一株亚硝酸盐高效降解菌株及其应用

本发明涉及一株菌株及其应用，具体涉及一株亚硝酸盐高效降解菌株及其应用，属于微生物
技术领域：
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背景技术：
：进入二十一世纪以来，我国水产养殖业迅猛发展，规模化、集约化和工厂化的养殖模式满足了人们对水产品的需求，节约了资源和成本，但养殖过程中水产动物排泄物和残饵的积累以及生物残骸的沉积，导致水体中氨氮和亚硝酸盐含量升高，这在一定程度上会危害养殖动物的健康，严重时可能造成死亡。亚硝酸盐可氧化血液中的亚铁血红蛋白，使其变成高铁血红蛋白，而高铁血红蛋白没有携氧能力，因而养殖动物的各组织就会出现缺氧现象。目前，去除亚硝酸盐的方法有化学降解法、物理吸附法及生物降解法。其中，生物降解法具有高效率、低成本、无二次污染等特点，被人们广泛应用。在生物降解法中，微生物制剂是常用的添加剂，它不仅能将水体中有毒的亚硝酸盐转化为无害的硝酸盐从而净化水质，而且还能促进养殖动物的健康生长。因此，筛选出一株能够高效降解亚硝酸盐的有益微生物具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一株亚硝酸盐高效降解菌株及其应用。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一株亚硝酸盐高效降解菌株no2-6，分类命名为芽孢杆菌bacillussp.，筛选自牟平海岸带底泥，对水体中的亚硝酸盐具有较高的去除能力，并且对水生生物无害，保藏编号为：cgmccno.21739，保藏日期为：2021年01月27日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：中国北京。前述的亚硝酸盐高效降解菌株no2-6在去除污水亚硝酸盐中的应用，其特征在于，前述亚硝酸盐高效降解菌株no2-6的工作浓度为≥1.0×103cfu/ml，实施温度为15~30℃。本发明的有益之处在于：（1）本发明筛选得到的菌株no2-6，对水体中的亚硝酸盐具有较高的降解能力，是一株亚硝酸盐高效降解菌株，在处理养殖污水、工业废水和生活污水中具有非常重要的应用价值；（2）本发明筛选得到的菌株no2-6，对水生生物无害，安全无污染，可以放心使用；（3）本发明筛选得到的菌株no2-6，易于培养，使用方便。附图说明图1是本发明筛选得到的菌株no2-6的菌落形态图；图2是不同浓度菌株no2-6的亚硝酸盐去除能力检测结果图；图3是不同浓度菌株no2-6在降解亚硝酸盐时污水中的硝酸盐含量变化图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。一、筛选菌株菌株筛选自牟平海岸带底泥，筛选过程具体如下：取10ml水样加入到100ml富集培养基（含有15mg/l亚硝酸钠的lb培养基）中，120r/min、30℃恒温振荡培养24h，取10ml培养24h后的培养液，将其加入到新鲜的富集培养基中，连续培养6天，驯化富集。取富集培养后的菌液，梯度稀释至106浓度，吸取100μl稀释液涂布于10个分离平板上，并将这10个平板分别标记为：no1、no2、no3、no4、no5、no6、no7、no8、no9、no10，30℃恒温培养24h，观察菌落形态。平板no2上的菌落与其他平板上的菌落相比，具有菌落种类多、形态差异大等特点，故从平板no2上挑取不同形态的10个单菌落继续进行多次分离纯化。纯化3次后，分别挑取单菌落到含1.5mllb培养基的离心管中，120r/min、30℃恒温振荡培养16h，得到10份菌液，将这10份菌液中的菌株分别标记为：no2-1、no2-2、no2-3、no2-4、no2-5、no2-6、no2-7、no2-8、no2-9、no2-10。分别吸取1ml菌液于2ml冻存管中，加入等体积60%的甘油，置于-80℃冰箱中保存。二、分析菌株的安全性用兔血琼脂平板划线法检测上述各菌株的安全性：（1）若菌落周围有透明圈，则菌株为α溶血（严重），有毒性；（2）若菌落周围有草绿圈，则菌株为β溶血（轻微），有毒性；（3）若菌落周围无变化，则菌株为γ溶血（不溶血），安全无毒。检测结果如下：菌株命名溶血环类型溶血类型no2-1-不溶血no2-2-不溶血no2-3-不溶血no2-4-不溶血no2-5-不溶血no2-6-不溶血no2-7-不溶血no2-8-不溶血no2-9-不溶血no2-10-不溶血由上表可知，这10株菌株均为无毒性菌株，都对水生生物无害，都可以应用到污水处理当中。三、检验菌株去除亚硝酸盐的能力用微量移液器移取15µl前面已经得到的冻存菌，将它们分别接种于1.5ml液体lb培养基中，120r/min、30℃恒温振荡培养16h，将菌株活化。然后将活化菌株按1：1000的体积比加入到100ml实验室养殖污水（亚硝酸盐含量为0.5mg/l）中，室温下静置24h。利用环凯亚硝酸盐测定试剂盒结合分光光度计法测定静置24h后实验室养殖污水中亚硝酸盐含量，并计算出亚硝酸盐去除率，计算结果如下：菌株命名亚硝酸盐去除率no2-118.52%no2-266.41%no2-379.39%no2-449.23%no2-529.65%no2-696.1%no2-732.07%no2-835.49%no2-927.89%no2-1020.68%通过上表可知上述10株菌对亚硝酸盐都具有不同程度的去除能力，其中，菌株no2-6具有最强的亚硝酸盐去除能力，亚硝酸盐去除率达到了96.1%，与其他菌株相比，显著地降低了水体中亚硝酸盐的含量。四、鉴定菌株分别提取菌株no2-1、no2-2、no2-3、no2-4、no2-5、no2-6、no2-7、no2-8、no2-9和no2-10的基因组，pcr扩增16s-rrna基因，用少量pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，其余pcr产物送于北京睿博（青岛）有限公司纯化并进行测序，测序结果用blast软件进行序列分析，并与genbank中已知的16s-rrna基因进行最高同源性比对。引物信息见下表：pcr反应体系见下表：pcr反应程序为：94℃变性30min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸10min，循环30次；72℃延伸15min。测序比对结果如下：菌株命名blast结果中文名称no2-1bacilluslicheniformis地衣芽孢杆菌no2-2bacillushaikouensisstrain海口芽孢杆菌no2-3bacillusvelezensis贝莱斯芽孢杆菌no2-4bacillusaryabhattaistrain阿氏芽孢杆菌no2-5bacilluslicheniformis地衣芽孢杆菌no2-6bacillussp.芽孢杆菌属no2-7bacillusamyloliquefaciens解淀粉芽孢杆菌no2-8bacillussubtilis枯草芽孢杆菌no2-9bacilluslicheniformis地衣芽孢杆菌no2-10bacillusvelezensis贝莱斯芽孢杆菌经16srrna基因分析，初步判断菌株no2-6为产芽孢类菌株。五、菌株no2-6形态观察和生理生化鉴定根据革兰氏染色、芽孢染色观察菌株no2-6的形态。根据《常见细菌系统鉴定手册》对菌株no2-6进行生理生化鉴定。需要鉴定的生理生化指标包括：酸碱耐受试验、高温耐受试验、高盐耐受试验、糖发酵试验、运动性实验、明胶液化试验、发酵产酸（of）试验、甲基红（mr）试验、乙酰甲基甲醇（v-p）试验、硫化氢试验、尿素酶试验和过氧化氢酶试验。菌株no2-6的菌落形态如图1所示，菌落呈乳白色，表面光滑湿润。经革兰氏染色和芽孢染色，确定菌株no2-6为产芽孢的杆状革兰氏阳性菌。菌株no2-6的生理生化试验结果如下表所示：测定项目测定结果测定项目测定结果甲基红（m.r.）+水解明胶+v-p试验+吲哚反应-运动性-碳源利用过氧化氢酶+葡萄糖+45℃下生长+果糖+ph5-8+蔗糖+3%nacl+淀粉+h2s酶-纤维二糖+脲酶-麦芽糖+由上表可知，菌株no2-6无运动性，可在酸性、碱性、高温及高盐条件下生长，过氧化氢酶阳性，不产h2s和脲酶，可液化明胶，vp阳性，mr阴性，可以利用葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纤维二糖和麦芽糖为碳源，但不产生气体。六、验证不同浓度的no2-6的亚硝酸盐去除能力将活化菌株no2-6按照1％的接种量接种到200mllb培养基中，120r/min、30℃恒温振荡培养16h。将菌液转入离心设备，高速离心收集菌体，以ph=7.4的pbs清洗菌体，并调节菌体浓度到1.0×109cfu/ml。将上述菌液进行梯度稀释，得到菌体浓度分别为1.0×104cfu/ml、1.0×105cfu/ml、1.0×106cfu/ml、1.0×107cfu/ml、1.0×108cfu/ml和1.0×109cfu/ml的菌液，按照1：100的体积比将上述各浓度梯度的菌液分别加入到200ml实验室养殖污水（亚硝酸盐含量为0.5mg/l）中，室温下静置24h，利用环凯亚硝酸盐测定试剂盒结合分光光度计法，分别检测静置6h、12h、18h和24h时实验室养殖污水中硝酸盐、亚硝酸盐和氨氮的浓度。其中，在不同静置时间（反应时间）点，实验室养殖污水中亚硝酸盐含量的检测结果（即不同浓度的菌株no2-6的亚硝酸盐去除能力的检测结果）见图2；不同浓度的菌株no2-6在降解亚硝酸盐时，实验室养殖污水中的硝酸盐的含量变化见图3；反应过程中，伴随着硝酸盐的累积和清除，氨氮未被检出。室温下静置24h后，计算不同浓度的菌株no2-6的亚硝酸盐去除率，计算结果如下：混合前菌体浓度（cfu/ml）工作浓度（cfu/ml）24h亚硝酸盐去除率1.0×1041.0×10260.5%1.0×1051.0×10382.3%1.0×1061.0×10482.4%1.0×1071.0×10587.7%1.0×1081.0×10690.3%1.0×1091.0×10796.1%由上表可知，按照1：100的体积比混合菌液和污水，当菌株no2-6混合前的菌体浓度达到1.0×105cfu/ml（对应的工作浓度为1.0×103cfu/ml）及以上时，菌液即可高效去除水体中的亚硝酸盐，亚硝酸盐去除率在80%以上。七、验证菌株no2-6的亚硝酸盐去除能力案例1：取烟台某水产品加工厂排放的废水，测得其亚硝酸盐的含量为0.54mg/l。将菌株no2-6按照前述方法制成菌体浓度为1.0×107cfu/ml的菌剂，随后将该菌剂按照1：100的体积比加入到该废水中，24℃静置处理24h后，测得该废水的亚硝酸盐的含量为0.06mg/l，亚硝酸盐去除率达到了92.3%。案例2：取案例1中的水产品加工厂排放的废水（亚硝酸盐的含量为0.54mg/l），将菌株no2-6按照前述方法制成菌体浓度为1.0×109cfu/ml的菌剂，随后将该菌剂用原池水按照1：99的体积比混合得到混合水，然后向混合水中添加红糖，每升混合水添加100g红糖，之后进行扩繁，扩繁的条件：37℃、静置24h，扩繁后将该菌剂按照1：100的体积比加入到该废水中，24℃静置处理24h后，测得该废水的亚硝酸盐的含量为0.05mg/l，亚硝酸盐去除率达到了90.7%。案例2与案例1相比可知：菌剂施用前先用原池水稀释再添加红糖进行扩繁，24℃静置处理24h后，亚硝酸盐去除效果相差不大，但是通过扩繁能够减少购买大量制剂的费用，从而可以降低养殖成本。案例3：取烟台某食品加工厂排放的废水，测得其亚硝酸盐的含量为0.36mg/l。将菌株no2-6按照前述方法制成菌体浓度为1.0×105cfu/ml的菌剂，随后将该菌剂按照1：100的体积比加入到该废水中，22℃静置处理24h后，该废水的亚硝酸盐的含量为0.06mg/l，亚硝酸盐去除率达到了83.3%。由此可见，菌株no2-6可以显著降低水体中的亚硝酸盐含量，高效去除水体中的亚硝酸盐，改善水质，但是处理能力受实施温度的影响，实施温度一般控制在15~30℃比较适宜。综上所述，本发明筛选得到的菌株no2-6可显著降低养殖污水、工业污水等污水中的亚硝酸盐含量，改善水质。需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。当前第1页12