富集分离浮萍中内生固氮菌的方法

1.本发明属于细菌功能研究技术领域，更具体地说，本发明涉及一种富集分离浮萍组织中的内生固氮菌的方法。


背景技术：

2.植物内生细菌是植物生长促进与抗逆防病的天然资源菌，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景，已成为植物学、微生物学、植物保护学等多学科的研究热点。内生菌定植于植物体内，与宿主植物形成共生关系，对植物的生长和健康起到至关重要的作用。因此，有关植物内生菌的研究正成为国内外环境、生物、化学等领域的焦点。
3.植物内生菌普遍存在于植物体的各个部位且种类繁多，而人们对这些内生菌的栖息部位和种类多样性仍然知之甚少。因而，为了充分开发利用植物内生菌及其代谢产物资源，首先必须实现植物内生菌的完全、准确的分离。然而目前对植物内生菌的研究多集中于陆生植物，对水生植物的内生菌富集与分离研究相对较少。
4.随着工业和农业的飞速发展，氮磷资源的过度使用，导致河、湖等水体富营养化程度加剧。浮萍(duckweed)是一种环境适应能力强的水生植物，具有生长速率快、氮磷吸收能力强等特点。近年来研究发现，从浮萍分离的多株内生菌够提高浮萍生长速率、加快富营养化水体中氮磷的吸收和降解重金属等。因此，挖掘浮萍内生功能菌包括固氮菌、溶磷菌等对解决富营养化水体中氮素的吸收和降解重金属等水环境污染等问题，使水环境生态体系向更高水平的生物多样性和更稳定的自我调节机制方向发展提供重要意义。
5.传统的分离纯化内生固氮菌的方法是平板划线分离法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作"由点到线"稀释而达到分离的目的。具体的方法是：先是将材料表面进行灭菌，清除表面的附生菌，再置于固氮培养基中培养，用接种环将混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
6.传统的分离纯化内生固氮菌的方法，通常使用过氧化氢，乙醇，升汞等消毒剂进行表面灭菌，这样的消毒剂对植物体本身是有伤害的，会导致植物体内产生活性氧，进而也会对植物内生菌造成不良影响。也有使用配制的化学洗涤剂配合灭菌液进行表面灭菌的报道，然而，单独使用化学洗涤液不能清除附生菌，单独使用配套的灭菌液，如果浓度不合适，会将目标内生菌一起清除掉，两者配合使用，虽然能够达到清除附生菌的效果，但是溶液成分过多，配制起来很复杂，处理步骤繁琐耗时。找到一种简单的、能彻底清除附生菌，而又不影响内生菌的组织表面灭菌液非常重要。
7.更为重要的一点是：本技术的发明人经过长期的研究中发现，相对于陆生植物生活的土壤环境，水体中的微生物少很多，因而黏附在水生植物根系或叶片的微生物种群和含量并不多，内生菌则更少。因此，采用传统的平板划线分离筛选内生固氮菌的方法，难以富集内生固氮菌，不能充分获得目标菌。如何能够富集分离到浮萍中内生固氮菌，需要新的
方法和策略。


技术实现要素：

8.基于此，本发明的目的之一是提供一种富集分离浮萍中内生固氮菌的方法，该方法可以快速且完全、准确地富集并分离浮萍中的内生固氮菌。
9.实现上述发明目的的具体技术方案如下：
10.一种富集分离浮萍中内生固氮菌的方法，包括以下步骤：
11.(1)、使用组织表面灭菌液对浮萍进行表面灭菌后，于0.1％～1％pbs中机械研磨，过滤，得到滤液；
12.(2)、将滤液置于固氮培养液中富集培养5天～7天，离心，弃上清，得到富集的固氮菌群；
13.(3)、在96孔培养板中加入固氮培养液，按梯度分别添加步骤(2)中经富集培养的培养液，培养5天～7天得到菌液，再分别吸取菌液作为反应模板，添加至96孔pcr板，进行pcr扩增，测序；
14.(4)、pcr测序结果无杂带的菌液，即为单一内生固氮菌；pcr测序结果有杂带的菌液，在固氮培养基上划线分离纯化至得到单一内生固氮菌。
15.在其中一些实施例中，步骤(3)中所述梯度为：100μl固氮培养液中分别添加50μl、20μl、10μl、5μl、1μl和0.5μl的培养液。
16.在其中一些实施例中，步骤(3)中所述pcr扩增的引物如seq id no.1和seq id no.2所示。
17.在其中一些实施例中，所述pcr扩增的反应体系为：2μl～4μl菌液、5μl细菌细胞裂解液、2μl～3μl 10x pcr buffer缓冲液、0.3mm～0.6mm mgcl2、0.1mm～0.3mm dntps、引物各0.5μm～1.0μm、0.3μl～0.6μl 5u/μltaq聚合酶，加无菌ddh2o至25μl。
18.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述组织表面灭菌液包括以下组分：0.5
×
～1.5
×
pbs、体积百分浓度0.2％～0.4％的triton-x100、质量体积浓度3％～6％的次氯酸钠，ph6.5～7.0。
19.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述组织表面灭菌液包括以下组分：1
×
～1.5
×
pbs，体积百分浓度0.3％～0.4％的triton-x100、质量体积浓度4％～6％的次氯酸钠，ph6.8～7.0。
20.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述表面灭菌的方法为：在组织表面灭菌液中加入浮萍，1500rpm～2500rpm振荡清洗3min～5min，倒去组织表面灭菌液，再加入无菌水，1500rpm～2500rpm振荡清洗1min～2min，重复2～3次。
21.在其中一些实施例中，步骤(1)中确定所述浮萍表面灭菌是否彻底的方法为：将无菌水清洗浮萍后的清洗液，滴至细菌培养基lb中，若无菌落形成，则表示浮萍表面已彻底灭菌。
22.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述研磨的时间为30s～60s。
23.在其中一些实施例中，步骤(2)和步骤(3)中所述培养温度为28℃～32℃。
24.本发明旨在提供一种快速富集与分离水生植物浮萍中的内生固氮菌的方法，与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
25.1、针对发明人发现的难以用传统方法来富集浮萍中的内生固氮菌，发明人从新的思路和策略提供了一种能够快速和准确的富集分离浮萍中内生固氮菌的方法：基于紫萍“水生模式植物”的功能研究体系，先富集浮萍中原本种群和含量都很少的内生固氮菌，再采用梯度稀释法，并结合高通量分离、测序解析，通过测序结果是否含有杂带来判断内生固氮菌是否为单一的纯种，相比起传统的平板划线法分离纯化内生固氮菌，本发明的方法可以更为快速地、完全地、准确地使浮萍中的内生固氮菌得以分离；
26.2、本发明通过使用组织表面灭菌液对浮萍组织进行表面灭菌，灭菌液中的次氯酸钠是一种氧化性杀菌剂，4％～6％的浓度就可以快速杀灭植物体上黏附能力较弱的附生菌，再恰到好处地配合使用可以维持细胞渗透压，保护细胞结构pbs，以及可将膜蛋白从细胞膜上解离下来，清洗掉组织表面附着物，但对细菌等微生物没有杀伤作用的triton-x100；从而可以在保护植物和内生菌细胞不受破坏的同时，又达到组织表面彻底灭菌的目的，极大地简化了所需溶液成分，配制简单；
27.3、本发明的富集分离浮萍中内生固氮菌的方法有助于挖掘更多功能固氮菌提高浮萍生长速率，以及加快富营养化水体中氮素的吸收和降解重金属等水环境污染等问题，对浮萍水体修复和水环境净化具有重要意义，使水环境生态体系向更高水平的生物多样性和更稳定的自我调节机制方向发展。
附图说明
28.图1是本发明实施例1中从表面灭菌后的浮萍中富集的内生固氮菌群的组成结构图，其中，dw为采用本发明的组织表面灭菌液对浮萍表面灭菌的实验组；ck为采用现有技术的盐溶液(sd+b)对浮萍表面灭菌的对照组。
具体实施方式
29.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
30.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
31.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
32.以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
33.实施例1一种富集分离浮萍中内生固氮菌的方法
34.本实施例的一种富集分离浮萍中内生固氮菌的方法，包括以下步骤：
35.1、浮萍表面灭菌
36.在50ml离心管中倒入20ml无菌水，取少量采集的浮萍(广东广州)放入离心管中，
it(thermofisher,usa)试剂对其纯化，然后送至测序公司进行基因测序；
52.测序获得的原始序列通过相关软件如geneious(https://www.geneious.com/)和serial cloner(http://serialbasics.free.fr/serial_cloner.html)处理后，在ncbi的基因数据库中通过blast进行比对，进而鉴定细菌所属种类。
53.基于pcr测序峰图有无杂带，来判断菌液是否需要在固氮培养基上继续分离纯化，还是可以直接进行冷冻保存。测序结果若出现有杂带，则将其菌液，在固氮固体培养基上涂板，划线分离纯化，筛选得到单一内生固氮菌进行培养后再进行测序、鉴定，冷冻保存；测序结果若没有出现杂带，说明菌液已经是纯化的单一内生固氮菌，则可以直接冷冻保存。
54.结果如图1所示。
55.从图1可以看出，经本发明的表面组织灭菌液(dw)表面灭菌处理的浮萍组织中，总共鉴定得到12种内生固氮菌，其中6个均属于azotobactersp(固氮菌属)，剩余6个分别为rhizobium sp.(根瘤菌属)，dechloromonas sp.(脱氧单胞菌属)，thauera sp.(陶厄氏菌属)，flavobacterium sp.(黄杆菌属)，hydrogenophaga sp.(嗜氢菌属)，thiobacillus sp.(硫杆菌属)。
56.ck组(化学洗涤液+灭菌液对照组)中总共鉴定得到7种内生固氮菌，其中4个均属于azotobactersp(固氮菌属)，剩余3个分别为rhizobium sp.(根瘤菌属)，dechloromonas sp.(脱氧单胞菌属)，hydrogenophaga sp.(嗜氢菌属)。
57.表1的结果表明：相较于ck对照组中，采用化学洗涤液+灭菌液对浮萍进行表面灭菌，采用本发明的表面组织灭菌液对浮萍表面进行灭菌，在不损害植物组织和破坏组织内共生固氮菌的同时，能够获取种类更丰富的内生固氮菌属，且单一菌属中分离出数量更多的内生固氮菌。
58.对比例
59.对比例与实施例1的区别在于：步骤3中采用传统平板划线的方法分离浮萍中的内生固氮菌。其他步骤均与实施例1相同。
60.首先，用灭菌环蘸取滤液，在固氮固体培养基上反复划线，重复3次～5次，于28℃～32℃恒温培养箱培养5天～7天；待平板上菌落长出后，再用灭菌环将形状大小不一的不同菌落挑出，分别在固氮固体培养基上反复划线，于28℃～32℃恒温培养箱培养5天～7天，反复重复多次，直至平板上筛选出单一菌落。
61.采用实施例1的方法与传统的平板划线法分离浮萍中的内生固氮菌，分离得到的菌种数量和名称结果如表1所示。
62.表1实施例1和对比例中分离得到的菌种数量和名称比较
63.[0064][0065]
从表1可以看出，用传统平板划线分离到的固氮菌种类较少，只能分离出浮萍滤液中含量较高的5种内生固氮菌，分别属于azotobactersp(固氮菌属，2种)、hydrogenophagasp.(嗜氢菌属，1种)、dechloromonassp.(脱氧单胞菌属，1种)和rhizobium sp.(根瘤菌属，1种)四个属。而本发明实施例1中的高通量分离筛选方法，总共分离得到12种内生固氮菌，分别属于azotobactersp(固氮菌属)，rhizobium sp.(根瘤菌属)，dechloromonassp.(脱氧单胞菌属)，thauera sp.(陶厄氏菌属)，flavobacterium sp.(黄杆菌属)，hydrogenophaga sp.(嗜氢菌属)，thiobacillus sp.(硫杆菌属)六个属。
[0066]
这是因为：通过本发明的高通量分离筛选，滤液经多次稀释后添加至不同培养孔，将群落中不同特性的菌种逐渐分开，彼此生长不受限制，有利于含量较低或者生长速率偏慢的菌生长，因而这些含量较低或者生长速率偏慢的菌也可以筛选出来。而采用传统的平板划线分离法对浮萍中的内生固氮菌进行分离时，滤液所含的固氮菌群中，含量较低或者生长速率偏慢的菌并不是处于优势菌，菌与菌之间的生长会相互制约，因而当优势菌和非优势菌同时划线到平板上时，优势菌则优先长出，限制甚至抑制了其他非优势菌种的生长，故经多次反复筛选也未能筛出。对比例的结果说明，传统的平板划线分离法并不适合菌群含量少的水生植物中内生固氮菌的分离筛选。
[0067]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0068]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。