基于DNA靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法

基于dna靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法
技术领域
1.本发明属于食品检测技术领域，尤其是涉及一种基于dna靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法。


背景技术：

2.肉类和肉制品是发达国家和发展中国家人类的重要食物来源。肉类可以提供许多重要的营养物质，如蛋白质、脂肪、矿物质和维生素。虽然有各种国家和国际法律来监督肉类和肉制品的质量和安全，但肉类掺假仍然普遍存在。大多数肉类掺假是出于经济动机，如羊肉中低成本添加鸭肉，导致消费者遭受经济损失。少量掺假可能是由于加工过程中的偶然污染。肉类掺假都可能导致严重的公共健康风险。从农民到监管者，从生产者到消费者，肉类掺假已成为生产和分销过程中所有肉类产业链的一个问题。
3.食品掺假检测有不同的物理技术，包括微观和宏观视觉结构分析，以及分析食品的物理特性(如形态性状、质地、容重、溶解度等)。显微和宏观方法与化学图谱的结合同时提供了鉴定和鉴别。一些研究表明，这些方法可以用于检测不同食品的潜在欺骗，通过光学显微镜可以检测到产品的掺假。利用宏观和微观特征的视觉结构分析在作为掺假类型之一检测中非常有用。用于掺假检测的化学和生化技术，有各种方法可分为四组：色谱技术、光谱技术、免疫技术和电泳技术。一般来说，化学和/或生化技术与物理技术的区别在于它们更准确，可以在较低浓度下检测掺假/污染物。但它们的缺点是需要训练有素的人员，而且在工业适用性方面成本高昂。
4.在过去的二十年里，已经针对不同的标记建立或优化了肉类和肉制品的真实性检测技术，例如基于脱氧核糖核酸(dnas)的聚合酶链反应(pcrs)、基于蛋白质的免疫学技术、基于特定代谢物的光谱技术等等，这些技术存在样品消耗量大，检测不准确等缺点。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题与不足，本发明提供一种基于靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法，能准确检测出肉类中的成分，进而鉴定肉类掺假情况。
6.本发明提供的具体技术方案是：一种基于靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法，包括将肉类样品双链基因组解旋以获得单链的靶向基因片段的步骤；以所述单链的靶向基因片段为目标模板序列，与相对应的分子信标发生杂交反应，产生荧光信号的步骤；将测量到的荧光强度换算为相对荧光比的步骤。
7.进一步地，所述将肉类样品双链基因组解旋以获得单链的靶向基因片段的步骤包括：
8.称取待测肉类样品并将其打碎处理成细胞悬液，置于10000r/min离心1min，倒尽上清，加200μl缓冲液ga，充分振荡；
9.再加入20μl蛋白酶k溶液后置于56℃直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
10.再加入200μl缓冲液gb，充分混匀后置于70℃放置5min至溶液变清亮；加入200μl无水乙醇并充分振荡15s，然后将所有溶液转移至一个干净的吸附柱cb3中，12000r/min离心30s，弃废液，并将吸附柱cb3重新放回收集管中；
11.向吸附柱中加入500μl缓冲液gd，12000r/min离心30s，弃废液，并将吸附柱cb3重新放回收集管中。向吸附柱中加入600μl漂洗液pw，12000r/min离心30s，弃废液，并将吸附柱cb3重新放回收集管中，然后12000r/min离心2min，弃废液，并将吸附柱cb3置于室温放置2min以彻底晾干残余的漂洗液；
12.将吸附柱cb3转入另外一个干净的离心管，向吸附膜中间部位滴加适量te缓冲液，放置2min～5min，12000r/min离心2min，所得溶液即为单链的靶向基因片段溶液。
13.进一步地，以所述单链的靶向基因片段为目标模板序列，与相对应的分子信标发生杂交反应，产生荧光信号的步骤包括：
14.将isothermal amplification缓冲液ⅱ原液、mgso
4 4mm、甜菜碱1m、dntp0.2～1.0mm、上下游引物比例为1∶10、bst dna聚合酶2～20u和解链的单链靶向基因片段溶液，再加纯净水至溶液总体积为25ul；
15.再将所述溶液在65℃的恒温水浴锅中反应5min，然后升高温度至80℃反应5min，加入分子信标，在37℃、激发波长490nm以及发射波长521nm的条件下检测反应体系荧光强度的变化。
16.进一步地，所述将测量到的荧光强度换算为相对荧光比的步骤包括：
17.△
相对荧光比＝fx/fmax，其中fx为所测肉类样品的荧光强度，fmax为该组最强肉类样品荧光强度，根据
△
相对荧光比鉴定肉类组成成分。
18.进一步地，所述分子信标是5端修饰有fam基团，3端修饰有dabcyl基团的功能分子。
19.进一步地，所述靶向基因片段来源于肉类样品的线粒体dna。
20.进一步地，所述线粒体dna线粒体d
‑
环区、细胞色素b(cytb)基因、细胞色素c氧化酶亚基i、ii和iii(coi，和coii)基因、atpase亚基6和8(atpase6和atpase8)、12srrna和16srrna。
21.所述肉类样品包括：牛肉、猪肉、马肉、羊肉、鸡肉、鸭肉。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.本发明提供的基于靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法，包括将肉类样品双链基因组解旋以获得单链的靶向基因片段的步骤；以所述单链的靶向基因片段为目标模板序列，与相对应的分子信标发生杂交反应，产生荧光信号的步骤；将测量到的荧光强度换算为相对荧光比的步骤。该方法简单，敏感性和可靠性高，能准确检测出肉类中的成分，进而鉴定肉类掺假情况。
附图说明
24.附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
25.图1为荧光强度
‑
dntp浓度变化图
26.图2为荧光强度
‑
bst dna浓度变化图
27.图3为鸡肉检测体系中的
△
相对荧光比
28.图4为牛肉检测体系中的
△
相对荧光比
29.图5为羊肉检测体系中的
△
相对荧光比
30.图6为猪肉检测体系中的
△
相对荧光比
31.图7为鸭肉检测体系中的
△
相对荧光比
32.图8为马肉检测体系中的
△
相对荧光比
具体实施方式
33.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
34.dna是储存、复制和传递遗传信息的主要材料。dna存在于单个动物的所有组织中，比蛋白质更保守。众所周知，dna对世界上每个生物体来说都是独一无二的，它可以作为检测食品掺假的有效工具。因此，以dna为基础的分子技术作为食品掺假的检测工具是更加理想的，特别是当掺假和原始食品表现出很高的物理相似性时。
35.用作鉴别肉制品掺假标记的靶基因和dna片段主要来源于线粒体dna，如线粒体d
‑
环区、细胞色素b(cytb)基因、细胞色素c氧化酶亚基i、ii和iii(coi，和coii)基因、atpase亚基6和8(atpase6和atpase8)、12srrna和16srrna。基于dha的肉类鉴定技术的发展极大地解决了消费者的诸多担忧，如食品的真实性和安全性。食品中肉类成分的真实性提高了消费者对食品的信心。快速、可靠、灵敏、特异、重现性好，可以检测到最小数量的肉类掺假。
36.肉基因源于美国国家生物技术信息中心dna序列数据库genbank中获取(genbank acc.no./source/)
37.牛肉gta ggt gca cag tac gtt ctg aag ggc cag act ggg cac atg cgg cacact cgg ctg tgt tcc ttg c
38.猪肉gga gtg tgt atc ccg tag gtg ctg ggg aca tgc aga gag tg tct gac gtgact ccc cga cct gg
39.马肉cca act tca tca tgg aca acg c gtt aaa gct tgg ctc gac acg aag tgcatc ccc gtg gcc cct ca
40.羊肉cca aca tgc ctt taa acc ctc aa gga act gta gcc ttc tga ctc g tgc ctt tcc ttc ccc gcc agt ctc
41.鸡肉tcaaagacatrctgggcttaactctcatactcacc
42.鸭肉atgaggacaaatatcgttctgaggagctaccgta
43.本发明将从实际样品中提取得到的双链基因组dna解旋以获得单链的靶向基因片段，当反应体系中存在具有较强链置换活性的bst dna聚合酶时，在不同比例上下游引物的作用下，双链的基因组dna就会在反应原料脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy
‑
ribonucleoside triphosphate，简称dntp)等存在的条件下解旋生成单链的靶向dna，即产生后续扩增检测反应的模板基因片段。单链的靶基因片段作为目标模板序列，与相对应核酸序列的分子信标发生杂交反应，茎环结构就会发生构象改变，即分子信标的环部结构序列就会与目标dna
序列进行互补配对，同时由于分子信标是5端修饰有fam基团、3端修饰有dabcyl基团的功能分子，所以，此时会由于荧光基团与淬灭基团之间距离的加大，产生荧光信号。将测量到的荧光强度换算为相对荧光比，
△
相对荧光比＝fx/fmax，其中fx为某样品的荧光强度，fmax为该组最强样品荧光强度，根据
△
相对荧光比判定肉类组成成分。
44.将肉类样品双链基因组解旋以获得单链的靶向基因片段：
45.dna提取采用试剂盒法，具体操作如下：称取待测样品并将其打碎处理成细胞悬液，置于10000r/min离心1min，倒尽上清，加200μl缓冲液ga，充分振荡。加入20μl蛋白酶k溶液后置于56℃直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入200μl缓冲液gb，充分混匀后置于70℃放置5min至溶液变清亮。加入200μl无水乙醇并充分振荡15s，然后将所有溶液转移至一个干净的吸附柱cb3中，12000r/min离心30s，弃废液，并将吸附柱cb3重新放回收集管中。向吸附柱中加入500μl缓冲液gd，12000r/min离心30s，弃废液，并将吸附柱cb3重新放回收集管中。向吸附柱中加入600μl漂洗液pw，12000r/min离心30s，弃废液，并将吸附柱cb3重新放回收集管中，然后12000r/min离心2min，弃废液，并将吸附柱cb3置于室温放置2min以彻底晾干残余的漂洗液。将吸附柱cb3转入另外一个干净的离心管，向吸附膜中间部位滴加适量te缓冲液，放置2min～5min，12000r/min离心2min，所得溶液即为dna溶液。
46.以所述单链的靶向基因片段为目标模板序列，与相对应的分子信标发生杂交反应，产生荧光信号：
47.将isothermal amplification缓冲液ii原液，mgso
4 4mm，甜菜碱1m，dntp 0.2～1.0mm，上下游引物比例为1∶10，bst dna聚合酶2～20u和单链的靶向基因片段为模板，再加纯净水至溶液总体积为25ul。将该体系的试管置于65℃的恒温水浴锅中反应5min，然后升高温度至80℃反应5min，加入分子信标，在37℃、激发波长490nm以及发射波长521nm的条件下检测反应体系荧光强度的变化。
48.实施例1
49.参见图1，bst dna聚合酶浓度为15u时，对dntp的浓度进行优化，在链延伸过程中起着重要的作用，随着dntp浓度的增加，荧光强度逐渐增强，最终达到一个常数，当dntp浓度达到0.6mm，再增加dntp的浓度，荧光强度不再增强，因此，0.6mm为dntp最佳浓度；
50.实施例2
51.参见图2，当dntp浓度为0.6mm时，对bst dna聚合酶的浓度进行优化，bst dna聚合酶的浓度在2～20u范围内，当bst dna聚合酶的浓度为15u时，荧光强度最大。因此，15u为bst dna聚合酶的最佳浓度。
52.由此可见，bst dna聚合酶的最佳浓度与实施例1中所选取的bst dna聚合酶浓度相一致，不必再重新优化dntp的浓度。
53.分析特征量：
54.在1pg
·
ml
‑1‑
100ng
·
ml
‑1范围内，荧光强度与dna浓度的对数之间存在r2＝0.9925的关系。检测限(lod)为100pg
·
ml
‑1。在300pg
·
ml
‑1‑
500ng
·
ml
‑1范围内，荧光信号与dna浓度呈正相关。该方法检测速度显著提高，从样品处理到dna提取以及检测可以在30分钟内完成。
55.实施例3实际样品检测
56.为测定各类肉源成分检测体系对模拟混合样品中真实肉源成分的检测能力，本实
验将鸡肉、牛肉、羊肉、猪肉、鸭肉和马肉制成样品。对模拟混合肉样品的基因组dna进行提取，并按照优化后的最优反应条件进行肉源成分检测实验，最后通过计算荧光强度的变化来分析肉源成分。鸡肉检测体系中鸡肉、牛肉、羊肉、猪肉、鸭肉和马肉的
△
相对荧光比分别为100％、17％、21％、9％、11％、8％，结果判定为鸡肉，参见图3，与实际样品一致；牛肉检测体系中鸡肉、牛肉、羊肉、猪肉、鸭肉和马肉的
△
相对荧光比分别为7％、100％、16％、8％、6％、14％，结果判定为牛肉，参见图4，与实际样品一致；羊肉检测体系中鸡肉、牛肉、羊肉、猪肉、鸭肉和马肉的
△
相对荧光比分别为10％、12％、100％、9％、7％、9％，结果判定为羊肉，参见图5，与实际样品一致；猪肉检测体系中鸡肉、牛肉、羊肉、猪肉、鸭肉和马肉的
△
相对荧光比分别为8％、4％、11％、100％、7％、12％，结果判定为猪肉，参见图6，与实际样品一致；鸭肉检测体系中鸡肉、牛肉、羊肉、猪肉、鸭肉和马肉的
△
相对荧光比分别为13％、5％、8％、6％、100％、3％，结果判定为鸭肉，参见图7，与实际样品一致；马肉检测体系中鸡肉、牛肉、羊肉、猪肉、鸭肉和马肉的
△
相对荧光比分别为6％、12％、8％、11％、10％、100％，结果判定为马肉，参见图8，与实际样品一致。
57.以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。