茶树CsCIPK20基因在提高植物抗寒性中的应用

茶树cscipk20基因在提高植物抗寒性中的应用
技术领域
1.本发明属于生物基因工程和植物遗传育种技术领域，具体涉及茶树cscipk20基因在提高植物抗寒性中的应用。


背景技术：

2.低温是一个严重的环境逆境，是植物生长发育的重要环境限制因子，温度胁迫已经严重威胁到经济作物的产量和品质。茶树是重要的以叶用为主的经济作物，其起源于热带或亚热带地区，对低温较为敏感。茶树的耐低温能力与茶叶产量、品质和生产经济效益息息相关，尤其是在春季临开采期间，若出现寒潮天气，刚萌出的茶树新梢受冻，直接导致巨大的经济损失。因此，研究茶树如何应答、适应和抵抗低温环境，选育并获得耐低温品种，对保障茶产业发展具有重要意义。
3.钙离子作为第二信使，在植物中参与许多生物学过程。植物对低温信号的初始反应可能是细胞膜上的钙离子通道，当受到低温刺激后，植物细胞内的钙离子浓度在短时间内迅速增加，从而激发下游耐寒防御反应。cipk（calcineurin b
‑
like interacting kinase）蛋白激酶是植物特有的一类蛋白激酶，其通过结合钙离子信号受体蛋白cbl（calcineurin b
‑
like）来传递钙离子信号。已有研究表明，本发明涉及的cscipk20的表达受低温胁迫显著诱导，但其在低温胁迫下的具体功能仍未知。
4.利用转基因技术可以将内源或外源的抗逆基因导入需要改良的植物中，并使后代表现出稳定遗传的抗逆能力。目前，茶树转基因体系尚不成熟，而拟南芥是植物生物学研究领域的模式植物，通过农杆菌介导的转基因技术可以在拟南芥中过表达候选基因，从而研究候选基因的生物学功能。通过转基因技术使cscipk20基因在拟南芥中过量表达，获得的转cscipk20基因植株的抗冻性显著增加。同时，通过反义寡核苷酸诱导沉默技术，降低cscipk20基因在茶树叶片中的表达，cscipk20基因沉默的茶树叶片的抗冻性显著降低。所以，茶树cscipk20基因的克隆和功能验证可以为茶树抗寒育种提供基因资源。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供茶树cscipk20基因在提高植物抗寒性中的应用的技术方案。
6.本发明的构思如下：本技术通过对编码茶树钙调磷酸酶b蛋白互作蛋白激酶编码的基因cscipk20的研究，发现过表达该基因的转基因植株在低温胁迫下较野生型植株具有明显的抗冻表型，且电导率值下降。
7.本发明具体通过以下技术方案实现：本发明一方面提供了茶树钙调磷酸酶b蛋白互作蛋白激酶基因cscipk20在提高植物抗寒性中的应用，该基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.进一步，所述植物包括木本植物和草本植物。
9.本发明另一方面提供了含有茶树钙调磷酸酶b蛋白互作蛋白激酶基因cscipk20的
生物材料在提高植物抗寒性中的应用，该基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
10.进一步，该生物材料为重组dna、表达盒、质粒载体、病毒载体或工程菌。
11.进一步，所述植物包括木本植物和草本植物。
12.本发明另一方面提供了获得具有抗寒性植物的方法，包括以下方式：1）使植物包含茶树抗寒基因cscipk20；或2）使植物过表达茶树抗寒基因cscipk20。
13.进一步，所述方式2）中将基因cscipk20导入植物中，获得cscipk20基因过表达的转基因植物。
14.进一步，具体包括以下步骤：1）提取茶树叶片总rna，反转录获得cdna，设计引物f和r，以茶树cdna为模板进行pcr扩增，得到扩增产物cscipk20基因，将扩增产物构建到具有super promoter启动子的pcambia 1300植物表达载体上，得到重组表达载体；2）用上述重组表达载体转化农杆菌，利用转化的农杆菌侵染拟南芥花序，获得转基因拟南芥株系。
15.进一步，所述引物f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述引物r的核苷酸序列如seq id no.4所示。
16.本技术具有以下有益效果：本发明通过过表达实验首次验证了cscipk20的生物学功能，首次揭示了cscipk20正调控植物的抗寒性。在拟南芥中过表达cscipk20基因，可增强拟南芥植株的耐低温能力。因此，本发明提供了一个重要的可用于培育耐低温植物的基因资源，具有潜在的应用价值。
附图说明
17.图1为本发明实施例2中过表达株系oe
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1，oe
‑
2，oe
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3和oe
‑
4的cscipk20基因表达检测图；图2为本发明实施例3中过表达株系oe
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1，oe
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2，oe
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3和oe
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4在低温胁迫下的表型；图3为本发明实施例3中过表达株系oe
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1，oe
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2，oe
‑
3和oe
‑
4在正常培养和低温胁迫下的电导率；图4为本发明实施例4中反义寡核苷酸注射后茶树中cscipk20的沉默效果；图5为本发明实施例4中cscipk20沉默的茶树植株在低温胁迫下的表型；图6为本发明实施例4中cscipk20沉默的茶树植株在低温胁迫下的电导率。
具体实施方式
18.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件（可参考sambrook j. & russell d. w., molecular cloning: a laboratory manual, 2001）或按照制造厂商说明书建议条件。
19.以下实施例中peasybluntzero载体为常用的克隆载体，可市购；super promoter
‑
pcambia1300载体为本课题组保存的载体；拟南芥品种为哥伦比亚生态型；农杆菌gv3101菌株是常用菌株，多数分子生物学实验室均有保存。
20.以下实施例中的主要试剂为：peasybluntzero克隆载体试剂盒购自于北京全式金
生物技术有限公司；限制性内切酶，taq酶，dntp，反转录试剂盒等购自于takara公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自于axygen公司；植物rna提取试剂盒购自于天根公司；潮霉素，sybr green等购自于roche公司；琼脂糖，卡那霉素，利福平等购自sigma；实施例中使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。
21.实施例中所使用的引物由上海华津生物科技有限公司合成，并进行相关测序。
22.实施例1：茶树cscipk20基因的过表达载体构建根据课题组转录组数据库序列，茶树cscipk20基因的核苷酸序列如seq id no: 1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如seq id no:2所示，设计引物f和r，以茶树叶片cdna为模板，pcr扩增得到基因cscipk20。将扩增出的序列连接到peasybluntzero载体上，通过双酶切连接反应最终连接到super promoter
‑
pcambia1300植物表达载体上。
23.所用引物为 f：5
’‑
cggggcccatgggctatgaaaaattatc
‑3’
（ 如seq id no:3所示）；r：5
’‑
gcgtcgacctagaaatgttgttcatcatcat
‑3’
（ 如seq id no:4所示）。
24.实施例2 ：cscipk20基因过表达植株的构建与筛选将实施例1中构建的测序正确的载体转化到农杆菌gv3101菌株中，再转入拟南芥野生型植株中，得到拟南芥转基因当代苗的种子。super promoter
‑
pcambia1300载体所带筛选抗性基因为潮霉素，用潮霉素对拟南芥转基因幼苗进行筛选，获得的t1代具有潮霉素抗性的阳性苗进行单株收种，再对t2代种子进行潮霉素抗性筛选，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3:1的株系，说明在该株系中，连有目的基因的载体序列是以单拷贝形式插入。将这些株系中具有潮霉素抗性的植株移出，再进行单株收种，再进行潮霉素抗性筛选，如果没有分离，说明该转基因株系为纯合体，该纯合体可以用于繁种和生理实验。
25.筛选获得过表达株系oe
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1，oe
‑
2，oe
‑
3和oe
‑
4。提取野生型，oe
‑
1，oe
‑
2，oe
‑
3和oe
‑
4的总rna，逆转录合成cdna，通过qrt
‑
pcr方法检测所得过表达株系oe
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1，oe
‑
2，oe
‑
3和oe
‑
4中cscipk20的表达量，检测结果见图1，可以看出oe
‑
1，oe
‑
2，oe
‑
3和oe
‑
4中均能检测出cscipk20基因的超表达。
26.实施例3：过表达cscipk20植物的耐低温能力将拟南芥种子灭菌后，播种在二分之一ms+1.5%蔗糖培养基上，正常培养（22 ℃白天/ 20 ℃夜晚，光照10 h/ 黑暗14 h，光强10000 lux）8天后移入到育苗块中生长，培养至苗龄为23天时，进行4℃低温处理7天，再进行
‑
10℃处理7.5h，低温处理结束后，恢复正常培养6天。拍照记录，见图2，野生型（wt）叶片卷曲萎蔫，而cscipk20
‑
oe株系叶片依然伸展挺直，可见过表达茶树cscipk20可提高植株的低温抗性。低温处理结束后，取整个地上部分进行相对电导率测定。测定结果分别见图3，结果表明，与野生型相比，低温胁迫下，oe
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1，oe
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2，oe
‑
3和oe
‑
4过表达植株的相对电导率含量显著降低，耐低温能力增加。
27.实施例4： cscipk20基因沉默的茶树的耐低温能力为了进一步验证cscipk20基因在植物耐冷过程中的作用，采用反义寡核苷酸注射茶树叶片的方法来瞬时沉默茶树的cscipk20基因。将5条正义寡核苷酸（sodn）和5条反义寡核苷酸（asodn）分别混合，注射的寡核苷酸浓度为30 μm，注射时间15 h后，检测cscipk20的基因表达来确定沉默效果，实验结果如图4所示，以正义链注射的植株为对照，反义链注射的茶树叶片的cscipk20的表达显著下调，下调至对照的36%。注射15h后，再进行
‑
5 ℃低温处理2 h，处理结束后，如图5所示，反义链注射的茶树叶片卷曲。取叶片进行相对电导率测
定，见图6，cscipk20沉默植株的相对电导率显著高于对照，表明沉默了cscipk20会降低植株的耐低温能力。可见，cscipk20正调控茶树低温响应，与利用cscipk20
‑
oe拟南芥材料进行功能鉴定的结果一致。
28.反义寡核苷酸（asodn）序列：5
’‑
ccttctctttgttgatgactttgac
‑3’
（如seq id no:5所示），5
’‑
caaatatctgccttctctccgtcgt
‑3’
（如seq id no:6所示），5
’‑
gggctttatggtggtgaaccgggct
‑3’
（如seq id no:7所示），5
’‑
agcgggctttatggtggtgaaccgg
‑3’
（如seq id no:8所示），5
’‑
cttctttgctcccttgcatgttcaa
‑3’
（如seq id no:9所示）；正义寡核苷酸（sodn）序列：5
’‑
ggaagagaaacaactactgaaactg
‑3’
（如seq id no:10所示），5
’‑
gtttatagacggaagagaggcagca
‑3’
（如seq id no:11所示），5
’‑
cccgaaataccaccacttggcccga
‑3’
（如seq id no:12所示），5
’‑
tcgcccgaaataccaccacttggcc
‑3’
（如seq id no:13所示），5
’‑
gaagaaacgagggaacgtacaagtt
‑3’
（如seq id no:14所示）。
29.上述结果证明了cscipk20基因正调控植物的抗寒性。
30.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。