一种预测肝细胞癌恶性风险以及预测预后的生物标志物的制作方法

1.本发明属于肝细胞癌临床诊断预后领域，具体而言，涉及一种基于tp53 rs28934571多态性的，能够预测初诊肝细胞癌临床t分期≥t2的风险，能够预测初诊肝细胞癌门静脉癌栓累及的风险，以及能够预测肝细胞癌患者的预后不良风险的生物标志物。


背景技术：

2.肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是全球第5大常见的恶性肿瘤，也是癌症死亡的第3大主要原因。肝细胞癌的致癌因素包括肥胖、饮酒、吸烟、乙肝和丙肝。目前肝细胞癌的治疗手段或策略包括外科手术切除、肝移植、射频消融、经动脉化疗栓塞术和全身化疗。近年来这些治疗手段或策略虽然得到了长足的发展和进步，然而hcc患者的5年生存率仍然处于较低水平，不足5％。在治疗前准确评估hcc的恶性程度有利于指导后续的治疗方案，对于提高患者的5年生存率，改善患者的预后而言意义重大。
3.单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)指在基因组水平上由可遗传的单个核苷酸变异所促成的dna序列多态性。snp可以表现为单个碱基的转换(c
←→
t；g
←→
a)或颠换(c
←→
a；g
←→
t；c
←→
g；a
←→
t)，也可以表现为单个碱基的插入或缺失。目前，已有大量研究表明一些snp和癌症的发生发展相关，属于致病snp。例如，sirt1rs3758391t》c和rs369274325g》a能够增加伊朗人群的膀胱癌发病风险。因此，研究与hcc发生发展相关的基因的多态性，对于准确评估hcc的恶性程度以及精准预测hcc患者的预后而言具有指导意义。
4.tp53是近年来癌症发生发展相关研究的热点之一，位于人类染色体17p13.1。编码tp53的dna序列包含了11个外显子和10个内含子。先行研究已经表明，野生型tp53发挥抑癌作用，抑制癌症的发生发展；然而发生snp的tp53则可能促进癌症的发生发展。例如在乳腺癌中，tp53 rs1625895g》a可能使患者的早期死亡风险增加3倍；tp53 72arg》pro则可能参与了卵巢癌的发生发展。然而关于tp53基因多态性在hcc中如何影响其恶性程度的研究尚不充分。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一种基于tp53 rs28934571多态性预测初诊hcc临床t分期≥t2的风险的生物标志物。本发明的第二目的在于提供一种基于tp53 rs28934571多态性预测初诊hcc门静脉癌栓累及的风险的生物标志物。本发明的第三目的在于提供一种基于tp53rs28934571多态性预测hcc患者预后不良风险的生物标志物。
6.为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案如下所述：
7.步骤1：收集hcc患者的肝细胞癌组织样本和临床信息数据(包括性别、临床t分期、原发灶数目、门静脉癌栓累及状态、血清afp表达水平、总生存时间、总生存状态)。
8.步骤2：利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术检测hcc患者肝细胞癌组织样本的tp53 rs28934571基因型(包括cc、ca、aa)。
9.步骤3：分析hcc患者tp53基因型和患者临床信息(包括性别、临床t分期、原发灶数目、门静脉癌栓累及状态、血清afp表达水平、总生存时间、总生存状态)之间的相关关系。
10.进一步地，步骤2中所述的tp53基因型为tp53 rs28934571cc基因型、ca基因型和aa基因型。
11.进一步地，步骤2中所述的tp53 rs28934571cc基因型、ca基因型、aa基因型以预测初诊hcc临床t分期≥t2的风险、门静脉癌栓累及的风险为目的，以及以预测hcc患者预后不良风险为目的时，无论以任何检测手段明确上述基因型的，均应视为在本发明的保护范围内。
12.进一步地，步骤2中所述的tp53 rs28934571cc基因型、ca基因型和aa基因型在其他数据库中的名称即便与本发明所使用名称不同，应视作指示相同的生物标志物；并且以预测初诊hcc临床t分期≥t2的风险、门静脉癌栓累及的风险为目的，以及以预测hcc患者预后不良风险为目的时，亦应视为在本发明的保护范围内。
13.两者择一地，当tp53 rs28934571基因型为cc时，指示初诊hcc临床t分期≥t2的风险相对较低；当tp53 rs28934571基因型为ca或aa时，指示初诊hcc临床t分期≥t2的风险相对较高。
14.两者择一地，当tp53 rs28934571基因型为cc时，指示初诊hcc的门静脉癌栓累及风险相对较低，当tp53 rs28934571基因型为ca或aa时，指示初诊hcc的门静脉癌栓累及风险相对较高。
15.两者择一地，当tp53 rs28934571基因型为cc时，指示hcc患者的预后不良风险相对较低；当tp53 rs28934571基因型为ca或aa时，指示hcc患者的预后不良风险相对较高。
16.与现有技术相比，本发明实现的积极有益作用为：
17.(1)在目前常见、常用的影像学手段评估初诊hcc临床分期的系统(例如美国癌症协会肝癌分期系统、肝癌米兰分期系统、巴塞罗那肝癌分期系统、香港中文大学肝癌预后指数和日本综合肝癌分期)下，本发明本着精准医学理念，开发了基于tp53 rs28934571基因型预测初诊hcc临床t分期≥t2的风险以及门静脉癌栓累及的风险的生物标志物。以往的hcc临床分期或恶性程度评价系统多从原发灶大小、淋巴结累及、远端转移三个方面进行评估，然而由于hcc的异质性，仅靠上述三个方面已经无法满足对hcc的恶性程度以及病程发展进行全面准确评价的要求。本发明则在一定程度上弥补了上述局限性。(2)基于本发明，可以做到对hcc患者的预后不良风险的精准预测，在治疗初期甚至治疗前即可预测hcc患者的预后不良风险，做到早预测，早指导，早治疗，以此改善hcc患者的预后。(3)本发明所使用的hcc组织标本在常规微创hcc活检中即可取得，操作方便，易于推广。
附图说明
18.图1为tp53 rs28934571不同基因型的hcc患者的生存分析图。
19.图2为基于初诊hcc患者的临床样本分析得到的tp53 rs28934571不同基因型的生存分析图。
具体实施方式
20.以下结合说明书附图和具体实施例，对本发明作更详细准确地阐述和解释。以下
所述实施例仅作为解释本发明使用，不限制本发明的范围。以下所述的实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为常规途径或商业途径获得。
21.1.材料与方法
22.1.1生信分析
23.利用tcga数据库(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)下载tcga-lihc snp基因型数据和对应样本的临床病理信息。利用“survival”包分析tp53rs28934571cc基因型患者和ca+aa基因型患者之间的生存差异。
24.1.2收集初诊hcc患者的临床样本
25.收集我中心初诊hcc患者256例，包括临床病理信息和hcc组织样本。入选依据为：临床表现：ct、mri等影像学检查诊断为hcc；肝脏细胞学检查及肿瘤标本病理诊断符合hcc的患者；均未接受过任何治疗的hcc患者。通过电话询问或查阅住院病例等方式收集临床资料，随访时间为5年。患者的临床信息如表1所示。
26.表1患者的临床信息
27.1.3 dna提取与基因型鉴别
28.采用标准酚/氯仿法从hcc组织中提取基因组dna。所有dna样本均在-80℃中进行保存。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(pcr-rflp)检测基因型。使用限制性核酸内切酶对扩增产物进行剪切。剪切后的dna片段被加入含溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶中进行电泳。
29.1.4统计学分析
30.采用spss 26.0软件进行统计学分析。计数资料采用卡方检验或fisher精确检验
比较两组间的统计学差异。使用kaplan meier法对tp53 rs28934571cc基因型组和ca+aa基因型组进行生存分析，组间的统计学差异使用log-rank法计算。使用二元logistic回归分析比较tp53rs28934571cc基因型组和ca+aa基因型组与原发灶临床t分期、门静脉癌栓累及、原发灶数量、血清afp表达水平之间的相关关系。p《0.05表示组间差异具有统计学意义。
31.实施例1：生物信息学分析tp53 rs28934571不同基因型对hcc患者生存的影响
32.结合hcc样本的临床病理信息，使用r包“survival”对hcc样本进行生存分析，结果显示不同基因型的hcc患者之间的生存差异具有统计学意义(图1)。
33.实施例2：tp53 rs28934571基因型和原发灶临床t分期之间的相关关系
34.将我中心收集到的256例初诊hcc患者按照原发灶临床t分期进行分组：t2-t4组(154例)，t1组(102)例。使用二元logistic回归分析探究tp53 rs28934571基因型和原发灶临床t分期之间的相关关系(表2)，结果显示相较于cc基因型，aa基因型患者的hcc恶性程度(表现为更高的临床t分期)风险是cc基因型的5.135倍(95％置信区间：2.311-11.410)；以aa基因型、ca基因型患者为一个整体来看，其hcc恶性程度风险是cc基因型的2.297倍(95％置信区间：1.354-3.896)。
35.表2 tp53 rs28934571基因型和原发灶临床t分期之间的相关关系
36.实施例3：tp53 rs28934571基因型和门静脉癌栓累及风险之间的相关关系
37.将我中心收集到的256例初诊hcc患者按照门静脉癌栓累及与否进行分组：累及组(89例)，未累及组(167例)。使用二元logistic回归分析探究tp53 rs28934571基因型和门静脉癌栓累及风险之间的相关关系(表3)，结果显示相较于cc基因型，ca基因型患者的门静脉癌栓累及风险是cc基因型的2.478倍(95％置信区间：1.343-4.571)；aa基因型患者的门静脉癌栓累及风险是cc基因型的2.508(95％置信区间：1.250-5.034)；以aa基因型、ca基因型患者为一个整体来看，其门静脉癌栓累及风险是cc基因型的2.489倍(95％置信区间：1.428-4.340)。
38.表3 tp53 rs28934571基因型和门静脉癌栓累及风险之间的相关关系
39.实施例4：tp53 rs28934571基因型和hcc患者预后不良之间的相关关系
40.截至5年随访，共计对238例hcc患者进行了完整的随访，18例hcc患者失访，随访率为7.0％。238例hcc患者中，96例患者在随访阶段死亡(发生终点事件)。使用kaplan meier法对tp53 rs28934571不同基因型的hcc患者进行生存分析(图2)，结果显示，相较于cc基因型，ca、aa基因型的hcc患者有着更差的生存率，指示着更高的预后不良风险。
41.除非另作具体说明，否则在上述实施例中所阐述的数值并不限制本发明的范围。在上述实施例中，除非另作具体说明，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而非以限制本发明为目的。因此，示例性实施例以外的其他实例，可以具有不同的值。
42.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围之中。