烟草NtAAP6基因在烟草中应用的制作方法

烟草ntaap6基因在烟草中应用
技术领域
1.本发明属于烟草基因组基因功能解析技术领域，具体涉及烟草ntaap6基因在烟草中应用专利申请。


背景技术：

2.氨基酸作为酶和蛋白质的基本组成单位，不仅是植物体内有机氮的载体和重要次生代谢产物的前体，还对植物的生长发育起着至关重要的作用。植物可以通过根部从土壤中吸收以铵盐和硝酸盐形式存在的无机氮，并将其同化生成氨基酸，也可以直接从土壤中吸收氨基酸，还可以在叶片中自主合成氨基酸。植物体内氨基酸的吸收和转运依赖于氨基酸转运蛋白，该蛋白位于生物膜上，根据序列的同源性和功能分为：apc超家族（amino acid，polyamine and choline transporters superfamily）和atf超家族（amino acid transporter family）；其中atf超家族又分为aaps（amino acid permeases）、lhts（lysine histidine transporters）、prots（proline transporters）、γ
‑
gats（γ
‑
aminobutyric transporters）、ants（ aromatic and neutral amino acid transporters）和aux（auxin
‑
resistant family）这6个亚家族，其中对于aaps（amino acid permeases）亚家族的研究相对深入。
3.人们最早是在拟南芥中发现并分离出了氨基酸通透酶（aaps），该aaps基因家族共8个成员（ataap1～8），主要负责转运酸性和中性氨基酸，其中ataap1基因在胚乳和子叶中高表达，与根部谷氨酸盐和中性氨基酸的运输密切相关，同时还可以影响植物种子的重量和数量；ataap2和ataap3基因在茎和根的韧皮部表达量较高，负责韧皮部氨基酸的转运；ataap5基因主要在根皮层中高表达，介导精氨酸和赖氨酸的运输；ataap6基因在根部表达量高，负责调节筛管分子中氨基酸的成分和含量；ataap8基因在种子发育初期调控氨基酸向胚乳的转运。
4.对于农作物而言，aaps的研究主要集中在水稻上，不过在玉米、马铃薯等农作物中也有相关报道。水稻aaps基因家族多达19个成员，其中osaap3基因与赖氨酸和精氨酸的转运相关，抑制该基因的表达可以使水稻的穗数和分蘖数增加，从而提升水稻氮素利用率，增加产量；osaap6基因参与调控水稻营养品质和蛋白质含量。pan等利用酵母功能互补实验发现玉米zmaap4基因能够调控多种氨基酸的转运，尤其对谷氨酸和脯氨酸亲和力强。koch等通过rnai技术发现马铃薯staap1基因在从叶片到根茎的氨基酸运输中发挥着重要作用。
5.现有技术中，针对烟草中的ntaap家族基因研究表明，烟草氨基酸透性酶ntaap2基因（烟草氨基酸透性酶ntaap2基因及其应用，cn201711351625.2）对烟草叶片中部分类型氨基酸含量调节具有重要影响。但该家族其他基因在烟草中是否具有类似功能尚需进一步研究才能进一步确定。


技术实现要素：

6.在对烟草ntaap2基因初步研究基础上，为进一步明确烟草中ntaap家族其他基因
功能，本技术目的在于进一步明确烟草ntaap3、ntaap6基因功能，从而为烟草基因组功能解析和烟草新品种培育奠定一定技术基础。
7.本技术所采取的技术方案详述如下。
8.烟草ntaap3基因在烟草中应用，烟草ntaap3与氨基酸转运相关，在将其沉默后，烟草中酪氨酸、脯氨酸和天冬酰胺含量明显下降，总蛋白质含量明显下降；另一方面，烟草ntaap3基因与烟草中色素类物质含量调节相关，在将其沉默后，烟叶中叶绿素a/b、总叶绿素和类胡萝卜素等色素类物质含量有明显升高；所述烟草ntaap3基因，具体cds序列如seq id no.1所示，对应所编辑的烟草ntaap3蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示，或者具体如下：ntaap3基因cds序列（1440 bp）：atgggagaaaacaacaacgttgcttcaaaacaccaagtgttcgatgtttccattaatgtgactgaatccaagtgctttgacgatgatggccgtctcaaaagaaccgggagcgtttggacggcaagtgctcatatcataacagctgtgattggttcgggagttttgtctttagcatgggcagtagctcaacttggttggattgctggtcctattgttatgattttgttctcttttgttacttattacacttccgctcttcttgccgattgttaccgctccggcgactctgtttccggcaagagaaactatacttacatggatgctgtccaagccaatcttggtgggctccaagtcaagatttgtggatggattcagtatgcgaatctttttggagttgctatcggatacaccattgcatcttcaattagcatgatagctattaaaaggtctaattgtttccacaaacatggtgatcaagctccttgtcaagtatccagcactccatacatgatcatgtttggaataatagaaatcatcttctcccaaattccagattttgatcagatttggtggctttcaattgtggctgccgttatgtctttcacttactctactattggactaggattaggagttgctaaagtggcagaaactggaaaaatcggaggaagtctcactggaattagcatcggaactgtgactgaaatgcaaaagatttggaaaagcttccaagcccttggagctatcgcttttgcctattcttactctctcatccttattgagattcaggatacactcaaatctccaccgtcagaatccaagacaatgaaaaatgcaactctaattagtgtagcagtaacaacagttttctacatgctctgtggctgctttggctatgcagcatttggagatcttgctcctggaaacttactaactggttttggattctacaatccttattggctactcgatatagcgaacatagccattgtcgtccaccttgttggtgcataccaggtttactgccagccccttttcgccttcattgaaaaaacagcagcagaatggtaccccgagagtaaattcattgccaaagagattagtgtcccgattataggctataaatcctttaaactcaaccttttccgcataatttggaggactattttcgtcatcatcaccacggtcatatctatgctattgccattcttcaatgacatagttggaattcttggagcctttgggttttggccgctaacagtctatttcccggtggaaatgtacattgtgcaaaagaagataacaaaatggagcacaaaatggatttgccttcaaatgcttagtgttgcttgccttattatctcaattgctgcagctgctggttcttttgctggcgttgtatctgatctacaagtttacaagccttttaagacgacttga；ntaap3蛋白序列（479 aa）：mgennnvaskhqvfdvsinvteskcfdddgrlkrtgsvwtasahiitavigsgvlslawavaqlgwiagpivmilfsfvtyytsalladcyrsgdsvsgkrnytymdavqanlgglqvkicgwiqyanlfgvaigytiassismiaikrsncfhkhgdqapcqvsstpymimfgiieiifsqipdfdqiwwlsivaavmsftystiglglgvakvaetgkiggsltgisigtvtemqkiwksfqalgaiafaysyslilieiqdtlksppsesktmknatlisvavttvfymlcgcfgyaafgdlapgnlltgfgfynpywlldianiaivvhlvgayqvycqplfafiektaaewypeskfiakeisvpiigyksfklnlfriiwrtifviittvismllpffndivgilgafgfwpltvyfpvemyivqkkitkwstkwiclqmlsvacliisiaaaagsfagvvsdlqvykpfktt*。
9.烟草ntaap6基因在烟草中应用，烟草ntaap6与氨基酸转运相关，在将其沉默后，烟
草中酪氨酸、脯氨酸和天冬酰胺含量明显下降，总蛋白质含量明显下降；另一方面，烟草ntaap6基因与烟草中色素类物质含量调节相关，在将其沉默后，烟叶中叶绿素a/b、总叶绿素和类胡萝卜素等色素类物质含量有明显升高；所述烟草ntaap6基因，具体cds序列如seq id no.3所示，对应所编辑的烟草ntaap6蛋白氨基酸序列如seq id no.4所示，或者具体如下：ntaap6基因cds序列（1506 bp）：atggcacccgaatttcagaagaacactatgtacgtatcaacagaactcgaaagaggagatgttcaaaaaaactttgatgatgatgggcgtgagaaaagaactgggacgttactaacggcaagtgcacatattatcactgctgtaattggttcaggagtgctttctttagcatgggctatagctcagttaggatgggtggctggtcctgctgttctctttgctttttctttcattacatacttcacttctacacttcttgccgactgttaccgttctcccggccccatctccggcaagagaaactacacttacatggacgttgttcgttctcacttaggaggtgtgaaggtaacactgtgtggacttgcacaatatgctaacctcgtcggagttaccattggatacactattacagcatctatcagtatggtcgcagtaaagagatcaaattgttttcacaaacatggccacgaagccagctgctcaatatcgagctacccatatatgatcatatttgcagtcattcaagtagttctaagccaaataccaaatttccacaagctctcatggctatcaattcttgctgctgttatgtcttttacttacgcttctattggtcttggactctctattgccaaagctgctggggtagggcaccatgtaaagacaagcctaacagggacgacagtaggagttgatgtgtctggatcagagaaaatatggaaaagcttccaagccataggagatattgcatttgcttatgcttattccaccgttctcatcgaaatacaggcaagcacactgtcattgattctgattctgatcttttctaagattttattacgtcgtagggatacattgaggtcacaacctccagaaagcaaggttatgaagagagcctcattagctggagtttccaccacaactttattctatatactatgtggtaccattggttatgcagcctttggaaatgatgctcctggaaatttccttactggttttggtttctatgaaccattttggctaattgactttgccaacgtttgcattgccgtccaccttgttggagcttaccaggttttctgccaacctttatatgggttcgtggaggctcgttgcaacgagcgatggtcagacagcaaattcatcacctccgagtacgctgtgcaagttccatgctgtggcgtttacaacgtcaacttgttcaggttggtgtggagaacagcatatgttgtagtgacagccgtgattgccatgatattccccttcttcaatgacttcttgggtttgatcggggcagcatcgttctatccattaactgtctacttcccaatagagatgcacattgcccagagaaagataccaaagtattctttcacatgggtatggctgaaaattttgagctggacttgcctggttgtatcacttgttgcagctgctggatctatccagggtcttgtcacttctctcaagcattacaagcctttctcaactcaacaataa；ntaap6蛋白序列（501 aa）：mapefqkntmyvstelergdvqknfdddgrekrtgtlltasahiitavigsgvlslawaiaqlgwvagpavlfafsfityftstlladcyrspgpisgkrnytymdvvrshlggvkvtlcglaqyanlvgvtigytitasismvavkrsncfhkhgheascsissypymiifaviqvvlsqipnfhklswlsilaavmsftyasiglglsiakaagvghhvktsltgttvgvdvsgsekiwksfqaigdiafayaystvlieiqastlslililifskillrrrdtlrsqppeskvmkraslagvstttlfyilcgtigyaafgndapgnfltgfgfyepfwlidfanvciavhlvgayqvfcqplygfvearcnerwsdskfitseyavqvpccgvynvnlfrlvwrtayvvvtaviamifpffndflgligaasfypltvyfpiemhiaqrkipkysftwvwlkilswtclvvslvaaagsiqglvtslkhykpfstqq*。
10.pcr扩增获得烟草ntaap3基因用引物对，具体如下：上游引物ntaap3
‑
f：5
’‑
atgggagaaaacaacaacgttgc
‑3’
，下游引物ntaap3
‑
r：5
’‑
tcaagtcgtcttaaaaggcttg
‑3’
。
11.一种获得烟草ntaap3基因的pcr扩增方法，以红花大金元cdna为模板，利用引物对ntaap3
‑
f、ntaap3
‑
r进行pcr扩增。
12.pcr扩增获得烟草ntaap6基因用引物对，具体如下：上游引物ntaap6
‑
f：5
’‑
atggcacccgaatttcagaagaa
‑3’
，下游引物ntaap6
‑
r：5
’‑
ttattgttgagttgagaaaggc
‑3’
。
13.一种获得烟草ntaap6基因的pcr扩增方法，以红花大金元cdna为模板，利用引物对ntaap6
‑
f、ntaap6
‑
r进行pcr扩增。
14.一种用于沉默烟草ntaap3基因的基因编辑载体，具体通过如下步骤构建获得：（1）首先，针对ntaap3基因（靶位点具体序列：gtgactgaatccaagtgctttg），设计编辑引物序列如下：ntaap3
‑
k
‑
f：5
’‑
gattgtgactgaatccaagtgctttg
‑3’
，ntaap3
‑
k
‑
r：5
’‑
aaaccaaagcacttggattcagtcac
‑3’
；（2）随后，退火操作方式获取靶位点双链dna；（3）再后，对crispr/cas9载体pore
‑
cas9/grna使用bsa
ꢀⅰ
酶切，并将酶切产物与上述退火产物进行连接；（4）最后，将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，并筛选、鉴定，确保重组正确。
15.一种用于沉默烟草ntaap3基因的基因编辑载体，具体通过如下步骤构建获得：（1）首先，针对ntaap6基因（靶位点具体序列：gtatcaacagaactcgaaag），设计编辑引物序列如下：ntaap6
‑
k
‑
f：5
’‑
gattgtatcaacagaactcgaaag
‑3’
，ntaap6
‑
k
‑
r：5
’‑
aaacctttcgagttctgttgatac
‑3’
。
16.（2）随后，退火操作方式获取靶位点双链dna；（3）再后，对crispr/cas9载体pore
‑
cas9/grna使用bsa
ꢀⅰ
酶切，并将酶切产物与上述退火产物进行连接；（4）最后，将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，并筛选、鉴定，确保重组正确。
17.一种获得ntaap3基因沉默烟草新品种的培育方法，将沉默烟草ntaap3基因的基因编辑载体转化农杆菌作为侵染液，再转化烟草，最后筛选、鉴定获得ntaap3基因沉默烟草新品种。
18.一种获得ntaap6基因沉默烟草新品种的培育方法，将沉默烟草ntaap6基因的基因编辑载体转化农杆菌作为侵染液，再转化烟草，最后筛选、鉴定获得ntaap6基因沉默烟草新品种。
19.现有技术中，针对烟草中ntaap2基因功能虽然有了初步研究，但进一步对于ntaap3、ntaap6研究表明，虽然这三个基因均属于aaps基因家族成员，但其实际功能仍然有明显区别的。具体而言：ntaap2基因在烟草盛花期的根和茎中高表达，尤其在茎中表达量较高，而ntaap3基因在旺长期和打顶期的叶片中表达量明显高于其它器官，ntaap6基因在根和叶中，尤其是在叶中表达量明显高于其它器官，这一结果说明ntaap3、ntaap6这两个基因在烟草的不同生长发育时期、不同组织中发挥的功能是不一样的。另一方面，从基因突变体新品种构建角度而言，由于rnai沉默技术存在脱靶率高、沉默效果差、转化率低等缺陷，本技术采用crispr/cas9基因编辑技术设计了新的基因突变体转化技术，从而可为新品种培
育奠定一定技术基础。
20.总体上，本技术通过对蛋白含量变化、光合指数变化情况、色素含量变化情况等生理性状的检测分析，对ntaap3基因、ntaap6基因与氨基酸调控、蛋白质含量调控以及色素含量调控之间的关系进行了初步明确。基于这些研究，对于阐述ntaap3基因、ntaap6基因对氨基酸的吸收、转运、氮素利用和调控植物抗逆性等方面的功能奠定理论基础，也可为提高烟草对氮素的高效利用、更可为烟草新品种培育奠定一定技术基础。
附图说明
21.图1为总rna电泳结果，其中：m：trans2k dna marker；1
‑
2为针对ntaap3基因克隆时所提取总rna电泳结果（图中为28 s、18 s和5 s条带，其中1
‑
2为不同样品的总rna结果），3
‑
4为针对ntaap6基因克隆时所提取总rna电泳结果（图中为28 s、18 s和5 s条带，其中3
‑
4为不同样品的总rna结果）；图2为pcr产物电泳结果，其中：m：trans2k dna marker，左侧为ntaap3基因pcr扩增后电泳结果，右侧为ntaap6基因pcr扩增后电泳结果；图3 ntaap3基因在普通烟草红花大金元不同时期和组织中的相对表达量；图4 ntaap6基因在普通烟草红花大金元不同时期和组织中的相对表达量；图5为基因编辑突变体鉴定过程中第一轮pcr电泳结果，其中：m：dl5000 dna marker；上图为部分ntaap3基因编辑突变体鉴定结果（1～8为待鉴定烟株样品编号）；下图为部分ntaap6基因编辑突变体鉴定结果（1～5为待鉴定烟株样品编号）；图6为部分基因编辑突变体样品的第二轮pcr电泳结果，其中：m：dl5000 dna marker；上图为ntaap3基因编辑突变体第二轮pcr电泳结果（图中1～8为待鉴定烟苗样品，与图5样品相对应）；下图为ntaap6基因编辑突变体第二轮pcr电泳结果（图中1～5为待鉴定烟苗样品，与图5样品相对应）图7为部分基因编辑突变体样品测序分析结果，其中：上图为ntaap3基因编辑突变体测序分析结果（图中编号2、6、7与图5中样品编号相一致）；下图为ntaap6基因编辑突变体测序分析结果（图中编号3、4与图5中样品编号相一致）；图8为ntaap3基因编辑突变体农艺性状统计结果（每组柱状图中，从左至右分别对应图例从上到下标识）图9为ntaap6基因编辑突变体农艺性状统计结果；图10为基因突变体烤后烟叶总蛋白质含量变化，其中：上图为ntaap3基因突变体烤后烟叶总蛋白质含量变化；下图为ntaap6基因突变体烤后烟叶总蛋白质含量变化；图11为基因突变体烤后烟叶氨基酸含量变化，其中：上图为ntaap3基因突变体烤后烟叶氨基酸含量变化；下图为ntaap6基因突变体烤后烟叶氨基酸含量变化（每组柱状图，从左至右分别对应为酪氨酸、脯氨酸、天冬酰胺）；图12为ntaap3基因突变体在正常条件下的fv/fm值（上图）、npq值（下图）；图13为ntaap6基因突变体在正常条件下的fv/fm值（上图）、npq值（下图）；图14为ntaap3基因突变体在强光胁迫下的fv/fm值（上图）、npq值（下图）；图15为 ntaap6基因突变体在强光胁迫下的fv/fm值（上图）、npq值（下图）；图16为 ntaap3基因突变体叶绿素a含量（上图）、叶绿素b含量（下图）；
图17为ntaap6基因突变体叶绿素a含量（上图）、叶绿素b含量（下图）；图18为ntaap3基因突变体总叶绿素含量（上图）、胡萝卜素含量（下图）；图19为 ntaap6基因突变体总叶绿素含量（上图）、类胡萝卜素含量（下图）。
具体实施方式
22.下面结合实施例对本技术做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
23.生物材料：普通烟草红花大金元，室内培养在国家烟草基因研究中心（郑州）温室培养，培养条件：温度（23
±
1）℃，相对湿度（60
±
2）%，光照/黑暗16 h/8 h；大田种植培养在云南玉溪完成；相关引物合成与测序，由北京擎科新业生物科技有限公司提供完成；实验试剂：easypure plant rna kit、easypure plant genomic dna kit、transstart green qpcr supermix、transscript reverse transcriptase、2
×
transtaq high fidelity (hifi) pcr supermix、peasy
‑
t1 cloning kit、trans5α chemically competent cell、trans2k dna marker购自北京全式金生物技术有限公司；dl5000 dna marker购自北京擎科新业生物技术有限公司。
24.实施例1本实施例首先就ntaap3基因、ntaap6基因的获得过程简介如下。
25.（一）设计pcr扩增用引物基于已有烟草基因组序列，针对目的基因ntaap3、ntaap6，分别设计pcr扩增用引物序列如下：上游引物ntaap3
‑
f：5
’‑
atgggagaaaacaacaacgttgc
‑3’
，下游引物ntaap3
‑
r：5
’‑
tcaagtcgtcttaaaaggcttg
‑3’
；上游引物ntaap6
‑
f：5
’‑
atggcacccgaatttcagaagaa
‑3’
，下游引物ntaap6
‑
r：5
’‑
ttattgttgagttgagaaaggc
‑3’
。
26.（二）制备pcr扩增用模板以红花大金元烟草叶片为样品来源，液氮冷冻并研磨后，参考easypure plant rna kit说明书，提取总rna，使用nanodrop 2000超微量分光光度计检测rna的浓度和纯度，确保满足使用需要后，参考transscript reverse transcriptase说明书，进一步将所提取总rna反转录成cdna备用，以此cdna作为后续pcr扩增用模板。
27.不同样品所提取总rna电泳结果如图1所示，可以看出：提取的烟草叶片总rna的18 s和28 s条带清晰，无明显降解。进一步利用超微量分光光度计nanodrop 2000测定的rna浓度在900～1000 ng/
µ
l之间，od
260
/od
280
在1.8～2.0之间，满足后续实验要求。
28.（三）pcr扩增参考2
×
transtaq high fidelity (hifi) pcr supermix说明书，以步骤（二）所制备cdna为模板，利用步骤（一）中所设计引物进行pcr扩增，50 μl扩增体系设计如下：cdna模板，2 μl；
上游引物，（10 μmol/l）1 μl；下游引物，（10 μmol/l）1 μl；2
×
transtaq hifi pcr supermix ，25 μl；超纯水，添加至50 μl；pcr反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。
29.对pcr扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果如图2所示，可以看出：在1500 bp左右处有清晰条带。
30.随后，胶回收目的片段，按照peasy
‑
t1 cloning kit说明书进行连接转化，进一步筛选、菌落pcr鉴定后，送至北京擎科生物科技有限公司测序鉴定（具体序列信息如seq id no.1~4所示，与预期的ntaap3的1440 bp基因序列长度、ntaap6基因的1506 bp长度结果相符）。
31.在上述测序结果基础上，利用real
‑
time pcr技术发明人进一步对ntaap3基因、ntaap6基因的表达模式进行了具体分析，具体过程简介如下。
32.首先，基于测序所得ntaap3、ntaap6基因cds序列，设计real
‑
time pcr引物用引物序列如下：上游引物ntaap3
‑
qf：5
’‑
agtgtggtccattgaactcagaa
‑3’
，下游引物ntaap3
‑
qr：5
’‑
tatgatatgagcacttgccgtc
‑3’
；上游引物ntaap6
‑
qf：5
’‑ꢀ
acacacacgcgcgctaaa
‑3’
，下游引物ntaap6
‑
qr：5
’‑
gaccagccacccatcctaac
‑3’
；同时，针对内参基因l25基因，设计pcr扩增用引物序列如下：l25
‑
f：5
’‑
cccctcaccacagagtctgc
‑3’
，l25
‑
r：5
’‑
aagggtgttgttgtcctcaatctt
‑3’
随后，以l25基因作为内参基因，以cdna为模板，参考transstart green qpcr supermix说明书，设计20 μl扩增体系如下：cdna模板，1 μl；上游引物，（10 μmol/l）0.4 μl；下游引物，（10 μmol/l）0.4 μl；2
×
transstart green qpcr supermix，10 μl；nuclease
‑
free water补至20 μl；反应条件为：94℃、30 s；94℃、5 s，60℃、30 s，45个循环；4℃保存。每份样品重复检测三次，求平均值，利用2
‑△△
ct
法计算结果。
33.表达模式结果分析表明：ntaap3基因在叶片中的表达量明显高于其它器官（p＜0.05），尤其是在旺长期和打顶期（具体结果参看图3所示）；与此类似，ntaap6基因在根和叶，尤其是在叶中表达量也明显高于其它器官（具体结果参看图4所示）。
34.实施例2在实施例1基础上，为确定ntaap3、ntaap6基因的具体功能，利用crispr/cas9技术，发明人进一步构建了基因编辑载体，并进行了基因沉默，以具体明确这两个基因功能。本实施例就相关实验情况具体简介如下。
35.（一）基因编辑载体构建（1）首先，针对ntaap3基因（靶位点具体序列：gtgactgaatccaagtgctttg），设计编辑引物序列如下：ntaap3
‑
k
‑
f：5
’‑
gattgtgactgaatccaagtgctttg
‑3’
，ntaap3
‑
k
‑
r：5
’‑
aaaccaaagcacttggattcagtcac
‑3’
；针对ntaap6基因（靶位点具体序列：gtatcaacagaactcgaaag），设计编辑引物序列如下：ntaap6
‑
k
‑
f：5
’‑
gattgtatcaacagaactcgaaag
‑3’
，ntaap6
‑
k
‑
r：5
’‑
aaacctttcgagttctgttgatac
‑3’
。
36.（2）随后，参考annealing buffer for dna oligos (5
×
)试剂盒说明书，通过退火操作获取靶位点双链dna；具体反应时，20 μl反应体系设计如下：上游引物，4 μl（50 μmol/l）；下游引物，4 μl（50 μmol/l）；annealing buffer for dna oligos (5
×
)， 4 μl；nuclease
‑
free water，补至20 μl；具体退火反应条件为：95℃ 5 min，每间隔8 s下降0.1 ℃，直至25℃；反应产物直接应用或者4 ℃保存备用。
37.（3）再后，对crispr/cas9载体pore
‑
cas9/grna使用bsa
ꢀⅰ
酶切，并将酶切产物与上述退火产物进行连接；具体酶切时，20 μl酶切体系设计如下：pore
‑
cas9/grna载体，3 μl；10
×ꢀ
buffer，2 μl；bsa
ꢀⅰ
酶，1 μl；无菌水，补至20 μl；37 ℃酶切1 h。
38.具体连接时，20 μl连接体系设计如下：载体酶切产物，3 μl；退火产物，6 μl；10
×ꢀ
t4 dna ligase buffer，2 μl；t4 dna ligase，1 μl；无菌水，补至20 μl；16℃连接30 min。
39.（4）最后，将上述连接产物转化trans5α chemically competent cell（大肠杆菌感受态细胞），并进行筛选和菌落pcr鉴定（针对ntaap3的基因编辑载体，鉴定时，采用引物对u26
‑
jiance
‑
f、ntaap3
‑
k
‑
r；针对ntaap6的基因编辑载体，鉴定时，采用引物对u26
‑
jiance
‑
f、ntaap6
‑
k
‑
r；u26
‑
jiance
‑
f：5
’‑
ttaggtttacccgccaata
‑3’
）；对鉴定正确的阳性克隆质粒进一步进行测序鉴定，确保重组正确。
40.（二）制备转染液将上述步骤（一）中测序鉴定正确的阳性克隆（重组正确的基因编辑载体）进一步
扩增后，利用电转法将基因编辑载体转入农杆菌gv3101，并进一步筛选、和进行菌落pcr鉴定，确保转化正确。对鉴定正确的转化菌，使用kan
+
和rif
+
两种抗性的lb液体培养基进一步扩大培养，待od值为0.6～0.8时，离心收集菌体，然后用ms0液体培养基（ms0液体培养基：4.4 g/l ms无机盐，ph值5.8～5.9）重悬菌体至od值为0.2～0.3，作为转染液备用。
41.（三）转化、筛选采用叶盘转化法，利用步骤（二）所制备转染液进一步转化烟草，并进行筛选鉴定阳性转化材料。
42.具体转化操作可参考如下：将烟草无菌苗叶片切成0.5～1 cm2正方形叶盘，浸入转染液中7～9 min，取出叶片，用无菌吸水纸吸去叶片上残留菌液，转移至ms固体培养基上；22 ℃～25 ℃暗培养2 d，转移至ms（kan
+
）分化培养基，在28 ℃光照16 h、25 ℃黑暗8 h、相对湿度60%条件下培养，每隔8～10 d更换新鲜培养基，直至长出不定芽；待不定芽长至约1 cm时，将其切取并转入伸长培养基培养，两周后转移至生根培养基继续培养；待根系生长良好后，从培养基转移至育苗基质中培养。
43.具体培养基配方可参考如下：ms培养基：4.4 g/l ms无机盐，30 g/l蔗糖，2.5 g/l植物凝胶，ph值5.8～5.9；ms（kan
+
）分化培养基：4.4 g/l ms无机盐，30 g/l蔗糖，1 mg/l 6
‑
ba，0.1 mg/l naa，150 mg/l卡那霉素，250 mg/l头孢噻肟钠，2.5 g/l植物凝胶，ph值5.8～5.9；伸长培养基：4.4 g/l ms无机盐，30 g/l蔗糖，0.1 mg/l 6
‑
ba，150 mg/l卡那霉素，250 mg/l头孢噻肟钠，2.5 g/l植物凝胶，ph值5.8～5.9；生根培养基：4.4 g/l ms无机盐，30 g/l蔗糖，0.002 mg/l naa，150 mg/l卡那霉素，250 mg/l头孢噻肟钠，2.5 g/l植物凝胶，ph值5.8～5.9。
44.具体筛选鉴定时：首先，提取待鉴定的烟草叶片dna，并以此作为pcr扩增用模板；随后，分别利用ntaap3
‑
k
‑
f/ntaap3
‑
k
‑
r、ntaap6
‑
k
‑
f/ntaap6
‑
k
‑
r引物对组合进行第一轮pcr扩增，并对pcr扩增产物电泳检测、和胶回收扩增产物；最后，以上述胶回收的第一轮pcr扩增产物为模板，利用靶点特异性引物对ntaap3
‑
jd
‑
f/ntaap3
‑
k
‑
r（ntaap3
‑
jd
‑
f：5
’‑
ataacagctgtgattggtt
‑3’
）、ntaap6
‑
jd
‑
f/ntaap6
‑
k
‑
r（ntaap6
‑
jd
‑
f：5
’‑
actaacggcaagtgcacat
‑3’
）分别进行第二轮pcr扩增，并对pcr扩增产物进行电泳检测。
45.基于第二轮扩增产物结果，如果产物较少或没有产物，即为潜在的纯合突变体，随后将对应的第一轮pcr产物克隆转化并进行测序分析，以确定是否为纯合突变体。
46.第一轮pcr扩增产物的电泳结果如图5所示。可以看出，相关基因编辑突变体样品均扩增获得了特异性目的条带。
47.第二轮pcr扩增产物的电泳结果如图6所示。可以看出，部分编辑突变体样品的pcr产物较少，可为作为潜在的纯合突变体，以便用于进一步鉴定。
48.进一步测序鉴定结果表明（图7所示），可以看出：针对ntaap3基因编辑突变体，在靶位点处发生了碱基替换g
→
a，并且该碱基替换造成了原有氨基酸序列的改变，引起了ntaap3蛋白功能丧失，这一结果表明成功获得了阳性ntaap3基因编辑突变体烟苗；而针对
ntaap6基因，测序结果显示在靶位点处发生了碱基替换g
→
t，并且该碱基替换造成了原有氨基酸序列的改变，引起了ntaap6蛋白功能丧失，这一结果表明成功获得了阳性ntaap6基因编辑突变体烟苗。
49.（四）基因编辑后烟草性状变化情况基于上述筛选所得纯合突变体，在云南玉溪开展大田种植，并在打顶期前后对株高、叶数、茎围、节距、最大腰叶长/宽等农艺性状进行统计分析。
50.栽种过程中，同步对编辑突变体烟叶蛋白质、氨基酸、色素含量进行检测（烟叶总蛋白测定方法按照行业标准方法《yc/t 249
‑
2008烟草及烟草制品 蛋白质的测定》，采用连续流动法分别测定鲜烟叶及烤后烟叶中蛋白质含量；氨基酸含量测定按照行业标准方法《yct 282
‑
2009烟叶 游离氨基酸的测定》，进行各种氨基酸含量检测；按照《yc/t 382
‑
2010 烟草及烟草制品 质体色素的测定 高效液相色谱法》检测烟草中叶绿素和类胡萝卜素的含量）。
51.同时，栽种过程中，使用imaging
‑
pam——全叶片荧光成像系统对基因编辑突变体打顶后的各光合生理指数进行监测。
52.下面就具体实验结果简介如下。
53.（1）大田农艺性状统计结果部分大田农艺性状统计结果如图8、图9所示。可以看出，ntaap3基因编辑突变体、ntaap6基因编辑突变体相关性状表型类似，即：与对照组（hd）相比，基因编辑突变体自然株高和打顶株高有所降低，推测可能是因为ntaap3基因、ntaap6基因的突变影响了氨基酸转运和氮代谢，从而减少了总生物产量，但是最大腰叶长/宽无明显变化，不会影响总体烟叶产量。总体来说，基因编辑突变体的农艺性状更符合优质烤烟要求。
54.（2）烟叶蛋白质和氨基酸含量变化情况对基因编辑突变体烤后烟叶的总蛋白质含量和氨基酸含量测定结果如图10、图11所示。分析可以看出：与对照组红花大金元（hd）相比，ntaap3基因、ntaap6基因编辑突变体烤后烟叶的总蛋白质含量均有所降低，ntaap3突变体的总蛋白质含量降低了19.8%，ntaap6突变体的总蛋白质含量降低了8.4%；酪氨酸、脯氨酸和天冬酰胺这三种氨基酸含量低于对照，其中脯氨酸和天冬酰胺下降尤其显著，ntaap3突变体的脯氨酸下降了19.0%、天冬酰胺下降了68.1%，ntaap6突变体的脯氨酸下降了36.3%、天冬酰胺下降了62.9%；表明ntaap3基因、ntaap6基因的突变在一定程度上降低了氨基酸的转运效率和蛋白质的积累。
55.需要解释的是，结合卷烟成品制造角度而言，获得燃吸时苯酚释放量低的卷烟原料是相关品种改良的主要技术目标，因此上述氨基酸含量测定时，仅以制备卷烟成品的直接原料烤烟为准，对其中的部分典型氨基酸含量进行了测定，从而可以更为直接的反应本技术的技术效果。
56.（3）光合生理变化情况光合生理分析结果表明（结果如图12、图13、图14、图15所示），ntaap3基因编辑突变体、ntaap6基因编辑突变体的相关变化趋势较为一致，具体而言：与对照组hd相比，ntaap3基因编辑突变体、ntaap6基因编辑突变体在正常条件下的fv/fm值无明显差异，而npq值有所上升，这说明ntaap3基因、ntaap6基因被编辑后，对植株的光合效率并未产生太大影响，而植株的光保护能力有所提升。
57.进一步强光条件（60000～70000 lux）下的测定结果表明，与对照组hd相比，ntaap3基因编辑突变体、ntaap6基因编辑突变体在强光胁条件下的fv/fm和npq值显著下降。光照增强时植物的光合效率理应提升，同时植物还会启动热耗散即光保护机制，而ntaap3突变体、ntaap6基因编辑突变体的fv/fm和npq值不升反降，这表明基因被编辑后，影响了氨基酸的转运速率，可能会导致植株的光合效率下降，进而削弱植物的光保护能力。
58.（4）色素含量变化情况不同类型色素含量（收获期鲜烟叶）测定结果如图16、图17、图18、图19所示。ntaap3基因编辑突变体、ntaap6基因编辑突变体的相关变化趋势较为一致，具体而言：ntaap3基因编辑突变体、ntaap6基因编辑突变体的叶绿素a/b、总叶绿素和类胡萝卜素含量均有所升高，其中ntaap3突变体的叶绿素a升高了10.5%、叶绿素b升高了17.5%、总叶绿素升高了12.6%、类胡萝卜素升高了6.4%，ntaap6突变体的叶绿素a升高了15.8%、叶绿素b升高了15.4%、总叶绿素升高了15.7%、类胡萝卜素升高了21.4%。这表明基因的突变尽管影响了氨基酸转运和蛋白质积累，但并未降低烟草的色素含量。而类胡萝卜素含量的高低能够影响烟叶的外观和内在品质，其降解和热裂解产物包含许多香气物质，与烟叶的香气关系密切，突变体在降低氨基酸和蛋白质含量的基础上，还保障了烟叶的内外优良品质。
59.氨基酸是植物体内非常重要的含氮化合物，在植物的生长发育、代谢调节等过程中发挥着举足轻重的作用，而氨基酸转运蛋白在植物体内的氨基酸转运过程中扮演着不可或缺的角色。氨基酸通透酶（aaps）作为氨基酸转运蛋白的一个亚家族，在植物整个生长发育时期的不同组织和器官中广泛参与氨基酸的转运和吸收。
60.本技术中，通过上述对ntaap3基因、ntaap6基因功能的初步研究，可以初步证实：ntaap3基因在叶片中高表达，在将其突变后，对于氨基酸的转运速率具有直接影响，尤其是明显降低了脯氨酸、天冬酰胺等氨基酸含量的下降，并进而导致总蛋白质含量的降低；另一方面，ntaap3突变体中的叶绿素a/b、总叶绿素和类胡萝卜素等色素类物质含量有明显升高；与ntaap3基因类似，ntaap6基因在根和叶中高表达，在将其突变后，对于氨基酸的转运速率具有直接影响，尤其是明显降低了脯氨酸、天冬酰胺等氨基酸含量的下降，并进而导致总蛋白质含量的降低；另一方面，ntaap6突变体中的叶绿素a/b、总叶绿素和类胡萝卜素等色素类物质含量有明显升高。
61.结合相关测定结果，进一步将ntaap3和ntaap6基因编辑突变体中部分成分变化情况统计如下表1所示。
62.表1， ntaap3和ntaap6基因编辑突变体各成分变化统计注：表中
↑
、
↓
表示的相对于对照的变化趋势。
63.结合上表数据，可以直观的看出：ntaap3和ntaap6基因编辑突变体之间比较而言，ntaap3突变体的总蛋白质、天冬酰胺的降幅大于ntaap6突变体，ntaap3的降幅分别是ntaap6的2.36倍、1.08倍；叶绿素b的增幅大于ntaap6突变体，ntaap3的增幅是ntaap6的1.14倍。而ntaap6突变体的脯氨酸的降幅大于ntaap3突变体，ntaap6的降幅是ntaap3的1.91倍；叶绿素a、总叶绿素、类胡萝卜素的增幅大于ntaap3突变体，ntaap6的增幅分别是ntaap3的1.50倍、1.25倍、3.34倍。
64.这些数据进一步表明，ntaap3和ntaap6基因虽然在一些方面发挥了相似的功能，但是它们还是存在一定差异的。