一种烟草青枯病的SNP分子标记、其获得方法及其应用

本发明涉及一种烟草青枯病的snp分子标记、其获得方法及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

青枯病是一种由青枯菌引起的细菌性病害，是典型的维管束病害，一旦发病会导致作物全株枯萎死亡，给农业生产造成毁灭性打击。烟草青枯病在我国南方各大烟区广泛影响烟草生长，严重导致烟叶产量和品质下降，是目前烟草种植最重要的病害之一。但迄今仍未找到有效的防治方法。

烟草青枯病抗性属于数量性状遗传，受多基因共同控制，且易受到环境影响，所以传统地常规育种效率低下。烟草工业生产过程中，涉及的配方及工艺流程，一般不会轻易发生改变。因此，在不改变主栽品种基本农艺性状的前提下，需要对主栽品种的抗青枯病性状进行定向改良，避免后期影响工业生产流程，提升效益。选育青枯病品种，首先要有良好的抗源，目前青枯病抗源来源十分狭窄，现今国内烟草青枯病的抗源主要是从普通烟草品种ti448（美国发现抗源品种）选育而来，但其抗性仍不稳定，需要进一步的研究。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种烟草青枯病的snp分子标记，可在植株营养生长早期鉴别其抗性，因而可直接用于烟草抗青枯病辅助育种工作。

本发明的第二个目的在于提供上述烟草青枯病的snp分子标记的获得方法，采用新的品种作为抗源，丰富青枯病的抗性遗传基础，加快抗青枯病新基因在抗病育种中的转移和利用。

本发明的第三个目的在于提供一种引物。

本发明的第四个目的在于提供上述烟草青枯病的snp分子标记的应用，该标记完全基于与青枯病性状共分离，用其检测不存在假阳性的问题。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种烟草青枯病的snp分子标记，snp分子标记的序列为seqidno.1，snp分子标记的序列自5’端起第234位碱基为snp位点n；n为a或g。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种烟草青枯病的snp分子标记的获得方法，包括：

材料选择步骤：烟草品种gdsy为抗源，以烤烟品种k326或云烟87为受体，得到f1后，通过连续回交与表型选择相结合的方法构建抗病近等基因系群体；

酶切位点识别步骤：采用bsa分析法进行青枯病抗性基因的定位工作，将候选基因定位在14.6mb区间内，筛选均匀分布的150个snp位点，位点间平均距离100kb，设计引物并采用多重pcr进行扩增与测序验证，根据基因型结果和表型进行关联分析，区间里含有唯一候选snp位点落入生长素转运蛋白基因的外显子区域，造成氨基酸的非同义突变，得到snp分子标记，序列为seqidno.1；snp分子标记自5’端起第234位碱基为snp位点n，为xhoι酶切位点，n为a或g。

进一步地，抗病近等基因系群体中选用烟草的幼嫩叶片进行dna提取，然后进行bsa分析法。

实现本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种引物，引物用于烟草青枯病抗性的检测；

正向引物seqidno.2：5’-tctacctcccagacttcact-3’；反向引物seqidno.3：5’-ccacttgtagaactggctat-3’。

实现本发明的第四个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种烟草青枯病的snp分子标记的应用，用于烟草青枯病抗性的检测。

进一步地，对待检烟草样本dna进行pcr扩增；扩增产物经xhoι酶切后进行电泳，产生362bp和231bp两条带为抗病纯合植株，产生593bp、362bp和231bp三条带为抗病杂合植株，产生593bp一条带为感病纯合植株；

pcr扩增的引物为正向引物seqidno.2：5’-tctacctcccagacttcact-3’；反向引物seqidno.3：5’-ccacttgtagaactggctat-3’。

进一步地，pcr扩增前，对待检烟草样本dna加入ddh2o后，进行95℃预变性10min，立即插入冰上淬火3min，再进行pcr扩增。

进一步地，pcr反应体系包括dna模板、2×estaqmastermix、正向引物、反向引物、ddh2o和dmso。

进一步地，pcr反应体系为20µl：包括1.5µldna模板，10µl2×estaqmastermix，正向反向引物各1µl，ddh2o4.5µl，2µldmso。

进一步地，dmso的浓度为10v/v%。

进一步地，pcr扩增的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸5min。

本发明在基于前期大规模作物种质资源青枯病抗性评价过程中，发现烟草（nicotianatabacuml.）种质gdsy对青枯病具有显著高水平优良抗性，经遗传研究发现其抗性为显性遗传。进一步经过多年的接菌实验及其田间鉴定，再次验证gdsy种质对青枯菌有优异的抗病性，具有较高的遗传利用价值。抗病遗传与美国抗青枯病品种（ti448a为抗源）不同，为新型抗源且抗性优于美国抗源。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明烟草青枯病的snp分子标记其获得方式和应用操作简单可靠，经济高效，可在植株营养生长早期鉴别其抗性，因而可直接用于烟草抗青枯病辅助育种工作，对于烟草青枯病抗性育种具有重要应用价值；

2、本发明烟草青枯病的snp分子标记是一个基于pcr技术与酶切的共显性标记，跟rflp、aflp等标记相比，可显著降低成本，节省劳力；另外，该标记完全基于与青枯病性状共分离，用其检测不存在假阳性的问题；将该标记完全应用于苗期选择，不仅可以减少工作量，而且能够避免因接种不充分，或者田间生长不确定性，难以准确筛选出具有抗病基因的个体植株，从而加速育种进程；

3、本发明烟草青枯病的snp分子标记的获得采用新的品种作为抗源，丰富青枯病的抗性遗传基础，加快抗青枯病新基因在抗病育种中的转移和利用；

4、本发明烟草青枯病的snp分子标记的作用机制有别于常规的抗病生物学机制，常规的抗病学的解释为茉莉酸ja和水杨酸sa两种激素途径参与调控植物抗病性，而本发明基于品种gdsy携带的新基因，参与生长素途径而响应青枯病菌，作用机理有进一步的研究。

附图说明

图1为实施例2pcr扩增条带；

图2为实施例2酶切条带；

图3为实施例3抗病纯合产物扩增条带；

图4为实施例3感病纯合产物扩增条带；

图5为实施例3抗病杂合产物扩增条带。

图6为对比例的扩增条带。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种烟草青枯病的snp分子标记的获得方法，包括：

材料选择步骤：烟草品种gdsy为抗源，以烤烟品种k326或云烟87为受体，得到f1后，通过连续回交与表型选择相结合的方法构建抗病近等基因系群体；

酶切位点识别步骤：选用烟草的幼嫩叶片进行dna提取，烟草叶片不同于其它作物，成熟叶片含有大量油分，烟碱以及其他化合物成分，所以，在采集烟叶提取dna样品过程中，必需采集适量幼嫩组织部位，有益于后续提取高质量dna，否则造成dna质量差，而导致pcr扩增失败；

采用bsa分析法进行青枯病抗性基因的定位工作，将候选基因定位在14.6mb区间内，筛选均匀分布的150个snp位点，位点间平均距离100kb，设计引物并采用多重pcr进行扩增与测序验证，根据基因型结果和表型进行关联分析，区间里含有唯一候选snp位点落入生长素转运蛋白基因的外显子区域，造成氨基酸的非同义突变，得到snp分子标记，序列如下：tctacctcccagacttcactagtgggactctactgagtttttgtttgacttgaagtgctattaactgggttctaaatttaatatttatgcatatttaatgaacattttaatacaagtacactgtttgagcaaaagctacttggtttggcctaactcgcattcgccttctagctccaccgctggttcacttcttaatttgttgcctttttttccttttttttttcaggtagctcnagtgctattgacgctgccatactcatgcgcggcccccagcgcctcttgggtggccgcccggagcagacccccgcgggccagcgccgcgcgcctgatccgaggagaccccgcgccccgcagccgtgggcaccgggggccggcggggagcggcggccgcgccgctgctggtggcggtggccgcgcgctactgggcgccgcgggctttctcaactaggaatgctttctgggatttcatttcagctattttacggtttaatgggtagttggacagcttatcttattagtatcctctatattgagtacagaaccagaaaagaaagaaaagggagaaatttaaaaatagccagttctacaagtgg；

snp分子标记自5’端起第234位碱基为snp位点n，为xhoι酶切位点，n为a或g；n为a，snp分子标记为与感病品种位点检测相关的标记；n为g，snp分子标记为与抗病品种位点检测相关的标记。

一种烟草青枯病的snp分子标记的应用，用于烟草青枯病抗性的检测，具体步骤：

对待检烟草样本dna加入ddh2o后，进行95℃预变性10min，立即插入冰上淬火3min，然后进行pcr扩增。该步骤在pcr前进行了预处理，原因是含176bp序列gc含量高达85.23%（seqidno.1的序列所示）导致普通pcr扩增困难，模板的高gc含量区域在变性后的复性过程中容易形成二级结构，因此，普通pcr扩增流程会导致实验失败。根据热启动pcr原理结合淬火操作步骤，破坏序列中的二级结构，与常规操作不同，应首先加入模板基因组dna和ddh2o后，进行95℃预变性10min，立即插入冰上淬火3min，置于冰上操作，完成剩余反应体系其他试剂加样，轻轻混匀。

pcr反应体系20µl：包括1.5µldna模板，10µl2×estaqmastermix，正向反向引物各1µl，ddh2o4.5µl，2µl10v/v%dmso；由于扩增序列中含有复杂结构，dmso能破坏模板的二级结构，pcr反应体系中添加10v/v%dmso，能够提高扩增的成功率；pcr程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸5min；

扩增产物经xhoι酶切1h后进行电泳，产生362bp和231bp两条带为抗病纯合植株，产生593bp、362bp和231bp三条带为抗病杂合植株，产生593bp一条带为感病纯合植株（无xhoι酶切位点）；酶切1h是最佳的酶切时间，切的时间过长，杂合型的就不是三条带的带型，杂乱而无法区分；

pcr扩增的引物为正向引物seqidno.2：5’-tctacctcccagacttcact-3’；反向引物seqidno.3：5’-ccacttgtagaactggctat-3’。

实施例1：

烟草青枯病的snp分子标记的获得和验证

材料选择步骤：烟草品种gdsy为抗源，以烤烟品种k326为受体，得到f1后，通过连续回交与表型选择相结合的方法，将gdsy的抗青枯病基因转移至k326，构建抗病近等基因系群体；

将供试材料种植于稳定的青枯菌病圃，占地面积8亩，能实现供试材料的青枯病抗性情况调查，并取其叶片储存于-20℃冰箱备用；

酶切位点识别步骤：选用烟草的幼嫩叶片进行dna提取，采用bsa分析法进行青枯病抗性基因的定位工作，将候选基因定位在14.6mb区间内，筛选均匀分布的150个snp位点，位点间平均距离100kb，设计引物并采用多重pcr进行扩增与测序验证，根据基因型结果和表型进行关联分析，区间里含有唯一候选snp位点落入生长素转运蛋白基因的外显子区域，造成氨基酸的非同义突变，得到snp分子标记，序列为seqidno.1；snp分子标记自5’端起第234位碱基为snp位点n，为xhoι酶切位点，n为a或g；n为a，snp分子标记为与感病品种位点检测相关的标记；n为g，snp分子标记为与抗病品种位点检测相关的标记。

引物设计步骤：

利用primerpremier5.0引物设计软件在位点的两端（上下游各500bp）设计一对引物：正向引物seqidno.2：5’-tctacctcccagacttcact-3’；反向引物seqidno.3：5’-ccacttgtagaactggctat-3’，使突变位点大致位于设计引物的pcr产物的中间位置。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

采用经典的ctab法提取烟草幼嫩叶片的dna，用分光光度计进行检测：

1）取约4cm×4cm的幼嫩叶片组织放入2ml圆底离心管（此处必需采用圆底离心管，不然操作过程中易破管，造成实验失败），并同时放入2粒钢珠，将离心管装入磨样机专用的样品架，放入液氮中预冷1min，固定于磨样机，并以25次/s的频率振荡30s，将样品磨成粉末；

2）加入0.5ml2×ctab缓冲液，混匀后65℃水浴30min，期间轻柔振荡2-3次；

3）水浴后，取出离心管并自然冷却至室温，加入0.5ml的氯仿，上下颠倒数次，充分混匀，运用离心机12000rpm，离心10min；

4）吸取上清至1.5ml离心管，加入等体积的氯仿，上下颠倒数次，充分混匀，运用离心机12000rpm，离心10min；

5）吸取上清至1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，混匀后置于-20℃沉淀1h；

6）运用离心机12000rpm，离心15min，可见明显白色沉淀于离心管底部；

7）弃上清，加入1ml75%的乙醇溶液漂洗沉淀，运用离心机12000rpm，离心5min；

8）重复两次步骤7；（与常规重复一次步骤7不同，为了提高dna质量，重复两次步骤7，有效提高dna质量，用于后续pcr扩增）；

9）弃上清，在通风橱里晾干沉淀。用100µlddh2o溶解沉淀，保存-20℃备用。

对样品dna进行pcr扩增：

对待检烟草样本dna加入ddh2o后，进行95℃预变性10min，立即插入冰上淬火3min，然后进行pcr扩增。

pcr反应体系20µl：包括1.5µldna模板，10µl2×estaqmastermix，正向反向引物各1µl，ddh2o4.5µl，2µl10v/v%dmso；pcr程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸5min。

pcr产物电泳：

10µlpcr产物，加入2µl6×loadingbuffer，混匀，取10µl样品在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳30min，置于凝胶成像系统中观察结果。

pcr产物测序与核酸序列分析：

将各材料扩增出来的pcr产物测序，并进行核酸序列分析，分析与验证snp位点。seqidno.1的序列所示，抗病材料gdsy与感病材料k326间，snp位点为g/a突变，与青枯病抗性性状连锁。

实施例2：

snp分子标记在f2群体中的验证：

图1所示，pcr扩增成功的产物为593bp的特异性条带，抗病纯合为图中r，感病纯合为图中s，抗病杂合为图中h。图2所示，经酶xhoi后，得到明显的多态性条带，可清晰地区分不同基因型单株。抗病纯合单株产生362bp和231bp两条带，感病纯合单株的扩增产物，无xhoι酶切位点，不能被切开，仍为593bp的单一带型。而抗病杂合单株产生593bp、362bp和231bp三条带。

实施例3：

snp分子标记在回交群体中的可靠性验证：

用开发出的snp分子标记，对分离群体中的随机选择出的40个单株（14份纯合抗病单株，11份感病纯合单株和15份抗病杂合单株）进行检测。如图3-5所示，抗病纯合为图中r，感病纯合为图中s，抗病杂合为图中h，三种基因型的材料，经pcr扩增与xhoι酶切后，得到多态性条带清晰明确，且与预计结果一致。证实了该标记稳定和重复性好，实现苗期判断青枯病抗性品种，快速筛选所需植株个体，可以用于分子辅助育种，加快烟草抗青枯病品种的选育过程。

对比例：

对比例与实施例1不同之处在于：

pcr反应体系20µl：包括1.5µldna模板，10µl2×estaqmastermix，正向反向引物各1µl，ddh2o6.5µl；pcr程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸5min。

其余步骤与实施例1相同。

如图6所示，样品pcr扩增后，无593bp的目的条带，仅形成弥散条带，并产生大量的引物二聚体，pcr扩增失败。无法继续进行后续实验。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110>广东省农业科学院作物研究所

<120>一种烟草青枯病的snp分子标记、其获得方法及其应用

<130>2021

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>593

<212>dna

<213>nicotianatabacuml.

<220>

<221>misc_feature

<222>(234)..(234)

<223>nisaorg

<400>1

tctacctcccagacttcactagtgggactctactgagtttttgtttgacttgaagtgcta60

ttaactgggttctaaatttaatatttatgcatatttaatgaacattttaatacaagtaca120

ctgtttgagcaaaagctacttggtttggcctaactcgcattcgccttctagctccaccgc180

tggttcacttcttaatttgttgcctttttttccttttttttttcaggtagctcnagtgct240

attgacgctgccatactcatgcgcggcccccagcgcctcttgggtggccgcccggagcag300

acccccgcgggccagcgccgcgcgcctgatccgaggagaccccgcgccccgcagccgtgg360

gcaccgggggccggcggggagcggcggccgcgccgctgctggtggcggtggccgcgcgct420

actgggcgccgcgggctttctcaactaggaatgctttctgggatttcatttcagctattt480

tacggtttaatgggtagttggacagcttatcttattagtatcctctatattgagtacaga540

accagaaaagaaagaaaagggagaaatttaaaaatagccagttctacaagtgg593

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工合成(artificialsequence)

<400>2

tctacctcccagacttcact20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工合成(artificialsequence)

<400>3

ccacttgtagaactggctat20