一种新型松材线虫检测方法

1.本发明属于植物病虫害检测技术领域，具体涉及一种新型松材线虫检测方法。


背景技术：

2.松材线虫是引起松树萎蔫病的病原线虫。1982年我国首次在南京中山陵景区黑松上发现该病。截止至2015年，松材线虫病疫区已达16个省区。该病致病力强，寄主死亡速度快，传播快，且常常猝不及防,一旦发生，治理难度大。据不完全统计，我国有超过5000万株的松树死于松材线虫病，损失木材超过500万m3，累计发生面积达8.67万hm2，导致的直接经济损失约25亿元，间接损失约250亿元，对我国的天然林保护和林业生态环境建设造成重大威胁。全球有52个国家将其列为检疫性病虫害，在我国也将其列为2类检疫性有害生物。
3.目前，松材线虫的检测方法主要有形态学检测法，生物化学检测法和分子生物学检测法。但这些检测方法存在着耗时长，对操作人员要求高、假阴性和假阳性出现频率高，定量检测结果不准确，pcr反应抑制剂影响检测结果等缺点，已不能满足松材线虫检测的需要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种新型松材线虫检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种新型松材线虫检测方法，包括如下操作步骤：
7.a：枯死松木样品中提取松材线虫dna
8.s1：将当年死亡的马尾松伐倒，在树干的中部截取5cm左右厚度的圆盘，带回实验室，使用电钻钻取树皮以内芯材以外部位，收集木屑；
9.s2：称取50mg松木屑样品，放入2ml离心管中；
10.s3：加入400μl溶液a，枪头搅拌混匀，冰上放置5min，沸水浴5min；
11.s4：加入400μl溶液b，枪头搅拌混匀，沸水浴8min；
12.s5：12000rpm离心10min；
13.s6：吸取500μl上清到另外一个离心管中，加入500μl无水乙醇混匀；
14.s7：将溶液加入吸附柱中，放置2分钟；
15.s8：将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2分钟，弃废液；
16.s9：向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放入收集管中；
17.s10：向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放入收集管中；
18.s11：12000rpm离心2分钟，室温放置或50℃放置数分钟，去除残余的漂洗液；
19.s12：将吸附柱放入一个干净的离心管中，向膜中央滴加100μl 65℃预热的洗脱
液，室温放置5分钟，12000rpm离心2分钟；
20.s13：将洗脱液再次加入吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟，离心液即为制备的dna溶液；
21.b：微滴式数字pcr反应
22.微滴式数字pcr检测平台反应总体积为20μl，包括：
[0023]2×
supermix 10μl；
[0024]
上游引物p1904-f 0.9μl，10μmol/l；
[0025]
上游引物p2057-r 0.9μl，10μmol/l；
[0026]
探针0.2μl，10μmol/l；
[0027]
样品dna 5μl，去离子水3μl；
[0028]
将配制好的20μl反应液加入到微滴发生卡的sample孔位中，在微滴发生卡的oil孔位内加入70μl微滴生成油，将微滴发生卡放入到微滴生成仪中生成微滴，微滴生成后，将生成的微滴移至96孔板中，封膜后进行pcr扩增，pcr反应参数为：95℃预变性10分钟，95℃变性10秒，55℃退火及延伸45秒，40个循环，98℃固化微滴10分钟，所有反应步骤升降温速率设定为2℃/秒；
[0029]
c：微滴式数字pcr反应结果的读取
[0030]
扩增反应完成后，将96孔板放入微滴读取仪中进行微滴读取和数据采集，通过软件生成的散点图判定样品中是否含有松材线虫及松材线虫的含量，散点图中有阳性微滴的表示样品中有松材线虫判定为感病，样品中没有阳性微滴则判定为阴性，为未感染线虫样品。
[0031]
作为优选，步骤s3中溶液a的成分为：
[0032]
3mol
·
l-1
ch5n3·
hscn；
[0033]
50mmol
·
l-1
tris-hcl，ph8.0；
[0034]
20mmol
·
l-1
edta，ph 8.0；
[0035]
1％triton x-100。
[0036]
作为优选，步骤s3中溶液b的成分为：5％(w/v)chelex-100。
[0037]
作为优选，步骤s9中漂洗液的成分为10mm tirs-hcl并预混80％无水乙醇。
[0038]
作为优选，步骤b中松材线虫特异性引物、探针序列为：
[0039]
p1904-f：ctacgtgctgttgttgag；
[0040]
p2057-r：tccaccggagtaacttaa；
[0041]
探针：probe-1938：5'-fam-ccgacagatgagaccagcca-bhq-3'。
[0042]
本发明的技术效果和优点：
[0043]
本发明针对现有松材线虫的检测方法费时、费力、假阴性高、只能定性检测的缺点，提供了一种能快速、简易、高通量、高灵敏度检测松木样品中松材线虫的方法。本发明的方法及其专用引物探针组合具有极高的特异性和灵敏度，能大幅提高松材线虫检测的效率和准确性，减少假阴性结果的产生。应用本发明所提供的检测方法，普通操作人员就能快速准确地对松木样品进行检测。
[0044]
用本方法检测快速简单，灵敏度高特异性好。应用本方法不仅能够降低假阴性产生的几率，还可对样品中松材线虫的数量进行精确的定量，可为松材线虫的病理及生态学
研究提供一个有力的工具。
附图说明
[0045]
图1为松材线虫微滴式数字pcr检测体系特异性检测图；
[0046]
图2为数字pcr检测模拟带线虫样品图；
[0047]
图3为数字pcr检测林间枯死松树样品图。
具体实施方式
[0048]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0049]
实施例
[0050]
一种新型松材线虫检测方法，包括如下操作步骤：
[0051]
a：枯死松木样品中提取松材线虫dna
[0052]
s1：将当年死亡的马尾松伐倒，在树干的中部截取5cm左右厚度的圆盘，带回实验室，使用电钻钻取树皮以内芯材以外部位，收集木屑；
[0053]
s2：称取50mg松木屑样品，放入2ml离心管中；
[0054]
s3：加入400μl溶液a，枪头搅拌混匀，冰上放置5min，沸水浴5min；
[0055]
s4：加入400μl溶液b，枪头搅拌混匀，沸水浴8min；
[0056]
s5：12000rpm离心10min；
[0057]
s6：吸取500μl上清到另外一个离心管中，加入500μl无水乙醇混匀；
[0058]
s7：将溶液加入吸附柱中，放置2分钟；
[0059]
s8：将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2分钟，弃废液；
[0060]
s9：向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放入收集管中；
[0061]
s10：向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放入收集管中；
[0062]
s11：12000rpm离心2分钟，室温放置或50℃放置数分钟，去除残余的漂洗液；
[0063]
s12：将吸附柱放入一个干净的离心管中，向膜中央滴加100μl 65℃预热的洗脱液，室温放置5分钟，12000rpm离心2分钟；
[0064]
s13：将洗脱液再次加入吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟，离心液即为制备的dna溶液；
[0065]
上述步骤不仅可对松木样品中线虫dna进行提取，还可对纯培养或天牛中的各虫态松材线虫基因组dna进行提取。
[0066]
b：微滴式数字pcr反应
[0067]
微滴式数字pcr检测平台反应总体积为20μl，包括：
[0068]2×
supermix 10μl；
[0069]
上游引物p1904-f 0.9μl，10μmol/l；
[0070]
上游引物p2057-r 0.9μl，10μmol/l；
[0071]
探针0.2μl，10μmol/l；
[0072]
样品dna 5μl，去离子水3μl；
[0073]
将配制好的20μl反应液加入到微滴发生卡的sample孔位中，在微滴发生卡的oil孔位内加入70μl微滴生成油，将微滴发生卡放入到微滴生成仪中生成微滴，微滴生成后，将生成的微滴移至96孔板中，封膜后进行pcr扩增，pcr反应参数为：95℃预变性10分钟，95℃变性10秒，55℃退火及延伸45秒，40个循环，98℃固化微滴10分钟，所有反应步骤升降温速率设定为2℃/秒；
[0074]
c：微滴式数字pcr反应结果的读取
[0075]
扩增反应完成后，将96孔板放入微滴读取仪中进行微滴读取和数据采集，通过软件生成的散点图判定样品中是否含有松材线虫及松材线虫的含量，散点图中有阳性微滴的表示样品中有松材线虫判定为感病，样品中没有阳性微滴则判定为阴性，为未感染线虫样品。
[0076]
步骤s3中溶液a的成分为：
[0077]
3mol
·
l-1
ch5n3·
hscn；
[0078]
50mmol
·
l-1
tris-hcl，ph8.0；
[0079]
20mmol
·
l-1
edta，ph 8.0；
[0080]
1％triton x-100。
[0081]
步骤s3中溶液b的成分为：5％(w/v)chelex-100。
[0082]
步骤s9中漂洗液的成分为10mm tirs-hcl并预混80％无水乙醇。
[0083]
通过在genbank中搜索已发布的松材线虫及其相近种线虫的dna基因序列，根据松材线虫和其它线虫的16srdna之间的差异设计数字pcr上游、下游引物及探针，步骤b中松材线虫特异性引物、探针序列为：
[0084]
p1904-f：ctacgtgctgttgttgag；
[0085]
p2057-r：tccaccggagtaacttaa；
[0086]
探针：probe-1938：5'-fam-ccgacagatgagaccagcca-bhq-3'。
[0087]
图1中a01、b02、b03、b01、c01、为松材线虫，g03、g02为拟松材线虫，g01为秀丽隐杆线虫，f01为根结线虫，f02为空白对照；
[0088]
图2中e01为1条线虫；d01为2条线虫；c01为4条线虫；b01为8条线虫；a01为16条线虫；h04为阴性对照；f04为空白对照；
[0089]
图3中a02、b02、c02、d02、e02、f02、g02、h02、a03、b03、c03、d03、e03、f03、g03和h03为采集回的枯死松木样品，h04为阴性对照样品；f04为空白样品。
[0090]
检测结果如附图1-3所示，5株采集自不同地区的松材线虫可以生成阳性微滴，拟松材线虫、秀丽隐杆线虫和根结线虫则没有阳性微滴产生。说明这组引物探针特异性强，可以特异性的检测出松材线虫。
[0091]
本发明基于松材线虫16srdna基因设计特异性引物探针，优化反应条件，建立了松材线虫微滴式数字pcr检测体系。该检测体系可在多种线虫中特异的检测出松材线虫，而对其它种类线虫检测结果为阴性，使用该检测体系可检测出林间感病松树样品中的松材线虫和人工模拟带线虫样品中的松材线虫，该方法具有极高的灵敏度其检测下限可达10.07个
拷贝/20μl。本方法的建立除了具有检测快速、简便和准确的优点外，还可以实现对样品中的松材线虫进行绝对定量。
[0092]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。