一种B7H3特异性抗性的CAR-NK细胞

一种b7h3特异性抗性的car
‑
nk细胞
技术领域
1.本发明属于免疫治疗领域，涉及一种b7h3特异性抗性的car
‑
nk细胞。


背景技术：

2.(1)b7h3简介
3.b7同源物3(b7h3，b7
‑
h3)是由cd276基因编码的蛋白质，其在许多不同类型的癌症中高表达，包括神经胶质瘤、肝癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌等，其表达水平与患者预后不良密切相关。b7h3(cd276)是b7家族的一个免疫关卡抑制剂，与ctla4、pd
‑
1和cd28等许多免疫相关因子相互作用。在非恶性组织中，b7
‑
h3主要对适应性免疫具有抑制作用，可抑制t细胞活化和增殖。在恶性组织中，b7
‑
h3是抑制肿瘤抗原特异性免疫反应的免疫检查分子。b7
‑
h3还具有非免疫原性致瘤功能，如促进迁移、侵袭、血管生成、化学抗性、上皮向间充质转化以及影响肿瘤细胞代谢。由于其在实体瘤上的选择性表达，b7
‑
h3已成为几种抗癌药的靶标，例如依诺妥珠单抗(mga271)、omburtamab、mgd009、mgc018、ds
‑
7300a和car
‑
t细胞。
4.(2)免疫细胞简介
5.使用免疫细胞(包括t细胞、nk细胞)来治疗癌症是近年来的新趋势，经过car修饰后的免疫细胞，能够高效的识别肿瘤细胞，并通过释放杀伤介质、诱导靶细胞凋亡等多种手段杀伤肿瘤细胞。这种新疗法有望为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供新的治愈希望。
6.嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor
‑
t cell，car
‑
t)技术的不断发展，目前car
‑
t主要可划分为三代。近些年发展的第三代car
‑
t细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scfv
‑
tm
‑
cd28
‑
cd137
‑
itam或scfv
‑
tm
‑
cd28
‑
cd134
‑
itam，进一步提高了car
‑
t在体内的存活周期和其抗肿瘤效果。
7.(3)nk细胞简介
8.自然杀伤(natural killer，缩写nk)细胞是非特异性免疫系统的重要组成部分，是先天免疫系统反应的关键性介质细胞。nk细胞是一种广谱免疫细胞，具有快速发现和摧毁异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的特异功能，而且不需要提前致敏或hla配型，即可展示强大的溶解异常细胞的活性。正是因为nk细胞在抗肿瘤领域扮演着重要的角色，因此car技术的发展也催生了car
‑
nk的诞生。经过car结构修饰后的nk细胞，理论上也能够高效的识别肿瘤细胞，并通过释放杀伤介质、诱导靶细胞凋亡等多种手段杀伤肿瘤细胞。
9.相对于car
‑
t，由于nk细胞的天然特性，car
‑
nk的治疗过程中不会产生严重的细胞因子风暴，因此在临床使用中，安全性可能较car
‑
t更高。其次，由于nk细胞在体内的存活时间较t细胞更短，导致car
‑
nk在体内的存活时间较car
‑
t更短。这一特性或许会导致car
‑
nk细胞疗效不如car
‑
t，但是从安全性的角度来说，这种特性反而避免了经过基因修饰的免疫细胞长期存在于人体可能导致的一系列未知的风险。
10.目前，car
‑
nk中所用到的car的结构模式基本沿用的是car
‑
t的设计。


技术实现要素：

11.本发明提供了一种car
‑
nk细胞，所述car
‑
nk细胞能够提高肿瘤细胞的杀伤效率和临床治疗的安全性、有效性；同时，本发明还提供了所述一种car
‑
nk在制备药物中的应用，从而提供了一种具有应用前景的安全、可靠、高效肿瘤治疗的新手段。
12.第一方面，本发明提供了一种car
‑
nk细胞，所述car
‑
nk细胞的car包含抗b7h3的特异性抗体。
13.优选地，所述抗b7h3的特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区。
14.优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包括vh
‑
cdr1、vh
‑
cdr2、vh
‑
cdr3中的一个或多个。
15.优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列包括vl
‑
cdr1、vl
‑
cdr2、vl
‑
cdr3中的一个或多个。
16.优选地，所述vh
‑
cdr1如seq id no:1所示。
17.优选地，所述vh
‑
cdr2如seq id no:2所示。
18.优选地，所述vh
‑
cdr3如seq id no:3所示。
19.优选地，所述vl
‑
cdr1如seq id no:4所示。
20.优选地，所述vl
‑
cdr2如seq id no:5所示。
21.优选地，所述vl
‑
cdr3如seq id no:6所示。
22.优选地，所述重链可变区的氨基酸序列完整序列如seq id no:7所示。
23.优选地，所述重链可变区的核酸序列是编码seq id no:7所示氨基酸序列的核酸分子序列。
24.优选地，所述重链可变区的核酸序列如seq id no:9所示。
25.优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列完整序列如seq id no:8所示。
26.优选地，所述轻链可变区的核酸序列是编码seq id no:8所示氨基酸序列的核酸分子序列。
27.优选地，所述轻链可变区的核酸序列如seq id no:10所示。
28.优选地，所述重链可变区可在轻链可变区的n端(氨基端)或c端(羟基端)；
29.优选地，所述重链可变区和轻链可变区之间由接头(linker)连接；
30.优选地，所述linker由g(gly，甘氨酸)和/或s(ser，丝氨酸)组成；
31.优选地，所述linker还可以包括其他氨基酸；
32.优选地，所述linker可以是将seq id no:11所示序列中的一个或几个氨基酸进行置换、缺失或添加得到的序列；
33.优选地，所述linker如seq id no:11所示；
34.优选地，所述linker的核酸序列如seq id no:12所示；
35.优选地，所述抗b7h3的特异性抗体的完整氨基酸序列选自以下任一一种：
36.1)seq id no:13所示的氨基酸序列；
37.2)与seq id no:13所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
38.3)与seq id no:13所示的序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同
一性的序列。
39.优选地，所述抗b7h3的特异性抗体的完整氨基酸序列如seq id no:13所示。
40.优选地，所述抗b7h3的特异性抗体的核酸序列是能编码如seq id no:13所示氨基酸的核酸分子序列。
41.优选地，所述抗b7h3的特异性抗体的核酸序列如seq id no:14所示。
42.优选地，所述car
‑
nk细胞的car，还包含铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域中的至少一种。
43.优选地，所述铰链区包括cd8α铰链区、cd28铰链区、cd4铰链区、cd5铰链区、cd134铰链区、cd137铰链区、icos铰链区；
44.优选地，所述铰链区选用cd8α铰链区；
45.优选地，所述cd8α铰链区的氨基酸序列如seq id no.25所示；
46.优选地，所述cd8α铰链区的核酸序列如seq id no.26所示；
47.优选地，所述跨膜结构域包括蛋白质的跨膜结构域，所述蛋白质包括：t细胞受体的α、β或ζ链，cd28，cd3ε，cd45，cd4，cd5，cd8α，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd123，cd134，cd137和cd154；
48.优选地，所述跨膜结构域选用cd8α跨膜结构域；
49.优选地，所述cd8α跨膜结构域的氨基酸序列如seq id no.27所示；
50.优选地，所述cd8α跨膜结构域的核酸序列如seq id no.28所示；
51.优选地，所述共刺激结构域包括cd28、cd137(4
‑
1bb)、cd134(ox40)、daplo、cd27、cd2、cd5、icam
‑
1、lfa
‑
1、lck、tnfr
‑
1、tnfr
‑
ii、fas、cd30、cd40、cd244(2b4)、dap10、dap12的胞内结构域或其组合；
52.优选地，所述共刺激结构域选用cd137的胞内结构域；
53.优选地，所述cd137的胞内结构域的氨基酸序列如seq id no.29所示；
54.优选地，所述cd137的胞内结构域的核酸序列如seq id no.30所示；
55.优选地，所述胞内信号传导结构域包括cd3ζ(cd3 zeta)、cd79b、dap10、fcrγ(fcer1g)、fcγriia、fcrβ(fcepsilon r1b)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a和dap12的含有itam的细胞质信号传导序列；
56.优选地，所述胞内信号传导结构域选用cd3ζ的胞内信号传导结构域；
57.优选地，所述cd3ζ的胞内信号传导结构域的氨基酸序列如seq id no.31所示；
58.优选地，所述cd3ζ的胞内信号传导结构域的核酸序列如seq id no.32所示；
59.优选地，所述铰链区、跨膜结构域、胞内信号传导结构域和共刺激结构域是人为合成的或天然存在的。
60.优选地，所述car的完整结构的氨基酸序列如seq id no.16所示；
61.优选地，所述car的完整结构的核酸序列如seq id no.18所示；
62.优选地，所述car可以包含一个或多个合成的氨基酸；
63.优选地，所述合成的氨基酸包括但不限于氨基环己羧酸、正亮氨酸、α
‑
氨基n
‑
癸酸、高丝氨酸、s
‑
乙酰氨甲基
‑
半胱氨酸、反式
‑3‑
和反式
‑4‑
羟脯氨酸、4
‑
氨基苯丙氨酸、4
‑
硝基苯丙氨酸、4
‑
氯苯丙氨酸、4
‑
羧基苯丙氨酸、β
‑
苯基丝氨酸β
‑
羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α
‑
萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉
‑2‑
羧酸、1,2,3,4
‑
四氢异喹啉
‑3‑
羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、n
’‑
苯甲基
‑
n
’‑
甲基
‑
赖氨酸、n’,n
’‑
二苄基
‑
赖氨酸、6
‑
羟赖氨酸、鸟氨酸、α
‑
氨基环戊烷羧酸、α
‑
氨基环己羧酸、α
‑
氨基环庚烷羧酸、α
‑
(2
‑
氨基
‑2‑
降莰烷)
‑
羧酸、α,γ
‑
二氨基丁酸、α,β
‑
二氨基丙酸、高苯丙氨酸以及α
‑
叔丁基甘氨酸。
64.优选地，所述car还可以与信号肽相连；
65.优选地，所述信号肽连接在car的n端；
66.优选地，所述信号肽包括lgg6信号肽、cd8信号肽、cd28信号肽和cd4信号肽。
67.优选地，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.23所示；
68.优选地，所述信号肽的核酸序列如seq id no.24所示；
69.优选地，所述信号肽和car连接后的氨基酸序列如seq id no.15所示；
70.优选地，所述信号肽和car连接后的核酸序列如seq id no.17所示；
71.优选地，所述car
‑
nk细胞的car还与il
‑
15连接；
72.优选地，所述car
‑
nk细胞的car和il
‑
15之间还连接有自我剪切序列；
73.优选地，所述il
‑
15连接在car的n端或c端；
74.优选地，所述il
‑
15连接在car的c端；
75.优选地，所述il
‑
15可以是野生型il
‑
15序列长度的至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％。
76.优选地，所述il
‑
15的氨基酸序列如seq id no:21所示；
77.优选地，所述il
‑
15的核酸序列如seq id no:22所示；
78.优选地，所述自我剪切序列是2a肽(又称2a自剪切肽，2a self
‑
cleaving peptides)；
79.优选地，所述2a肽包括p2a，e2a，f2a和t2a；
80.优选地，所述2a肽选用t2a；
81.优选地，所述t2a的氨基酸序列如seq id no:19所示；
82.优选地，所述t2a的核酸序列如seq id no:20所示；
83.另一方面，本发明还提供了一种经改造的nk细胞，所述细胞包含编码前述car的核酸分子或其所在的载体；
84.优选地，所述载体上还包括有信号肽、自我剪切序列和il
‑
15中一种或多种的核酸序列；
85.优选地，所述载体上还有信号肽、t2a或il
‑
15的核酸序列；
86.优选地，所述核酸分子的结构是信号肽
‑
car
‑
t2a
‑
il
‑
15；
87.优选地，所述信号肽
‑
car
‑
t2a
‑
il
‑
15的核酸序列如seq id no.33所示；
88.优选地，所述载体是成熟的商品化载体或根据需求自行构建的载体；
89.优选地，所述载体包含dna载体、rna载体；
90.优选地，所述载体包含慢病毒表达载体(慢病毒载体)、逆转录病毒表达载体(逆转录病毒载体)、腺病毒表达载体(腺病毒载体)；
91.优选地，所述载体是逆转录病毒载体；
92.优选地，所述逆转录病毒载体包括但不限于以下成熟商品化载体：mscv、mscv
‑
n wu er、mscv
‑
n sm、mscv ires hcd4、mscv2.2、pmscvii、pmscvpuroatt、pmscv_puro_41584、
pmscv_puro_41585、pmscvii
‑
lo、pmscv_puro_41589、pmscvii
‑
am、hoxa10
‑
mscv、hoxb4
‑
na
‑
mscv、hoxb6
‑
na
‑
mscv、hoxb6
‑
wg
‑
mscv、hoxd4
‑
wv
‑
mscv、prrx2
‑
mscv、meis1b
‑
mscv、mscv jmjd3、mscv flip ff、mscv p2gm ff、pmscv
‑
flagbcl10、mscv
‑
n gfp和mscv
‑
cgfp；
93.优选地，所述逆转录病毒载体是mscv。
94.另一方面，本发明还提供了一种制备前述car
‑
nk细胞或经改造的nk细胞的方法，所述方法包括将编码前述car的完整结构的核酸分子所在的载体引入nk细胞；
95.优选地，所述引入是指病毒转染；
96.优选地，所述病毒转染包括使用慢病毒或逆转录病毒；
97.优选地，所述病毒转染使用的是逆转录病毒；
98.在一种实施方式中，所述方法还包括对病毒进行包装的步骤；
99.优选地，所述对病毒进行包装使用人类细胞株或非人细胞株；
100.优选地，所述人类细胞株包括293细胞、293t细胞、293ft细胞、293ltv细胞、293ebna细胞及其他的从293细胞分离的克隆；sw480细胞、u87mg细胞、hos细胞、c8166细胞、mt
‑
4细胞、molt
‑
4细胞、hela细胞、ht1080细胞、te671细胞；
101.优选地，所述人类细胞株是293t细胞；
102.在一种实施方式中，所述方法还包括制备nk细胞的步骤；
103.优选地，所述nk细胞是由人源的nk细胞或是商品化的nk细胞系所制备得到的；
104.优选地，所述nk细胞系包括nk
‑
92、nkg、yt、nk
‑
ys、hank
‑
1和nkl；
105.优选地，所述人源的细胞来自于人体脐带血或外周血；
106.优选地，所述人源的细胞来自于人体脐带血；
107.优选地，所述人源的细胞是自体的或异体的；
108.在一种实施方式中，所述方法还包括检测car
‑
nk细胞上car表达效率的步骤；优选地，所述检测可以是免疫法或分子的实验方法。
109.在一种实施方式中，所述方法还包括扩增car
‑
nk细胞的步骤；优选地，所述扩增是在体外进行的。
110.另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含前述car
‑
nk细胞和/或经改造的nk细胞；
111.所述药物组合物包括健康权威机构审批的高标准的药物组合物以及具有较低的审批要求或根本不需要具有特定审批的药物组合物，例如所谓的医疗装置或营养制品。
112.优选地，所述药物组合物还包括能够作为多颗粒剂型、包含丸粒的片剂、微片剂、胶囊、囊剂、泡腾片剂或用于口服悬浮液的干粉剂的成分的任何活性药用物质；
113.优选地，所述药用物质包括减体重剂(食欲抑制剂、减肥剂)、抗酸剂(anti
‑
acidosis agents)、抗缺氧药、镇痛药(抗风湿药)、抗蠕虫药、抗过敏药、抗贫血药、抗心律失常剂，抗生素类(抗感染药)、抗痴呆药剂(促智药)、抗糖尿病药、解毒剂、止吐药(抗眩晕试剂)、抗癫痫药、抗出血药试剂(抗纤维蛋白溶解药和其它止血剂)、抗高血压药、抗低血糖药剂、抗低血压药剂、抗凝药、抗真菌药、抗寄生虫药剂、抗炎药、止咳药(祛痰药)、抗动脉硬化剂、浴疗剂和热疗剂、β
‑
受体阻断剂、钙通道阻断剂和肾素
‑
血管紧张素
‑
醛甾酮体系抑制剂，支气管药(止喘药)、利胆药和胆道治疗剂、胆碱能药物、肾上腺皮质激素类、皮肤药、消毒剂(抗菌药)、饮食剂(营养剂)、诊断剂和准备诊断的药剂、利尿药、促进血液循环的药剂、
脱瘾剂(用于治疗成瘾的药剂)、酶抑制剂、用于酶缺陷的制剂、转运蛋白、纤溶剂、老年病药、抗痛风制剂、感冒和流感药和咳嗽和喷嚏药、妇科药、痔疮药(直肠药)、肝脏药、催眠药(镇静药)、脑下垂体激素类、下丘脑激素类和其它调节性肽及其抑制剂、免疫调节剂、输注和标准注射液、器官灌流液、心脏药、防龋剂、牙周变性药和其它牙科制剂、冠脉制剂、轻泻药、降脂药、局部麻醉药(神经治疗剂)、胃肠药、偏头痛药物、矿物质制剂、口服和咽喉药、肌肉松弛药、麻醉药、神经病制剂和其它亲神经性药剂、眼药、抗骨质疏松剂(钙
‑
和骨代谢调节剂)、耳科药剂、抗帕金森药剂和其它用于锥体外束障碍的药、精神病药物、鼻科药物(窦药剂)、强壮药(补药)、甲状腺制剂、血清、免疫球蛋白和疫苗、性激素类及其抑制剂、解痉药(抗胆碱能药)、血小板凝集抑制剂、结核药、情绪改变药剂、泌尿药、用于静脉病症的药剂、维生素类、创伤和疤痕治疗剂、细胞生长抑制剂和其它抗肿瘤药剂和保护剂、生物材料、医药合成剂。
114.另一方面，本发明还提供了前述car
‑
nk细胞和组合物在制备治疗疾病的药物中的应用；
115.优选地，所述疾病是与cd276(b7h3)的表达相关的疾病；
116.优选地，所述疾病是与cd276的表达相关的癌症；
117.优选地，所述与cd276的表达相关的癌症包括原发性癌症、转移性癌症、复发性癌症、对治疗敏感的癌症、难治性癌症(例如，化疗难治性癌症)。
118.优选地，所述与cd276的表达相关的癌症包括血液癌、肺癌、脑癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、睾丸癌、垂体癌、食道癌、脾癌、皮肤癌、胰腺癌、骨癌等(例如b细胞淋巴瘤或黑素瘤)。
119.优选地，所述与cd276的表达相关的癌症包括肺癌、乳腺癌和卵巢癌。
120.优选地，所述肺癌是非小细胞肺癌；
121.优选地，所述卵巢癌是卵巢腺癌。
附图说明
122.图1为培养不同天数nk细胞纯度检测流式代表图。abcd图分别为第0天、第7天、第10天、第14天的检测图，其横坐标为alexa fluor488的荧光强度，纵坐标为apc的荧光强度；e图也是第14天的检测图，其横坐标为apc的荧光强度，纵坐标为percp/cy5.5的荧光强度。
123.图2为car
‑
nk转染效率检测流式代表图，左图是空白对照，中图是表达不包含il
‑
15的car的nk细胞，右图是包含il
‑
15的car的nk细胞。
124.图3为car
‑
nk转染效率统计图。
125.图4为rtca技术分析car
‑
nk细胞杀伤乳腺癌细胞mcf
‑
7的动态曲线，上图是表达不包含il
‑
15的car的nk细胞，下图是包含il
‑
15的car的nk细胞。
具体实施方式
126.下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例是为了举例，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
127.实施例1全人源cd276 car
‑
nk细胞的制备方法
128.一、步骤
129.1、制备脐带血nk细胞；
130.1)分离cbmcs：收集脐带血，加等量生理盐水稀释，将淋巴细胞分离液与稀释脐带血按1:2比例加入离心管中，2000rpm/min离心20分钟，收集白膜层细胞，生理盐水清洗两次，1500rpm/min离心8分钟，获得脐带血单个核细胞cbmcs。
131.2)诱导nk细胞：用nk细胞培养基(x
‑
vivo15+5％fbs+1％p/s+glutamin)重悬cbmcs细胞，调整细胞密度至1～2
×
106/ml，转移至cd16 ab预包被板(加1μg/ml cd16 ab抗体溶液，4℃过夜，使用前弃去包被液，pbs清洗2次)；加入活化因子组合：50ng/ml 4
‑
1bbl、0.01ke/ml ok432、1000u/ml il
‑
2，置于37℃5％co2培养箱中培养3天。离心收集细胞，用新鲜nk细胞培养基重悬并添加1000u/ml il
‑
2，转移至普通培养瓶，置于37℃5％co2培养箱进行扩增2周。每日观察细胞状态，隔天半量换液。
132.3)nk纯度检测：培养第7、10、14天，取2
×
105细胞，清洗后加入alexa fluor488 cd3、apc cd56、percp/cy5.5 nkg2d抗体4℃避光孵育30分钟，清洗后上机检测。
133.2、构建含有car结构的穿梭质粒：所述car结构有包含il
‑
15和不包含il
‑
15两种，不包含il
‑
15的car的核酸序列如seq id no:17所示，包含il
‑
15的car的核酸序列如seq id no:33所示；合成以上序列，并连接到逆转录病毒载体mscv上，然后转化stbl3感受态细胞，挑取单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定后送测序确认。
134.3、包装病毒
135.将含有car结构的穿梭质粒6μg，、辅助质粒pcl
‑
ampho 4μg混合在300μl opti
‑
mem培养基中，在另一300μl opti
‑
mem培养基中逐滴加入30μl pei试剂，震荡混匀，室温静置5分钟，将含有pei试剂的混合物逐滴加入到质粒混合物中，震荡混匀，室温静置15分钟，然后将pei与质粒混合物逐滴加入预先铺好的293t细胞培养皿中，轻摇混匀，48
‑
72小时后，收集上清，经0.45μm针头滤器过滤，超低温冰箱保存备用。
136.4、病毒感染nk细胞
137.将cd276
‑
car病毒液加入10μm hepes和6
‑
8μg/ml polybrene，混匀，接着用该病毒液重悬活化的nk细胞，然后加入retronectin包被过的24孔板中，1500g、30℃离心2小时后去上清，补加含有5％胎牛血清、200u/ml il
‑
2、10ng/ml il
‑
21和5ng/ml il
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15的x
‑
vivo培养基，继续培养扩增，即可。
138.5、car
‑
nk细胞检测
139.待病毒感染后72小时，取2
×
105细胞进行染色，首先加入1μg/ml b7h3
‑
fc蛋白4℃孵育30分钟，清洗细胞再加入af647 anti
‑
human igg fc抗体4℃避光孵育30分钟，清洗细胞最后加入alexa fluor488 cd3、apc cd56抗体4℃避光孵育30分钟，清洗后上机检测。
140.二、结果
141.图1为培养不同天数nk细胞纯度检测流式代表图，结果显示本发明制备得到的nk细胞纯度大于95％，且高表达nkg2d；图2为car
‑
nk转染效率检测流式代表图；图3为car
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nk转染效率统计图，结果显示利用逆转录病毒介导的car体系能够高效感染诱导的nk细胞，car阳性率达60
‑
85％。
142.实施例2利用rtca实时无标记动态细胞分析技术检测car
‑
nk细胞对肿瘤细胞mcf
‑
7的杀伤效果
143.一、步骤
144.首先在xcelligence细胞功能分析仪的e
‑
plate检测板中加入50μl dmem完全培养基，测定背景阻抗值；收集处于对数期的靶细胞mcf
‑
7，调整细胞悬液浓度至1
×
105/ml，向e
‑
plate检测板中加入100μl细胞悬液，室温静置30分钟后置于检测台上；实时动态观察待靶细胞增殖状态，24h后实验孔按照效靶比5:1、2.5:1、1:1加入50μl效应细胞，设置单独肿瘤细胞为blank组，实时观察b7h3.car
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nk细胞介导的杀伤效应曲线。
145.二、结果
146.图4为rtca技术分析car
‑
nk细胞杀伤乳腺癌细胞mcf
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7的动态曲线。结果显示本发明制备的b7h3.car
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nk细胞能高效杀伤乳腺癌细胞mcf
‑
7，效靶比越高杀伤活性越强。
147.需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。