一株高产乳酸的植物乳杆菌GBW-LP001及其替抗菌剂和应用的制作方法

一株高产乳酸的植物乳杆菌gbw
‑
lp001及其替抗菌剂和应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，涉及一株高产乳酸的植物乳杆菌gbw
‑
lp001及其替抗菌剂和应用。


背景技术：

2.随着含有促生长类药物饲料添加剂的商品饲料逐渐停产(简称“禁抗”)。益生菌，尤其是乳酸菌已成为了新的替抗产品，并逐渐凸显出其独特的优势。
3.植物乳杆菌是乳杆菌中的一种，在人和动物的肠道、青贮发酵料、发酵食物、乳制品中均广泛存在。通常植物乳杆菌在发酵后期才会被发现，主要是因为植物乳杆菌有较高的耐酸能力，并能够耐受多种不良的环境。目前，植物乳杆菌已作为一种人用益生菌，用于降低胆固醇、血脂和减肥，但该菌用在畜禽动物的养殖中还比较少。
4.现阶段，植物乳杆菌的使用虽然会用在肉禽的养殖现场进行饮水饲喂。但是种禽厂出壳的雏鸡在运往养殖场的过程中，有一个益生菌的空白期，而这个时期是雏鸡的肠道由无菌到肠道菌群建立的开始和关键时期，所以怎样在雏鸡出壳后增加益生菌的使用，让雏鸡出壳后接触的微生物中大部分为益生菌，是非常值得研究的问题。而且植物乳杆菌的稳定性一直是个难题，其常温储存时间短。所以解决植物乳杆菌的稳定性是首要的，其次要扩大该菌株在畜牧行业的使用范围。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术中的不足与缺陷，本发明提供了一株高产乳酸的植物乳杆菌gbw
‑
lp001，所述的植物乳杆菌gbw
‑
lp001具有优异的稳定性及抗逆性，且利用植物乳杆菌gbw
‑
lp001与其他菌株制备得到了一种替抗菌剂，该菌剂能够用于畜禽动物的养殖，且效果显著。
6.为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：
7.本发明提供了一株高产乳酸的植物乳杆菌gbw
‑
lp001，其分类命名为植物乳杆菌lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22078。
8.进一步的，所述植物乳杆菌gbw
‑
lp001的16s rrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.进一步的，所述植物乳杆菌gbw
‑
lp001的phes的核苷酸序列如seq id no.2所示；pyrg的核苷酸序列如seq id no.3所示；uvrc的核苷酸序列如seq id no.4所示；rpoa的核苷酸序列如seq id no.5所示。
10.进一步的，所述植物乳杆菌gbw
‑
lp001的菌落为非常规则的圆形，乳白色，直径2
‑
3mm，表面光滑，边缘整齐，中间凸起，不透明；菌体呈短杆状，两头钝圆，单个、成对或链状，无鞭毛，无芽孢。
11.进一步的，所述植物乳杆菌gbw
‑
lp001培养24h后产乳酸量大于等于18.1g/l。
12.本发明还提供了含有所述的植物乳杆菌gbw
‑
lp001的替抗菌剂，所述替抗菌剂中还包括凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶。
13.进一步的，所述的凝结芽孢杆菌采用的是保藏编号为cgmcc no.13044的凝结芽孢杆菌e21，所述的丁酸梭菌采用的是保藏编号为cgmcc no.14499的丁酸梭菌gbw
‑
n1。
14.进一步的，所述植物乳杆菌gbw
‑
lp001的活菌含量为50亿cfu/g，所述凝结芽孢杆菌e21的活菌含量为50亿cfu/g，所述丁酸梭菌gbw
‑
n1的活菌含量为10亿cfu/g，所述葡萄糖氧化酶的酶活为1000u/g。
15.本发明还提供了所述的植物乳杆菌gbw
‑
lp001或者所述的替抗菌剂在用于制备雏禽养殖的开口料或喷雾剂中的应用。
16.进一步的，在使用时，所述植物乳杆菌gbw
‑
lp001菌粉的用量为：每10000只雏禽添加50g植物乳杆菌gbw
‑
lp001菌粉。
17.进一步的，所述雏禽为雏鸡。
18.本发明还提供了所述的植物乳杆菌gbw
‑
lp001或者所述的替抗菌剂在用于制备提高家禽生长性能的饲料添加剂或饮用水添加剂中应用。
19.进一步的，所述替抗菌剂作为饲料添加剂使用时，其用量为每天按家禽全天采食量500g/吨饲料添加。
20.进一步的，所述替抗菌剂作为饮用水添加剂使用时，其用量为250g/m3水添加。
21.与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：
22.1、本发明从健康白羽肉鸡的肠段提取到了一株产乳酸量高的植物乳杆菌gbw
‑
lp001，其具有很好的稳定性及抗逆性，均高于市场同类产品，且耐酸性、耐胆盐性和产酸性也明显好于市场同类产品，并且植物乳杆菌gbw
‑
lp001安全可靠，能够用于作为雏鸡的开口料使用，经实验验证，能够明显提高肉鸡的成活率和出栏重，进而提高肉鸡的养殖效益。
23.2、本发明利用植物乳杆菌gbw
‑
lp001和凝结芽孢杆菌e21、丁酸梭菌gbw
‑
n1、葡萄糖氧化酶共同制备得到了一种新的替抗菌剂，经过实验验证，该替抗菌剂能够完全能够替代抗生素用于肉鸡和肉鸭的日常养殖中，增加它们的生长性能，提高了成活率，降低了料肉比，增加了出栏重，提高了养殖效益。
附图说明
24.图1为植物乳杆菌gbw
‑
lp001在mrs平板上的菌落形态特征。
25.图2为植物乳杆菌gbw
‑
lp001在显微镜下的菌体形态特征。
26.图3为植物乳杆菌gbw
‑
lp001在种鸡厂作为雏鸡开口料使用养殖数据。
27.图4为替抗菌剂在肉鸡养殖后期现场“替抗”试验数据；其中，a为试验组粪便形态，b为对照组1粪便形态，c为对照组2粪便形态，d为肉鸡日增重数据。
具体实施方式
28.结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
29.下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
30.下述实施例中所需培养基的配方如下：
31.1、mrs固体培养基：蛋白胨10.0g/l，牛肉浸粉5.0g/l，酵母浸粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，柠檬酸三铵2.0g/l，醋酸钠5.0g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.05g/l，琼脂15.0g/l，吐温80 1.0g/l，ph值为6.5
±
0.2(25℃)。
32.2、mrs液体培养基：蛋白胨10.0g/l，牛肉浸粉5.0g/l，酵母浸粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，柠檬酸三铵2.0g/l，醋酸钠5.0g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温80 1.0g/l，ph值为6.5
±
0.2(25℃)，l
‑
半胱氨酸盐酸盐0.5g/l。
33.上述培养基在使用前，需在116℃下灭菌30min，然后室温保存。
34.实施例1：植物乳杆菌gbw
‑
lp001的筛选、分离与分子鉴定
35.1、植物乳杆菌gbw
‑
lp001的菌种的筛选与纯化
36.健康白羽肉鸡不同肠段取样，样品于mrs液体培养基和mrs固体培养基上经多次分离纯化得到一株产酸性好的乳酸杆菌，将该单菌落命名为gbw
‑
lp001。
37.如图1所示，所述菌株gbw
‑
lp001在mrs平板上的菌落为非常规则的圆形，乳白色，直径2
‑
3mm，表面光滑，边缘整齐，中间凸起，不透明；显微镜下菌体呈短杆状，两头钝圆，单个、成对或链状，无鞭毛，无芽孢。
38.2、植物乳杆菌gbw
‑
lp001的鉴定
39.(1)16s rrna基因鉴定：以所述的菌株gbw
‑
lp001的dna为模板，使用16s rrna通用引物27f和1492r进行扩增，扩增片段送往上海生工进行序列测定，所得核苷酸序列如seq id no.1所示，将得到序列经blast比对，结果发现，gbw
‑
lp001与genbank中的lactobacillus plantarum序列的同源性为99.93％，因此初步确定该菌株为植物乳杆菌。
40.(2)其他保守基因进一步鉴定：利用phes基因(苯丙氨酰
‑
trna合成酶α亚基)、pyrg基因(ctp合成酶)、uvrc基因(切除内切酶亚基)和rpoa基因(rna聚合酶的α亚基)4个保守基因，设计合适引物(引物序列如表1)，进行pcr扩增，扩增片段送往上海生工进行序列测定，得到的核苷酸序列分别如seq id no.2
‑
seq id no.5所示，序列经blast比对发现，与genbank中的lactobacillus plantarum序列同源性比对相似性分别为99.86％、99.41％、100％、99.88％。所以，最终确认该菌株为植物乳杆菌。
41.表1：保守基因名称及引物
[0042][0043]
(3)菌种保藏
[0044]
将筛选到的菌株gbw
‑
lp001进行菌种保藏，所述植物乳杆菌gbw
‑
lp001的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2021年03月26日；植物乳杆菌lactobacillus plantarum的保藏编号为cgmcc no.22078。
[0045]
实施例2：植物乳杆菌gbw
‑
lp001的稳定性及抗逆性分析
[0046]
1、植物乳杆菌gbw
‑
lp001的稳定性分析
[0047]
植物乳杆菌gbw
‑
lp001的1000亿cfu/g纯菌粉经过发酵罐发酵获得，发酵温度为37℃，发酵时间为12h左右，载体为脱脂奶粉，冷冻干燥法。市场同行1为上海某公司生产的植物乳杆菌，菌量为2000亿cfu/g；市场同行2为江苏某公司生产的植物乳杆菌，菌量为1000亿cfu/g；市场同行3为台湾某公司生产的植物乳杆菌，菌量为1000亿cfu/g；三个市场样品均可购买获得。
[0048]
将不同的植物乳杆菌纯菌粉密封，放到20+1℃条件下，跟踪活菌数。结果如表2显示，植物乳杆菌gbw
‑
lp001在存放1个月后菌量为原始菌量的83.9％，2个月后的菌量为原始菌量的48.6％，虽然保存期间活菌的数量有所下降，但均高于市场同行1、2和3，说明植物乳杆菌gbw
‑
lp001存放1个月和2个月的稳定性均优于现有的植物乳杆菌产品。
[0049]
表2：植物乳杆菌gbw
‑
lp001的稳定性
[0050][0051]
2、植物乳杆菌gbw
‑
lp001的耐酸性
[0052]
首先配制ph值为3.0的人工胃液，含1％的胃蛋白酶，备用。称取不同的植物乳杆菌菌粉，按1∶100的质量体积比加入人工胃液中，37℃，200rpm恒温震荡1h；同时做无人工胃液的空白对照，分别测定含菌量。菌存留率＝人工胃液处理后的菌量/空白菌量
×
100％。结果如表3所示，gbw
‑
lp001在ph＝3.0的人工胃液中处理1h和2h的菌存留率分别为96.6％和72.4％，均高于3个市场同行，说明植物乳杆菌gbw
‑
lp001比现有的植物乳杆菌产品具有更好的耐酸性。
[0053]
表3：植物乳杆菌gbw
‑
lp001在酸性条件下的抗逆性
[0054][0055]
[0056]
3、植物乳杆菌gbw
‑
lp001的耐胆盐性
[0057]
首先配制ph为6.8的pbs缓冲液，121℃灭菌30min，备用。然后在pbs缓冲液加入0.3％的猪胆盐，配制成含胆盐0.3％的pbs缓冲液。称取不同的植物乳杆菌菌粉，按1∶100的质量体积比加入含0.3％胆盐的pbs缓冲液中，37℃，200rpm恒温震荡4h；同时无胆盐溶液的空白对照，测定含菌量。以空白测得的菌数为对照，计算菌存留率。
[0058]
结果如表4所示，gbw
‑
lp001在0.3％胆盐中，37℃处理4h后的菌存留率为28.9％，明显高于3个市场同行，说明植物乳杆菌gbw
‑
lp001具有一定的耐胆碱的能力，效果是优于现有的植物乳杆菌产品的。
[0059]
表4：植物乳杆菌gbw
‑
lp001在胆盐条件下的抗逆性
[0060][0061]
4、植物乳杆菌gbw
‑
lp001的产酸性
[0062]
分别挑取不同的植物乳杆菌的单菌落接种到mrs液体培养基中，37℃培养24h，取适量培养液检测ph值，并用乳酸测试盒(南京建成生物)，检测产乳酸量。结果如表5所示，植物乳杆菌gbw
‑
lp001的菌液ph为3.74，产乳酸量为18.1g/l，其ph值低于3个市场同行，而产乳酸量均高于3个市场同行，说明植物乳杆菌gbw
‑
lp001具有更优异的产酸性能。
[0063]
表5：植物乳杆菌gbw
‑
lp001的产酸性能
[0064][0065][0066]
实施例3：植物乳杆菌gbw
‑
lp001在养殖现场应用案例
[0067]
一、植物乳杆菌gbw
‑
lp001在种鸡厂作为雏鸡开口料使用
[0068]
试验地点：福喜(威海)农牧发展有限公司
[0069]
试验方案：
[0070]
1、试验材料：植物乳杆菌gbw
‑
lp001，菌含量2000亿cfu/g；食用胭脂红色素：天津食品公司采购；pbs缓冲液：青岛根源研发中心提供；喷雾设备：福喜种禽厂提供。
[0071]
2、使用方案
[0072]
2.1、益生菌喷雾溶液的配制
[0073]
从冰箱内取出植物乳杆菌gbw
‑
lp001菌粉，按照10000只雏鸡添加50g菌粉的用量
使用，将菌粉溶解到2100ml pbs缓冲液中，其中加1g的胭脂红，混合均匀。将制备好的益生菌喷雾溶液加入到喷雾设备中。
[0074]
2.2、分组
[0075]
试验组300万只雏鸡，使用植物乳杆菌gbw
‑
lp001菌粉；对照组300万只雏鸡，不使用。
[0076]
2.3、喷雾
[0077]
调节喷雾设备，对雏鸡进行喷雾处理，喷三次后停顿5s，同时控制好雏鸡传送带的速度，让每一个纸盒中的雏鸡在喷雾设备下停留5s。
[0078]
3、使用效果
[0079]
喷雾后，益生菌喷雾溶液在喷雾设备中形成雾状，可以通过呼吸系统进入雏鸡体内，同时在雏鸡的羽毛上面形成一个个红色的小水滴，雏鸡也会相互啄水滴，进一步让益生菌进入雏鸡体内。
[0080]
该农牧公司采用cobb地面平养，在雏鸡出壳喷雾后，统计两个月后600万只出栏肉鸡的综合数据，其中出栏重为每只鸡的平均体重，投入产出比＝投入/产出的比值，投入是指增加益生菌的每只鸡成本，产出是指相同数量的鸡苗出栏后，折算每只鸡的收益增加率。
[0081]
雏鸡养成后的肉鸡养殖的生产性能数据如图3所示，可以看出，试验组的肉鸡成活率相较于对照组提高了0.91％，出栏重增加了79g，料重比减少了0.02％，投入产出比为1∶33，说明在使用了植物乳杆菌gbw
‑
lp001后，明显增加了肉鸡的生长性能，且对雏鸡安全可靠，因此养殖效果非常可观。
[0082]
二、肉禽养殖后期现场“替抗”使用
[0083]
利用植物乳杆菌gbw
‑
lp001和凝结芽孢杆菌e21、丁酸梭菌gbw
‑
n1、葡萄糖氧化酶制备得到了一种新的替抗菌剂，其中植物乳杆菌gbw
‑
lp001的活菌含量为50亿cfu/g，凝结芽孢杆菌e21的活菌含量为50亿cfu/g(凝结芽孢杆菌菌种保藏编号cgmcc no.13044)，丁酸梭菌gbw
‑
n1的活菌含量为10亿cfu/g(丁酸梭菌菌种保藏编号cgmcc no.14499)，葡萄糖氧化酶的酶活为1000u/g。
[0084]
所述凝结芽孢杆菌e21的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年9月26日；凝结芽孢杆菌bacillus coagulans的保藏编号为cgmcc no.13044。
[0085]
所述丁酸梭菌gbw
‑
n1的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年08月07日；丁酸梭菌clostridium butyricum的保藏编号为cgmcc no.14499。
[0086]
替抗试验1：肉鸡养殖后期饲料添加使用
[0087]
试验设计如表6所示，对照组1(抗生素组)在30日龄按常规添加量开始添加20％硫酸粘杆菌素，对照组2在30日龄开始按常规添加剂量添加复方中药制剂，试验组在30日龄开始每天按全天采食量500g/吨饲料添加替抗菌剂。
[0088]
表6：肉鸡养殖后期现场“替抗”试验设计
[0089][0090][0091]
试验结果如图4所示：和对照组1相比，试验组在肉鸡的粪便形态，成型度更好，无水便现象；对照组2相对于其他两组粪便颜色呈深棕色，且有少量明显可见的饲料颗粒。日增重方面，试验组的肉鸡的日增重明显高于对照组，说明本发明的替抗菌剂完全能够代替抗生素产品的使用，且使用效果明显优于抗生素和复方中药制剂。
[0092]
替抗试验2：肉鸭养殖后期饮水添加使用
[0093]
试验设计如表7所示，对照组在28日龄开始添加20％硫酸粘杆菌素，试验组在28日龄开始饮水添加替抗菌剂，其添加量为250g/m3水。
[0094]
表7：肉鸭养殖后期现场“替抗”试验设计
[0095][0096]
肉鸭养殖试验结果如表8显示：和对照组相比，试验组的肉鸭成活率提高了2.59％，料肉比减少了0.025％，出栏重增0.14斤，说明以植物乳杆菌gbw
‑
lp001为主要成分的替抗菌剂完全能够取代抗生素的使用，同时在肉鸭的生产性能方面获得了正向结果。
[0097]
表8：肉鸭养殖后期现场“替抗”试验养殖数据
[0098][0099][0100]
以上成活率、料肉比和出栏重的总计数据均依照加权平均法计算。
[0101]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。