一种黄酮类化合物的提取方法

1.本发明涉及化合物提取技术领域，尤其涉及一种黄酮类化合物的提取方法。


背景技术：

2.千斤拔为豆科植物千斤拔植物(主要包括蔓性千斤拔和大叶千斤拔)的根，具有祛风除湿、活血解毒的功效，主治风湿痹痛、腰肌劳损、四肢痿软、跌打损伤以及咽喉肿痛。千斤拔中含有多种化学成分，已有研究报道其中含有抗肿瘤成分，并通过多种分离方法配合使用分离纯化出有效成分，如化合物eriosematin(王娇等，千斤拔的抗肿瘤活性成分研究，天然产物研究与开发，2013，25；1315
‑
1319，1361)。如何更简单、高效的提取化合物eriosematin，是目前需要解决的技术问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种黄酮类化合物的提取方法，采用本发明提供的方法能够简单、高效的提取化合物eriosematin。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种黄酮类化合物的提取方法，所述黄酮类化合物具有式i所示结构：
[0006][0007]
包括以下步骤：
[0008]
(1)采用乙醇水溶液对千斤拔进行回流提取，得到乙醇提取物；
[0009]
(2)以正己烷
‑
乙酸乙酯作为洗脱剂，采用硅胶柱对所述乙醇提取物进行梯度洗脱，依次得到5个流份，记为流份a、流份b、流份c、流份d和流份e；
[0010]
(3)将所述流份b经减压浓缩得到b馏分，以甲醇
‑
水作为洗脱剂，采用反向c18硅胶柱对所述b馏分进行梯度洗脱，依次得到11个流份，记为流份b1、流份b2、流份b3、流份b4、流份b5、流份b6、流份b7、流份b8、流份b9、流份b10和流份b11；
[0011]
(4)将所述流份b8与流份b9合并后经减压浓缩得到b8
‑
b9馏分，以甲醇
‑
水作为洗脱剂，采用sephadex
‑
lh色谱柱对所述b8
‑
b9馏分进行等度洗脱，得到具有式i所示结构的黄酮类化合物。
[0012]
优选地，所述步骤(1)中乙醇水溶液的体积分数为75～85％。
[0013]
优选地，所述步骤(1)中进行回流提取时，料液比为1：(10～15)g/ml。
[0014]
优选地，所述步骤(1)中回流提取的温度为50～60℃，回流提取的次数为2～3次，每次回流提取的时间为50～70min。
[0015]
优选地，所述步骤(2)中梯度洗脱包括依次进行的6个梯度，按正己烷与乙酸乙酯的体积比，每个梯度中洗脱剂的组成依次为50:1、25:1、10:1、8:1、4:1和2:1，将洗脱后成分相近的流份合并，依次得到流份a、流份b、流份c、流份d和流份e。
[0016]
优选地，所述步骤(2)中的梯度洗脱，每个梯度洗脱2～4个柱体积，洗脱速率为2～4ml/min。
[0017]
优选地，所述步骤(3)中梯度洗脱包括依次进行的11个梯度，按甲醇与水的体积比，每个梯度中洗脱剂的组成依次为0:1、1:9、1:4、3:7、2:3、1:1、3:2、7:3、4:1、9:1和1:0，依次对应流份b1、流份b2、流份b3、流份b4、流份b5、流份b6、流份b7、流份b8、流份b9、流份b10和流份b11。
[0018]
优选地，所述步骤(3)中的梯度洗脱，每个梯度洗脱2～4个柱体积，洗脱速率为18～22ml/min。
[0019]
优选地，所述(4)中洗脱剂中甲醇与水的体积比为9:1。
[0020]
优选地，所述步骤(4)中的等度洗脱，洗脱2～4个柱体积，洗脱速率为2～5ml/min。
[0021]
本发明提供了一种黄酮类化合物的提取方法，所述黄酮类化合物具体为化合物eriosematin，包括以下步骤：(1)采用乙醇水溶液对千斤拔进行回流提取，得到乙醇提取物；以正己烷
‑
乙酸乙酯作为洗脱剂，采用硅胶柱对所述乙醇提取物进行梯度洗脱，依次得到5个流份，记为流份a、流份b、流份c、流份d和流份e；(3)将所述流份b经减压浓缩得到b馏分，以甲醇
‑
水作为洗脱剂，采用反向c18硅胶柱对所述b馏分进行梯度洗脱，依次得到11个流份，记为流份b1、流份b2、流份b3、流份b4、流份b5、流份b6、流份b7、流份b8、流份b9、流份b10和流份b11；(4)将所述流份b8与流份b9合并后经减压浓缩得到b8
‑
b9馏分，以甲醇
‑
水作为洗脱剂，采用sephadex
‑
lh色谱柱对所述b8
‑
b9馏分进行等度洗脱，得到具有式i所示结构的黄酮类化合物。本发明从千斤拔中通过分离纯化得到化合物eriosematin，化合物eriosematin在千斤拔中含量多，开发成本低。采用本发明提供的方法能够简单、高效的提取化合物eriosematin。
附图说明
[0022]
图1为化合物eriosematin的核磁共振1h谱图；
[0023]
图2为化合物eriosematin的核磁共振
13
c谱图；
[0024]
图3为化合物eriosematin的高分辨率质谱图；
[0025]
图4为根据核磁共振二维谱显示的化合物eriosematin中h原子和c原子之间的相关性图。
具体实施方式
[0026]
本发明提供了一种黄酮类化合物的提取方法，所述黄酮类化合物具有式i所示结构：
[0027][0028]
包括以下步骤：
[0029]
(1)采用乙醇水溶液对千斤拔进行回流提取，得到乙醇提取物；
[0030]
(2)以正己烷
‑
乙酸乙酯作为洗脱剂，采用硅胶柱对所述乙醇提取物进行梯度洗脱，依次得到5个流份，记为流份a、流份b、流份c、流份d和流份e；
[0031]
(3)将所述流份b经减压浓缩得到b馏分，以甲醇
‑
水作为洗脱剂，采用反向c18硅胶柱对所述b馏分进行梯度洗脱，依次得到11个流份，记为流份b1、流份b2、流份b3、流份b4、流份b5、流份b6、流份b7、流份b8、流份b9、流份b10和流份b11；
[0032]
(4)将所述流份b8与流份b9合并后经减压浓缩得到b8
‑
b9馏分，以甲醇
‑
水作为洗脱剂，采用sephadex
‑
lh色谱柱对所述b8
‑
b9馏分进行等度洗脱，得到具有式i所示结构的黄酮类化合物。
[0033]
在本发明中，具有式i所示结构的黄酮类化合物具体为化合物eriosematin，下面对其提取方法进行详细说明。
[0034]
本发明采用乙醇水溶液对千斤拔进行回流提取，得到乙醇提取物。在本发明中，所述千斤拔具体为蔓性千斤拔的根；所述千斤拔在使用前优选进行预处理，所述预处理优选包括：取蔓性千斤拔的根，采用根皮，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分作为千斤拔样品在室温(25℃)条件下避光干燥贮存。
[0035]
得到千斤拔样品后，本发明采用乙醇水溶液对所述千斤拔样品进行回流提取，得到乙醇提取物。在本发明中，所述乙醇水溶液的体积分数优选为75～85％，更优选为80％；进行所述回流提取时，料液比优选为1：(10～15)g/ml，更优选为1：12g/ml。在本发明中，所述回流提取的温度优选为50～60℃，更优选为55℃；回流提取的次数优选为2～3次，更优选为2次；每次回流提取的时间优选为50～70min，更优选为60min。本发明优选采用上述体积分数的乙醇水溶液对千斤拔进行回流提取，其与提取物极性接近，基于相似相溶原理，有利于提高提取效率；同时本发明优选将回流提取的条件控制在上述范围，在节约溶剂的基础上能够加快溶质扩散到溶剂的速度，有利于节约成本，提高提取效率。
[0036]
在本发明中，每次回流提取后优选过滤收集滤液，合并滤液进行真空浓缩，得到乙醇提取物，为深红色胶状物。
[0037]
得到乙醇提取物后，本发明以正己烷
‑
乙酸乙酯为洗脱剂，采用硅胶柱对所述乙醇提取物进行梯度洗脱，依次得到5个流份，记为流份a、流份b、流份c、流份d和流份e。在本发明中，具体是采用开放硅胶柱对所述乙醇提取物进行梯度洗脱。在本发明中，所述梯度洗脱优选包括依次进行的6个梯度，按正己烷与乙酸乙酯的体积比，每个梯度中洗脱剂的组成优选依次为50:1、25:1、10:1、8:1、4:1和2:1，将洗脱后成分相近的流份合并，依次得到流份a、流份b、流份c、流份d和流份e。在本发明中，所述梯度洗脱过程中，每个梯度优选洗脱2～4个
柱体积，更优选为3～4个柱体积，洗脱速率优选为2～4ml/min，更优选为3～4ml/min。本发明优选采用正己烷
‑
乙酸乙酯作为洗脱剂进行上述梯度洗脱，能够在目标提取物合适的极性条件范围，有利于进行初步的提取分离。
[0038]
得到流份b后，本发明将所述流份b经减压浓缩得到b馏分，以甲醇
‑
水作为洗脱剂，采用反向c18硅胶柱对所述b馏分进行梯度洗脱，依次得到11个流份，记为流份b1、流份b2、流份b3、流份b4、流份b5、流份b6、流份b7、流份b8、流份b9、流份b10和流份b11。在本发明中，所述梯度洗脱优选包括依次进行的11个梯度，按甲醇与水的体积比，每个梯度中洗脱剂的组成依次为0:1、1:9、1:4、3:7、2:3、1:1、3:2、7:3、4:1、9:1和1:0，依次对应流份b1、流份b2、流份b3、流份b4、流份b5、流份b6、流份b7、流份b8、流份b9、流份b10和流份b11。在本发明中，所述梯度洗脱过程中，每个梯度优选洗脱2～4个柱体积，更优选为3～4个柱体积，洗脱速率优选为18～22ml/min，更优选为18～20ml/min。本发明优选采用甲醇
‑
水作为洗脱剂进行上述梯度洗脱，能够实现精确层析分离，有利于不同极性物质逐层析出。
[0039]
得到流份b8与流份b9后，本发明将所述流份b8与流份b9合并后经减压浓缩得到b8
‑
b9馏分，以甲醇
‑
水作为洗脱剂，采用sephadex
‑
lh色谱柱对所述b8
‑
b9馏分进行等度洗脱，得到具有式i所示结构的黄酮类化合物。在本发明中，所述sephadex
‑
lh色谱柱具体为sephadex
‑
lh
‑
20凝胶色谱柱。在本发明中，所述洗脱剂中甲醇与水的体积比优选为9:1。在本发明中，所述等度洗脱过程中，优选洗脱2～4个柱体积，更优选为3～4个柱体积，洗脱速率优选为2～5ml/min，更优选为4～5ml/min。本发明优选采用上述体积比的甲醇
‑
水作为洗脱剂，能够进一步实现精确层析分离，有利于最终得到高纯度化合物eriosematin。
[0040]
所述等度洗脱后，本发明优选收集流份进行减压浓缩，得到化合物eriosematin。
[0041]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0042]
实施例1
[0043]
取蔓性千斤拔的根，采用根皮，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分作为千斤拔样品在室温(25℃)条件下避光干燥贮存。
[0044]
采用体积分数为80％的乙醇水溶液对500g千斤拔样品进行回流提取，料液比为1：12g/ml，提取温度为55℃，提取次数为2次，每次提取时间为60min；每次提取完成后过滤收集滤液，合并滤液进行真空浓缩，得到乙醇提取物(60g)，为深红色胶状物；
[0045]
以正己烷
‑
乙酸乙酯为洗脱剂，在梯度洗脱条件下，采用开放硅胶柱对乙醇提取物进行洗脱，依次得到5个流份，记为流份a、流份b、流份c、流份d和流份e；其中，所述梯度洗脱包括依次进行的6个梯度，按正己烷与乙酸乙酯的体积比，每个梯度中洗脱剂的组成依次为50:1、25:1、10:1、8:1、4:1和2:1，将洗脱后成分相近的流份合并，依次对应流份a～流份e；每个梯度具体洗脱3个柱体积，洗脱速率为4ml/min；
[0046]
将所述流份b经减压浓缩得到b馏分(2.8g)，以甲醇
‑
水作为洗脱剂，在梯度洗脱条件下，采用反向c18硅胶柱对所述b馏分进行洗脱，依次得到11个流份，记为流份b1、流份b2、流份b3、流份b4、流份b5、流份b6、流份b7、流份b8、流份b9、流份b10和流份b11；其中，所述梯度洗脱包括依次进行的11个梯度，按甲醇与水的体积比，每个梯度中洗脱剂的组成依次为
0:1、1:9、1:4、3:7、2:3、1:1、3:2、7:3、4:1、9:1和1:0，分别对应流份b1～流份b11；每个梯度具体洗脱4个柱体积，洗脱速率为20ml/min；
[0047]
将所述流份b8与流份b9合并后经减压浓缩得到b8
‑
b9馏分(420mg)，以甲醇
‑
水作为洗脱剂，甲醇与水的体积比为9:1，采用sephadex
‑
lh色谱柱对所述b8
‑
b9馏分进行洗脱，具体洗脱3个柱体积，洗脱速率为5ml/min，收集流份进行减压浓缩，得到化合物eriosematin(80mg，纯度为96％)。
[0048]
图1为化合物eriosematin的核磁共振1h谱图，具体数据为：1h nmr(500mhz cdcl3)δ7.69(d,j＝5.9hz,1h),6.63(d,j＝10hz,1h),6.11(d,j＝5.9hz,1h),5.61
‑
5.50(m,1h),5.14
‑
5.02(m,1h),3.28(d,j＝7.3hz,2h),1.72(s,3h),1.60(s,3h),1.38(s,3h)。
[0049]
图2为化合物eriosematin的核磁共振
13
c谱图，具体数据为：
13
c nmr(125mhz):δ17.4(c
‑3″′
),2.9(c
‑1″′
),25.7(c
‑5″′
),28.2(c
‑6″
),105.4(c
‑
10),106.3(c
‑
6),107.6(c
‑
8),110.9(c
‑
3),121.8(c
‑2″′
),131.5(c
‑3″′
),154.4(c
‑
5),154.7(c9),155.3(c
‑
2),156.9(c
‑
7)。
[0050]
图3为化合物eriosematin的高分辨率质谱图，由其可知化合物eriosem atin的元素组成和精确的分子量。
[0051]
由图1～图3可知，采用本发明提供的方法得到的提取物确实为化合物eriosematin。图4为根据核磁共振二维谱显示的化合物eriosematin中h原子和c原子之间的相关性图。
[0052]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。