玉米酪蛋白激酶2CK2α2、其编码基因基于高温胁迫响应的应用

玉米酪蛋白激酶2ck2
α
2、其编码基因基于高温胁迫响应的应用
技术领域
1.本发明涉及玉米抗高温胁迫技术领域，具体涉及玉米酪蛋白激酶2ck2α2、其编码基因基于高温胁迫响应的应用。


背景技术：

2.玉米是我国第一大粮食作物，产量与面积均居粮食作物之首，在国家粮食安全中发挥着重要作用。但随着全球气候的变暖，近些年来高温热害频发，对玉米生产造成了严重的损失。相关研究表明，玉米生殖生长的最适温度为25～28℃，较高温度可加快其生长和发育，缩短其生育期，但极端高温则阻碍其生长和发育，如32℃以上的高温不利于其干物质积累，而连续超过5天35℃以上的高温会严重影响玉米开花、授粉与灌浆，出现秃尖、满天星、空杆等畸形穗现象。2013年7、8月份连续高温天气有23天，突破了中国连续高温历史纪录；2019年仅7月份超过35℃以上高温天气就有22天，而中下旬连续高温天气有14天，且田间最高气温可超过42℃，而该时间段则正是玉米生殖生长的关键时期，对玉米的产量与品质造成了严重的影响，引起了相关部门、农民与科技工作者的广泛关注。
3.应对之道，选育耐高温的玉米品种/系是重要的途径之一。而玉米耐热性是复杂的数量性状，筛选优异耐高温自交系、了解其遗传规律并鉴定功能基因是玉米耐高温育种的关键环节。
4.因此，在玉米全基因组水平上开展耐高温性状重要基因的挖掘、筛选，对关键调控基因进行功能解析并加以利用，不仅可促进现代生物技术与常规育种的有机结合，以推进玉米育种从
ꢀ“
经验育种”向“精准育种”转变，而且可为培育耐高温玉米品种提供重要的基因资源与技术支撑，从而为分子育种以及基因组选择育种奠定基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种玉米酪蛋白激酶2ck2α2、其编码基因基于高温胁迫响应的应用，以解决当前玉米耐高温基因资源及种质资源匮乏的技术问题。
6.酪蛋白激酶2ck2在植物生长、发育和胁迫响应中发挥重要的作用，参与了生理时钟、光周期、植物花发育和aba/逆境相关基因表达调控等许多重要的生理过程。结合本发明人前期大量关于玉米高温调控基因研究的经验，本发明进一步对玉米酪蛋白激酶的胁迫响应功能进行了系统的梳理和深入的探索研究，最终发现并确定，玉米酪蛋白激酶2α亚基能够响应高温胁迫。
7.基于玉米酪蛋白激酶2α亚基编码基因（如seq id no.1所示），构建了过表达载体oe
‑
zmck2α2，并利用玉米原生质体瞬时转化体系转化入玉米叶片原生质体，高温胁迫试验表明，过表达zmck2α2后，显著抑制了高温诱导的mda含量的增加，提高了高温诱导的cat活性的升高。
8.并进一步构建了pfgc5941
‑
zmck2α2过表达载体，利用玉米遗传转化技术获得
zmck2α2过表达纯合株系，并使用qrt
‑
pcr检测筛选出高表达量的株系，以作为选育耐高温的玉米品种/系的育种材料。
9.此外，利用所得的zmck2α2过表达株系进行了高温胁迫下的表型鉴定，并研究测定了高温胁迫下zmck2α2的过表达转基因植株中mda含量和抗氧化防护酶cat活性，从而初步解析了zmck2α2在高温胁迫的作用机制。
10.本发明的主要有益技术效果在于：筛选并确定了玉米酪蛋白激酶2α亚基能够响应高温胁迫，并初步解析了其在高温胁迫的作用机制，有助于理解玉米耐热机制，可为培育耐高温玉米品种提供重要基因资源及相关的种质资源。
附图说明
11.图1为高温胁迫对玉米zmck2的4个α亚基表达的影响对比图，其中zmck2α2的表达受高温胁迫显著诱导；数据表示平均值
±
sd（3次生物学重复）。
12.图2为zmck2α2的启动子分析图谱，图中箭头区域代表zmck2α2基因atg起始密码子上游的2000 bp序列，括号中表示的是顺式作用元件序列，正、负号分别表示正义链和反义链，不同的顺式作用元件处于不同链的不同位置。
13.图3为高温胁迫下瞬时沉默和过表达zmck2α2对玉米原生质体中生理指标的测定，其中，a和b为瞬时沉默zmck2α2后在高温胁迫下对玉米原生质体中cat的活性和mda含量的测定；c和d为瞬时过表达zmck2α2后在高温胁迫下的对玉米原生质体中cat的活性和mda含量的测定；其中，ck为对照；h为原生质体高温胁迫处理；rnai
‑
zmck2α2+h为原生质体经转化dszmck2α2之后高温胁迫处理；oe
‑
zmck2α2+h为原生质体经转化过表达载体oe
‑
zmck2α2之后高温胁迫处理；平均值为
±
se（n=6），同一字母表示的均值在p<0.05时无显著性差异。
14.图4为 qrt
‑
pcr检测转基因株系zmck2α2的表达量对比图。
15.图5为zmck2α2过表达株系增强玉米耐热性对比照片。
16.图6为zmck2α2的过表达株系及其野生型高温胁迫恢复3天的成活率统计图。
17.图7为zmck2α2过表达转基因植株在高温胁迫下mda的含量和过氧化氢酶cat活性的测定。
具体实施方式
18.下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
19.在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试验材料及试剂如无特别说明，均为市购；所涉及的试验、检测方法，如无特别说明，均为常规方法。
20.酪蛋白激酶ck2(casein kinase 2, ck2)是一种在真核生物中广泛存在且功能保守的的多底物的磷酸化丝氨酸(ser)/苏氨酸(thr)的蛋白激酶。已知玉米中有4个ck2α亚基，包括zmck2α1（grmzm2g143602）、zmck2α2（grmzm2g141903）、zmck2α3（grmzm5g845755）和zmck2α4（grmzm2g047855）。
21.酪蛋白激酶2ck2在植物生长、发育和胁迫响应中发挥重要的作用，参与了生理时
钟、光周期、植物花发育和aba/逆境相关基因表达调控等许多重要的生理过程。但其是否能够响应高温胁迫或是哪种α亚基响应高温胁迫仍不为人知。因此，本发明对酪蛋白激酶的胁迫响应进行了系统的梳理和深入的研究，确定了玉米中响应高温的ck2α亚基（如seq id no.2所示）并解析其在高温胁迫的作用机制，将有助于理解玉米耐热机制，为培育耐高温玉米品种提供了重要的基因资源。以下为关于zmck2α2高温响应的主要研究过程及验证试验的实施例。
22.实施例一：玉米中响应高温的酪蛋白激酶2α亚基的鉴定1. qrt
‑
pcr鉴定玉米中受高温影响的酪蛋白激酶2α亚基为了确定zmck2α1、α2、α3、α4是否受高温影响，对玉米杂交品种郑单958三叶期幼苗分别进行0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和10 h的高温胁迫处理，然后提取第二片叶的总rna，qrt
‑
pcr分析其表达；研究结果显示zmck2α2和zmck2α3明显受到高温胁迫的诱导，且zmck2α2的表达增加最为显著，在高温处理4 h时表达量最高，但高温胁迫对zmck2α1和zmck2α4的表达基本没有影响（见图1）。
23.2. zmck2α2基因启动子区域顺式作用元件的分析为了进一步分析zmck2α2是否会响应胁迫，对其启动子顺式作用元件进行了分析。首先在ncbi找到zmck2α2的基因组序列及其转录起始位点，截取转录起始位点上游的2 kb序列，即为zmck2α2的启动子序列。将启动子序列放入plantcare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）数据库中分析其启动子元件，结果显示如图2所示zmck2α2有1个与非生物胁迫相关的作用元件（tc
‑
rich repeat，gttttcttac）和5个与响应aba的作用元件（abre）。
24.以上结果表明，zmck2α2具有响应高温，并且与植物的非生物胁迫特别是高温胁迫有关。
25.实施例二：zmck2α2基因的耐高温功能检验丙二醛（mda）含量是植物细胞膜质过氧化程度的体现，丙二醛含量高，说明植物细胞膜质过氧化程度高，细胞膜受到的伤害严重。而h2o2含量的积累，可以直接或者间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶（cat）可以清除h2o2，是植物体内重要的酶促防御体系之一。为确定zmck2α2是否参与玉米对高温的抵制，利用玉米原生质体瞬时转化体系，将过表达载体oe
‑
zmck2α2和zmck2α2的双链rna和蒸馏水分别转化入玉米叶片原生质体中，室温孵育12 h，然后在高温胁迫（38℃）下孵育30 min。最后，对其在高温胁迫下原生质体中mda含量和抗氧化防护酶cat活性进行检测。
26.结果如图3所示，过表达zmck2α2后，显著抑制了高温诱导的mda含量的增加，提高了高温诱导的cat活性的增加；rnai干扰zmck2α2表达后显著升高了高温诱导的mda含量的增加，抑制了高温诱导的cat活性的增加，进而能有效抵制高温胁迫产生的伤害。
27.实施例三：基于zmck2α2的转基因植株的耐高温功能鉴定为了进一步探究zmck2α2在高温胁迫下的功能，利用玉米遗传转化技术获得了zmck2α2过表达纯合株系。首先通过同源重组的方法将zmck2α2重组至含有35s启动子的双元表达载体pfgc5941，然后将测序结果正确的质粒转化至农杆菌gv3101内，最后利用农杆菌介导的玉米成熟胚原位转化法将pfgc5941
‑
zmck2α2载体转化玉米，经除草剂筛选后获得
t0代阳性植株，再自交至t2代并得到了转基因植株的果穗。
28.1. 利用qrt
‑
pcr检测转基因株系zmck2α2的表达量为了确定过表达转基因中zmck2α2的表达量是否提高，对获得的t2代转基因株系，利用草铵膦基因（basta）为标记进行转基因株系的筛选，并使用qrt
‑
pcr（引物序列如seq id no.3～4所示，参见表1）对zmck2α2的基因进行检测（见图4），筛选出三个表达量较高的株系（oe1、oe2和oe3）。正常情况下，zmck2α2过表达株系oe1、oe2和oe3与其野生型wt相比，zmck2α2的表达量分别增加了2.5、2.6和2.8倍。
29.2. 玉米zmck2α2的过表达转基因在高温胁迫下表型鉴定为了进一步研究zmck2α2在玉米耐热性中的作用，利用盆栽试验对转基因植株在高温胁迫下的表型及生存率进行了测定。结果如图5所示，在高温处理第三天，野生型就有明显的发黄，卷曲现象。高温处理第5天，野生型部分出现枯死、干焦现象，而过表达植株虽然叶尖有些发黄，但仍然生长良好。高温处理第7天，野生型绝大部分已经枯死，过表达植株叶片发黄，但仍然生长良好。此外，将高温处理7天后的玉米植株置于正常条件下进行培养（白天28℃/14h，夜晚22℃/10h），恢复3天后，统计野生型和过表达植株的存活率，结果显示，野生型只有12%的成活率，而3个过表达株系的成活率均超过了90%（图6）。这些结果表明，相对于野生型zmck2α2过表达的株系具有更高的耐热性。
30.3.在高温胁迫对zmck2α2的过表达转基因植株中mda含量和对抗氧化防护酶cat的测定为了进一步明确zmck2α2在高温胁迫下的抵御作用，对其过表达株系在高温胁迫下测定了mda的含量和cat的活性。结果如图7所示，过表达zmck2α2株系明显抑制了高温诱导的mda含量的增加，提高了高温诱导的cat活性的增加，从而能有效抵制高温胁迫产生的伤害。
31.上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，或者是对相关方法、步骤及材料进行等同替代，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。