定位的结果也多停留在理论研究，难以直接应用于棉花抗病分子标记辅助育种或抗病基因聚合育种。因此开发大量新型分子标记，构建覆盖陆地棉全基因组的种内高分辨率遗传连锁图谱，对陆地棉抗病性等复杂性状进行qtl挖掘、基因精细定位就显得尤为重要。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的问题，本发明利用全基因组关联分析发掘了与陆地棉黄萎病抗性关联的dt11染色体区段及snp分子标记，为分子标记辅助选择及聚合育种改良棉花黄萎病抗性奠定重要基础。
5.第一方面，本发明提供了dt11染色体区段在调控棉花黄萎病抗性中的应用，所述dt11染色体区段为dt11号染色体61.90～62.26mb的区间。
6.第二方面，本发明提供一种分子标记组合，所述分子标记组合包括如下18个snp标记中的任意一种或多种：
7.其中，snp标记hebau_gh_vw_d11_61909252位于dt11染色体第61909252位，多态性为a/g；
8.snp标记hebau_gh_vw_d11_61985621位于dt11染色体第61985621位，多态性为c/t；
9.snp标记hebau_gh_vw_d11_61994350位于dt11染色体第61994350位，多态性为g/t；
10.snp标记hebau_gh_vw_d11_62006918位于dt11染色体第62006918位，多态性为c/t；
11.snp标记hebau_gh_vw_d11_62051411位于dt11染色体第62051411位，多态性为c/t；
12.snp标记hebau_gh_vw_d11_62066191位于dt11染色体第62066191位，多态性为g/a；
13.snp标记hebau_gh_vw_d11_62073571位于dt11染色体第62073571位，多态性为a/g；
14.snp标记hebau_gh_vw_d11_62100632位于dt11染色体第62100632位，多态性为c/t；
15.snp标记hebau_gh_vw_d11_62110575位于dt11染色体第62110575位，多态性为g/c；
16.snp标记hebau_gh_vw_d11_62115583位于dt11染色体第62115583位，多态性为t/c；
17.snp标记hebau_gh_vw_d11_62124035位于dt11染色体第62124035位，多态性为c/t；
18.snp标记hebau_gh_vw_d11_62124773位于dt11染色体第62124773位，多态性为a/c；
19.snp标记hebau_gh_vw_d11_62230944位于dt11染色体第62230944位，多态性为g/c；
20.snp标记hebau_gh_vw_d11_62237739位于dt11染色体第62237739位，多态性为c/t；
21.snp标记hebau_gh_vw_d11_62240629位于dt11染色体第62240629位，多态性为t/c；
22.snp标记hebau_gh_vw_d11_62244269位于dt11染色体第62244269位，多态性为t/
c；
23.snp标记hebau_gh_vw_d11_62252477位于dt11染色体第62252477位，多态性为t/c；
24.snp标记hebau_gh_vw_d11_62256604位于dt11染色体第62256604，多态性为g/a。
25.以上18种snp标记均位于所述dt11染色体区段内。
26.进一步地，所述分子标记组合包括全部18种分子标记。
27.本发明进一步提供用于扩增所述分子标记组合的引物组合。
28.本发明进一步提供包括所述引物组合的试剂盒。
29.本发明进一步提供所述分子标记组合、所述引物组合和所述试剂盒在棉花抗黄萎病早期预测和筛选中的应用。
30.本发明进一步提供所述分子标记组合、所述引物组合和所述试剂盒在棉花抗黄萎病品种选育中的应用。
31.第三方面，本发明提供一种检测棉花黄萎病抗性的方法，包括：
32.检测待测棉花中如所述分子标记组合中任意一个或多个分子标记的多态性；
33.根据多态性检测结果判断所述待测棉花的黄萎病抗性。
34.进一步地，所述根据多态性检测结果判断所述待测棉花的黄萎病抗性为：
35.在所述分子标记组合中，18个snp标记中具备优势等位基因的snp标记数量更多的棉花具备更高的黄萎病抗性；
36.其中，snp标记hebau_gh_vw_d11_61909252的优势等位基因为a；
37.snp标记hebau_gh_vw_d11_61985621的优势等位基因为c；
38.snp标记hebau_gh_vw_d11_61994350的优势等位基因为g；
39.snp标记hebau_gh_vw_d11_62006918的优势等位基因为c；
40.snp标记hebau_gh_vw_d11_62051411的优势等位基因为c；
41.snp标记hebau_gh_vw_d11_62066191的优势等位基因为g；
42.snp标记hebau_gh_vw_d11_62073571的优势等位基因为a；
43.snp标记hebau_gh_vw_d11_62100632的优势等位基因为c；
44.snp标记hebau_gh_vw_d11_62110575的优势等位基因为g；
45.snp标记hebau_gh_vw_d11_62115583的优势等位基因为t；
46.snp标记hebau_gh_vw_d11_62124035的优势等位基因为c；
47.snp标记hebau_gh_vw_d11_62124773的优势等位基因为a；
48.snp标记hebau_gh_vw_d11_62230944的优势等位基因为g；
49.snp标记hebau_gh_vw_d11_62237739的优势等位基因为c；
50.snp标记hebau_gh_vw_d11_62240629的优势等位基因为t；
51.snp标记hebau_gh_vw_d11_62244269的优势等位基因为t；
52.snp标记hebau_gh_vw_d11_62252477的优势等位基因为t；
53.snp标记hebau_gh_vw_d11_62256604的优势等位基因为g。
54.本发明具备如下有益效果：
55.本发明发现了dt11号染色体61.90～62.26mb的区间与棉花黄萎病的调控关系密切，进一步在该区间内开发了多个snp分子标记。根据这些snp分子标记对401份核心种质进
行基因分型，含有突变型snp位点的棉花黄萎病病情指数均值(22.4)显著低于含有参考型snp位点的病情指数均值(39.7)。调查18个优异snp位点在不同育成年代棉花中的频率，发现现代品种中优异snp位点的平均频率(12.7％)显著高于早期育成品种中优异snp位点的平均频率(4.4％)，且新育成的农大棉23号(jnd23)和农大棉24号(jnd24)含有这些优异snp位点，其黄萎病抗性表现优良。这说明了本发明提供的分子标记组合可以用于棉花黄萎病抗性的早期预测和筛选，进而可以用于抗病棉花新品种的选育。
附图说明
56.图1为本发明实施例1提供的含有优异snp位点的现代育成品种j的田间黄萎病抗性；其中tm
‑
1为早期育成陆地棉品种，jnd23为现代陆地棉品种冀农大23号，jnd24为现代陆地棉品种冀农大24号。
具体实施方式
57.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
58.实施例1
59.本实施例通过以下步骤的方法获得陆地棉黄萎病抗性相关的snp标记：
60.1、黄萎病抗性鉴定：401份陆地棉核心种质分别在人工气候室进行种植，每份材料保留35株整齐一致的幼苗，在幼苗生长至二叶一心期接种黄萎病菌孢子悬浮液(1
×
107cfu/ml)，采用底部定量注射菌液法对每株幼苗接种8ml菌液，农大601和冀棉11号分别作为抗病和感病对照，试验设置4次重复。采用通用的5级分类法，对接菌后20天和25天的棉苗进行病级调查，分级方法如下：
61.0级，植株无病症；
62.1级，子叶发病，真叶无病症；
63.2级，子叶以上的第一片真叶发病；
64.3级，两片及以上真叶发病，心叶无病症；
65.4级，植株生长点或整株枯死。
66.病情指数(disease index,di)计算公式为：di＝100
×
∑(各病级病株数
×
相应病级)/(调查总株数
×
4)。
67.根据病情指数将抗病性划分为免疫、高抗、抗病、耐病和感病5个等级，其对应的di分别为：di＝0；0<di≤10.0；10.0<di≤25.0；25.0<di≤50.0；di>50.0。
68.2、snp的检测：本发明加深测序深度，对401份陆地棉核心种质基因组重测，获得11
×
测序深度的基因组重测序结果。利用base calling分析及低质量碱基过滤，获得有效原始dna序列数据。有效的高质量测序数据通过bwa软件比对到棉花参考基因组tm
‑
1，比对结果经samtools去除重复，得到样品有效高质量序列。采用gatk软件进行群体snp的检测。利用贝叶斯模型检测群体中的多态性位点，对gatk结果snps进行过滤，以获得高质量的snps。
69.3、陆地棉黄萎病抗性全基因组关联分析：陆地棉抗黄萎病性状全基因组扫描(gwas)定位，对步骤(1)所得的陆地棉黄萎病抗性鉴定结果和步骤(2)所得的基因型数据，采用genome
‑
wide efficient mixed
‑
model association(gemma)统计分析软件的混合线性模型进行统计分析，统计模型为：
70.y＝xα+zβ+wμ+e
71.其中，y为表型性状，x为固定效应的指示矩阵，α为固定效应的估计参数；z为snp的指示矩阵，β为snp的效应；w为随机效应的只是矩阵，μ为预测的随机个体，e是随机残差，服从e～(0，δ
e2
)。该模型中，通过在μ中加入亲缘关系矩阵来校正群体分析。分析发现有共有18个snp与陆地棉黄萎病抗性显著关联，见表1。
72.其中，参照系的“效应值”值为“0”，定义与参照系相比，snp位点突变后病情指数较参照系变大为负效应(
‑
)，反之为正效应(+)。“观测数值”是指在401份核心种质资源中具有该snp位点的资源数目。
73.4、结果分析：本发明获得同时在两个计算值下稳定出现的与陆地棉黄萎病抗性关联的snp分子标记18个(如表1所示)。利用401份棉花核心种质在两种不同致病力的黄萎病菌鉴定下的病情指数的平均值对上述snp的效应进行了验证，结果显示所有的snp表现出对黄萎病抗性变异具有显著的影响；同时调查了现代品种与早期品种中18个优异snp变异的频率，发现现代品种中的优异snp的等位变异显著高于早期品种(如表2所示)，且新育成的冀农大23号和冀农大24号品种中含有18个优异等位变异(如表3所示)，从图1所示的对比结果中可以看出，冀农大23号(jnd23)和冀农大24号(jnd24)相较于tm
‑
1(tm
‑
1为早期育成陆地棉品种，其18个snp位点均不是优异snp)而言，在黄萎病菌浸染的状态下表现出更好的生存状态，表明这些优异snp变异可以直接用于棉花抗黄萎病遗传改良。
74.综上所述，本发明提供的与陆地棉黄萎病抗性关联的snp分子标记可以用于棉花黄萎病抗性的早期预测和筛选，还可以用于抗病棉花新品种的选育。其直接以dna的形式表现，在棉花的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制、不存在表达与否等问题；表现为中性，不影响目标性状的表达；适于快速、规模化筛查。基因组筛选中snps往往只需+/
‑
的分析，而不用分析片段的长度，利于发展自动化技术筛选或检测snps。
75.表1与陆地棉黄萎病抗性关联的snp标记
76.[0077][0078]
表2现代品种和早期品种优异等位snp频率
[0079]
snp位点现代品种(％)早期品种(％)hebau_gh_vw_d11_6190925213.73.7hebau_gh_vw_d11_6198562113.74.6hebau_gh_vw_d11_6199435013.74.1hebau_gh_vw_d11_6200691812.63.7hebau_gh_vw_d11_6205141113.25.5hebau_gh_vw_d11_6206619113.25.0hebau_gh_vw_d11_6207357113.24.1hebau_gh_vw_d11_6210063211.54.1hebau_gh_vw_d11_6211057511.54.1hebau_gh_vw_d11_6211558313.74.1hebau_gh_vw_d11_6212403512.64.6hebau_gh_vw_d11_6212477312.64.1hebau_gh_vw_d11_6223094412.14.6hebau_gh_vw_d11_6223773912.14.6hebau_gh_vw_d11_6224062912.14.6hebau_gh_vw_d11_6224426912.64.6hebau_gh_vw_d11_6225247712.14.6平均值12.74.4
[0080]
表3现代育成品种中优异snp鉴定
[0081][0082][0083]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。