一株柠檬明串珠菌菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体是一株柠檬明串珠菌菌株及其应用。


背景技术：

2.levan是一类来源于植物或微生物的果糖大分子聚合物，其分子中通常含有大量β
‑
(2，6)果糖苷键组成的主链及少量含有大量β
‑
(2，1)果糖苷键组成的支链。研究表明，微生物来源的levan具有抗肿瘤、抗糖尿病、增强免疫、降血脂等功能，此外，levan还可用于纳米材料及药物载体的制备。为了提高产物levan的纯度，通常会将果聚糖蔗糖酶(levansucrase)从微生物中提取出来，再与底物反应来获得更高品质的levan。然而，目前已知的产果聚糖蔗糖酶的微生物较少，并且少数微生物还有致病性，此外，几乎所有的果聚糖蔗糖酶产生菌只能合成一种分子量大小的果聚糖蔗糖酶，因此，寻找一株来源安全、产物(果聚糖蔗糖酶)多样化的菌株来满足市场成为本领域急需解决的问题。


技术实现要素：

3.基于上述技术问题，本发明提供了一株柠檬明串珠菌(leuconostoc citreum)菌株及其应用。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.本发明提供了一株柠檬明串珠菌菌株，该菌株的分类命名为柠檬明串珠菌leuconostoc citreum，保藏编号为cgmcc no.6431。
6.进一步地，所述菌株的基因组上有两个连续排列且正常表达的果聚糖蔗糖酶编码基因。
7.进一步地，所述果聚糖蔗糖酶编码基因编码表达三个不同分子量的果聚糖蔗糖酶。
8.进一步地，所述果聚糖蔗糖酶的分子量分别为130kda、90kda和80kda。
9.本发明还提供了一种柠檬明串珠菌在果聚糖蔗糖酶制备方面的应用。
10.进一步地，该菌株单次发酵制备三种不同分子量的天然果聚糖蔗糖酶。
11.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
12.本发明首次公开了一株柠檬明串珠菌，该菌株的基因组上连续排列了两个可正常表达、与已知同类基因的低同源性的果聚糖蔗糖酶编码基因，本技术的果聚糖蔗糖酶编码基因与已知同类基因的同源性＜30％。更重要的是，这两个果聚糖蔗糖酶编码基因可编码表达三种不同分子量的天然的果聚糖蔗糖酶，使柠檬明串珠菌单次发酵即可获得三种不同分子量的天然的果聚糖蔗糖酶，大大提高了果聚糖蔗糖酶的制备效率，上述特点使本技术方案具有显著的技术优势，因而在果聚糖蔗糖酶制备领域具有良好的应用前景。
附图说明
13.图1为基因1291和1292在cgmcc no.6431基因组上的分布图；
14.图2为蛋白1291和1292的sds
‑
page胶图；
15.图3为基因1291和1292同源性比较图；
16.图4为发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性检测结果；
17.图5为多糖样品的核磁共振图谱。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.本技术提供了一株柠檬明串珠菌(leuconostoc citreum)菌株及其应用。
20.具体的，柠檬明串珠菌(leuconostoc citreum)的保藏号为cgmcc no.6431。该菌株的分类命名为柠檬明串珠菌leuconostoc citreum，该菌种于2012年8月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
21.进一步地，柠檬明串珠菌的基因组有两个连续排列且正常表达的果聚糖蔗糖酶编码基因。
22.进一步地，果聚糖蔗糖酶编码基因与已知同类基因的同源性＜30％。
23.进一步地，果聚糖蔗糖酶编码基因可编码表达三个不同分子量的果聚糖蔗糖酶。
24.进一步地，果聚糖蔗糖酶分子量分别为130kda、90kda和80kda。
25.在另一个具体的实施方式中，柠檬明串珠菌在果聚糖蔗糖酶制备方面的应用。
26.进一步地，柠檬明串珠菌单次发酵可制备三种不同分子量的天然果聚糖蔗糖酶。
27.与现有技术相比，上述技术方案首次披露了一株柠檬明串珠菌，该菌株的基因组上连续排列了两个可正常表达、与已知同类基因的低同源性的果聚糖蔗糖酶编码基因，更重要的是，这两个果聚糖蔗糖酶编码基因可编码表达三种不同分子量的天然的果聚糖蔗糖酶，使柠檬明串珠菌单次发酵即可获得三种不同分子量的天然的果聚糖蔗糖酶，大大提高了果聚糖蔗糖酶的制备效率，上述特点使本技术方案具有显著的技术优势，因而在果聚糖蔗糖酶制备领域具有良好的应用前景。
28.下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
29.下述实施例中，所有原料均为市售，并均符合相关的国家标准。
30.实施例1
31.一种确定果聚糖蔗糖酶编码基因的方法，具体包括如下：
32.对柠檬明串珠菌(leuconostoc citreum)cgmcc no.6431进行了全基因组测序，从全基因组序列中发现2个连续排列的果聚糖蔗糖酶编码基因，分别命名为1291和1292(见图1)，其具体序列如下。
33.1291基因序列：
34.mnmketttrkklyksgkvwvaaatafavmgvsavttsisadttasavtapttadkaapavtapttadka
apavtapttadkaapavtapttadkaapavtapttadkatpavaapttatsaqvteltknglqlvsdakidnfdvnklssrqinslnaaadkyyqnpnktpnsnavtyknfddlikqlqeqpkniaipqfnsqniknlpavttesaltgkiedldiwdswmvqdaqtqkvadvqghqvmfalagstkepadthiymlttpykattinswqmvgpvfgynavpwsqewsgsatvnkdgsiqlfytrvtwndtikqnmqrlstinivvrptnsnglaienvnndhiifdgdgkyyqnieqtvnsegdnftlrdphvievdgqrylsfetntgtnnpegyenvtdlsnyggslhynvtkllelvgndaafrtatlangalgllrltqeqnnptvtqiydplvtsnmvtdeieranivplngkyylftdtrleksslgsnwnkstasdiamlgyvsdtlfgdykplningvvlvanktsndrtatysyyavpvdgysdrllitsymsnrgmeagnglnattapsfiiqinadgttaveqtittqndwvdpynavdpsmygfpgqavnikmainssfrtdgvflnapyganvtnehglsitsehvgnttdyngmstqitrqyitsdnitwylaslnnrsvwidsrafttvpftprdmtsfvnfsgrkdgiftnapygmdnakyvgninnyqgqsfviggqyydrgitwnliqvngqsvwvdnrsfatnfthdtdkkvfvnttsnldglflnapyrqpgyklaglaknynnqtvtvsqqyfddqgtvwsqvvlggqtvwvdnhalaqmqvrdtnqqlyvnsngrndglflnapyrgqgsqligmtadyngqhvqvtkqgqdaygaqwrlitlnnqqvwvdsralsttimqamnddmyvnssqrtdglwlnapytmsgakwagdtrsangryvhiskaysnevgntyyltnlngqstwidkraftttfdqvvalnativarqrpdgmfktapygeagaqfvdyvtnysqqtvpvtkqhsdaqgnqwylatvngtqywidqrsfspvvtkvvdyqakivprttrdgvfsgapygevnaklvnmatayqnqvvhatgeytnasgitwsqfalsgqedklwidkralqa
35.1292基因序列：
36.mkqqesitrkklyrsgkswvaaatafavmgvsavttsisadttasavtapttadkaapavtapttadkaapavtapatadkaapavtapttadkaapavtapttadkaapavtapttadkaapavtaltapntarlvekdlpanneisglttfgnnlvcdaglaksdliknlskdqidainqaatkyyddpakkpfsnaitykdfdqlinqfnespkelsvpkfnkenikdmpslttkdaesnevsaldmwdtwsvqdaktktvanvngfqmmfglagaptlgdthmymlyakygathiedwkmagsvfgydavnsnqewsgsaalnddgsiqlfytrvkwnskleanyqelwtanidvsvipdneiqiksinndhslfagdgfyyeqldqirgtesqhgenfalrdpniietdsgryltfeagtgqyrpsgkqnitdlsiyggdlsynvkamlntvsnsdwkslagrsnaalgllklsgnqsdpdveklytpritsiltsdeieranivplngkyylfaaarfdrsflghspklqpgynvmmlgyvsdkidgdyrplngngtvlvsnidfndrtatyayypvavdgysdrllvtgymsnrgqktntgynattapsfiiqinadgttaveqtittqndwvdpynavdpsmygfpgqavnikmainssfrtdgvflnapyganvtnehglsitsehvgnttdyngmstqitrqyitsdnitwylaslnnrsvwidsrafttvpftprdmtsfvnfsgrkdgiftnapygmdnakyvgninnyqgqsfviggqyydrgitwnliqvngqsvwvdnrsfatnfthdtdkkvfvnttsnldglflnapyrqpgyklaglaknynnqtvtvsqqyfddqgtvwsqvvlggqtvwvdnhalaqmqvrdtnqqlyvnsngrndglflnapyrgqgsqligmtadyngqhvqvtkqgqdaygaqwrlitlnnqqvwvdsralsttimqamnddmyvnssqrtdglwlnapytmsgakwagdtrsangryvhiskaysnevgntyyltnlngqstwidkraftttfdqvvalnativarqrpdgmfktapygeagaqfvdyvtnysqqtvpvtkqhsdaqgnqwylatvngtqywidqrsfspvvtkvvdyqakivprttrdgvfsgapygevnaklvnmatayqnqvvhatgeytnasgitwsqfalsgqedklwidkralqa
37.为进一步证明上述1291和1292的果聚糖蔗糖酶编码基因是否可正常表达，设计了异源表达实验：
38.1)大肠杆菌的蛋白表达
39.鉴定正确的表达质粒转化感受态e.coli bl21(de3)或transrosetta，挑取3个单菌落分别接种于5ml lb培养基(含相应抗生素)，37℃培养过夜，取出。将过夜培养物分别接种于800ml lb培养基(含相应抗生素)，37℃培养5h(od600≈0.5)，转移至25℃降温0.5h，加入iptg至终浓度0.2mm，25℃表达16h。表达完成后取出菌液于冰中冷却，4℃，5000rpm离心
sanfranciscensis tmw 1.392.[j].applied microbiology and biotechnology,2005,66(6):655
‑
663.
[0064]
[4]sangmanee s,nakapong s,kuttiyawong k,et al.production and immobilization of levansucrase[j].chiang mai journal of science,2015,42(1):44
‑
51.
[0065]
通过比较后发现，本技术的果聚糖蔗糖酶编码基因与已知同类基因的同源性＜30％。而且，由柠檬明串珠菌发酵产生的果聚糖蔗糖酶不但种类多，其中130kda分子量的果聚糖蔗糖酶是目前已知最大的有天然活性的果聚糖蔗糖酶。
[0066]
效果实施例3果聚糖蔗糖酶的制备
[0067]
1、材料与方法
[0068]
(a)果聚糖蔗糖酶的分离：将粗酶提取物溶解于蒸馏水中上样于akta蛋白纯化系统(ge公司，美国)，填料：sephacryl s
‑
300high resolution，流速：1ml/min，柱体积：120ml，检测器：uv检测器，根据uv信号收集280nm信号较高的洗脱液，冻干。各样品取5mg加入含5％蔗糖、0.3
‰
nan3的naac溶液(20mm、ph5.5)中，30℃反应48h后，用葡萄糖检测试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，中国)测定是否有游离葡萄糖生成，若有则该样品为果聚糖蔗糖酶。
[0069]
2、果聚糖蔗糖酶的制备
[0070]
将实施例3制备获得的发酵液8000g离心10min取上清，冷冻干燥得粗酶提取物，对该提取物进行分离后即得三个果聚糖蔗糖酶样品。
[0071]
效果实施例3果聚糖蔗糖酶样品的活性验证
[0072]
将效果实施例2制备获得的三个果聚糖蔗糖酶样品20mg分别溶解于含5％蔗糖、0.3
‰
nan3的naac溶液(20mm、ph5.5)，30℃反应48h后，15，000g离心10min，取上清液，加入3倍体积于上清液体积的无水乙醇，静置过夜，15，000g离心10min，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥即得三个多糖样品。将三个多糖样品按10mg/ml的浓度分别完全溶解于重水中，并应用核磁共振波谱仪(avance iii 400mhz，bruker公司，德国)进行核磁共振(nmr)测定，结果发现，三个多糖样品的nmr图谱一致(如图5所示)，所有多糖样品的nmr
‑
1h谱和nmr
‑
13c谱的化学位移与果聚糖levan标准品吻合。
[0073]
结论：由柠檬明串珠菌(leuconostoc citreum)cgmcc no.6431发酵提取获得的三种不同分子量的果聚糖蔗糖酶均有活性，可用于合成果聚糖levan。
[0074]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0075]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。