一种糖蜜精制脱毒及发酵生产丙酮、丁醇的方法

1.本发明涉及丙酮、丁醇生产技术领域，特别是涉及一种糖蜜精制脱毒及发酵生产丙酮、丁醇的方法。


背景技术：

2.在当今社会石油资源日渐枯竭，清洁生物燃料日益发展的大背景下，丙酮丁醇发酵作为一种绿色环保的生物燃料制备方法，能够将生物质作为发酵底物直接生产液体燃料丁醇，因而获得世界范围的关注和研究。目前，传统的丁醇发酵底物来源主要为淀粉质原料，包括玉米、薯类以及谷物等农产品，但原料来源单一，发酵成本较高，同时玉米、薯类、谷物等农产品作为我国主要的人口及禽畜用粮，过多消耗则不符合国家粮食安全发展趋势。因此，亟需开展生物丁醇发酵中非粮食种类底物的研究工作，寻找来源广泛且价格低廉的发酵底物，同时克服发酵抑制物的影响，提高丁醇产量，降低生产成本。
3.甘蔗糖蜜是一种呈粘稠状的深红棕色可流动液体，是工业利用甘蔗制糖的一种副产物，产量大且产地集中，具有成分单一稳定、不需要分选处理和质量可控等优势，在化工、轻工、食品、医药和建材行业中有较高的利用价值。糖蜜的主要成分为蔗糖、葡萄糖和果糖，占总含量的45％以上，可作为微生物生长发育所需碳源。此外，糖蜜中还含有许多微生物发酵所需的氨基酸、维生素、矿物盐等营养元素，是良好的发酵底物。但同时，糖蜜原料中也含有色素、有机酸、糖胶质和灰分等物质，对微生物具有毒性，会影响微生物生长，抑制发酵产物的产生。因此，利用糖蜜作为发酵底物进行丙酮丁醇发酵前，需针对性地对糖蜜的发酵抑制物进行去除，即对糖蜜进行精制脱毒，提高发酵产物的品质和发酵的效率。
4.我国糖厂主要的白砂糖生产方法为亚硫酸法，其生产过程大量使用磷酸和硫磺，产生磷酸钙和亚硫酸钙来吸附蔗汁中的杂质，以实现蔗汁澄清。因此，糖蜜废液中往往存在大量的亚硫酸根离子和磷酸根离子。根据相关文献报道，so
32
‑
对于丙酮
‑
丁醇发酵具有强抑制作用。此外，糖蜜中含有的粗蛋白质，多属于非蛋白氮类，以氨氮为主，生物学价值较低。丁醇发酵过程中，过多的nh
4+
导致丙酮丁醇梭菌胞体内nadh(还原性辅酶ⅰ)的利用受到抑制，降低总溶剂产量，因此需要对糖蜜中原有的氨氮进行适当的去除。
5.糖蜜中的胶质、灰分等发酵抑制物，需通过澄清工艺进行处理。糖蜜中的色素是丙酮丁醇发酵过程中主要的生长抑制物，对梭菌生长具有明显细胞毒性。色素主要来源于酚类物质以及一些高分子聚合物，包括焦糖化反应中酚类物质分解后缩聚形成以及还原糖与氨基酸发生美拉德反应生成的高分子深色物质。目前常用的糖脱色方法主要有两种，第一种是通过在酸化水解后的糖蜜中加入比表面积很高的活性炭，通过物理吸附作用进行去除，但产生的活性炭废弃物较多，经济与环保性较差；第二种则是通过膜过滤的方法对色素进行分离提取，该方法成本较高且色素去除效率较低。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种糖蜜精制脱毒及发
酵生产丙酮、丁醇的方法，本发明的方法经济环保，能够有效地对糖蜜进行精制脱毒，降低糖蜜中色素、有机酸、糖胶质和灰分等物质对发酵反应的抑制作用，提高发酵液的品质和发酵的效率，从而提高丙酮、丁醇等产物的产量。
7.为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
8.一种糖蜜精制脱毒的方法，包括如下步骤：
9.(1)脱灰分、胶质：将糖蜜稀释，稀释后加入酸液调节ph至溶液呈酸性，水浴加热溶液使糖蜜中的非还原糖水解转化为还原糖，之后加入絮凝剂，搅拌后静置，使胶质絮凝沉降，冷却后取上层澄清液，加入钙盐调节ph至中性，离心过滤硫酸钙沉淀，得到清液；
10.(2)脱磷除氮：向清液中加入含镁无机化合物和含磷无机化合物并搅拌，同时用碱液调节ph至碱性，生成鸟粪石沉淀，过滤沉淀后得到澄清液；
11.(3)脱色：向澄清液中加入大孔吸附树脂震荡脱色，之后过滤，所得滤液即为精制脱毒后的糖蜜溶液。
12.作为上述方案的进一步改进，所述步骤(1)中，糖蜜稀释至波美度为15～30
°
b
é
；所述酸液包括硫酸或磷酸，酸液调节溶液的ph至1.5～3.5；所述水浴加热的温度为60～95℃，加热时间为0.5～3h。
13.作为上述方案的进一步改进，所述步骤(1)中，絮凝剂为无机絮凝剂、有机絮凝剂或无机絮凝剂与有机絮凝剂的混合物，所述无机絮凝剂包括聚合氯化铝、聚合硫酸铁或聚合氯化铝铁，所述有机絮凝剂包括聚丙烯酰胺；无机絮凝剂的加入量为50～300ppm，有机絮凝剂的加入量为5～20ppm。
14.作为上述方案的进一步改进，所述步骤(2)中，含镁无机化合物包括氧化镁、氢氧化镁、氯化镁、硫酸镁、碳酸镁中的一种或多种的组合物，含磷无机化合物包括磷酸、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠中的一种或多种的组合物；所述含镁无机化合物的加入量满足n(nh
4+
):n(mg
2+
)＝1:1～1.4，所述含磷无机化合物的加入量满足n(nh
4+
):n(po
43
‑
)＝1:0.6～1，其中n(nh
4+
)代表溶液中总的nh
4+
的物质的量。
15.在进行鸟粪石法去除氨氮过程中，根据反应机理，碱性条件下，n(nh
4+
):n(mg
2+
):n(po
43
‑
)为1:1:1进行反应生成鸟粪石沉淀。经过多次实验验证，得出n(nh
4+
):n(mg
2+
)＝1:1～1.4，n(nh
4+
):n(po
43
‑
)＝1:0.6～1的范围内，均能得到较好的氨氮去除效果。进行发酵实验后，获得的溶剂产量也更高。
16.作为上述方案的进一步改进，所述钙盐为氧化钙，所述碱液为氢氧化钠溶液，碱液调节溶液的ph至8.0～10.0；所述步骤(3)中，大孔吸附树脂包括非极性树脂、中极性树脂和极性树脂中的一种或多种的混合物，大孔吸附树脂的加入量为糖蜜质量的2～12％；震荡的方式为摇床震荡，震荡时间为15～90min。
17.在糖蜜精制脱毒过程中，先加入钙盐后加入镁盐，防止mg
2+
与ca
2+
竞争po
43
‑
，生成磷酸钙沉淀，从而不利于nh
4+
的去除。鸟粪石法是溶液中同时去除氨氮及po
43
‑
最常用的方法之一，通过加入一定量的含镁、磷沉淀剂，在碱性条件下，po
43
‑
、nh
4+
和mg
2+
以1:1:1的物质量比例进行反应，生成难溶性的磷酸铵镁，即鸟粪石沉淀，进一步通过过滤便可除去。糖蜜中的胶质、灰分等发酵抑制物通过大分子的无机及有机絮凝剂，如聚合氯化铝、聚合硫酸铁、聚丙烯酰胺等絮凝剂，通过电中和、吸附、架桥等作用使胶粒相互聚集，形成絮团后沉降析出。尽管在上述过程中，鸟粪石沉淀及絮凝过程能够去除糖蜜的部分色素，但效果有限，因
此进一步通过大孔吸附树脂进行脱色，所述大孔吸附树脂具有较高的比表面积，尤其是超交联大孔吸附树脂，对色素分子基团具有良好的吸附性能。同时脱色后的树脂可通过无水乙醇和纯水的混合液反复清洗进行再生，可多次重复利用，再生过程中无需额外使用酸、碱及其它有机溶剂，对环境友好，绿色环保。
18.本发明第二方面在于提供一种糖蜜精制脱毒后发酵生产丙酮、丁醇的方法，包括如下步骤：
19.(1)脱灰分、胶质：将糖蜜稀释，稀释后加入酸液调节ph至溶液呈酸性，水浴加热溶液使糖蜜中的非还原糖水解转化为还原糖，之后加入絮凝剂，搅拌后静置，使胶质絮凝沉降，冷却后取上层澄清液，加入钙盐调节ph至中性，离心过滤硫酸钙沉淀，得到清液；
20.(2)脱磷除氮：向清液中加入含镁无机化合物和含磷无机化合物并搅拌，同时用碱液调节ph至碱性，生成鸟粪石沉淀，过滤沉淀后得到澄清液；
21.(3)脱色：向澄清液中加入大孔吸附树脂震荡脱色，之后过滤，所得滤液即为精制脱毒后的糖蜜溶液；
22.(4)发酵菌体驯化：将精制脱毒后的糖蜜溶液配制成不同浓度的驯化培养基，之后按照驯化培养基中糖蜜浓度由低到高的顺序，将丙酮丁醇梭菌依次从低糖蜜浓度培养基接种至高糖蜜浓度培养基进行逐级驯化培养，当接种至糖蜜浓度最高的培养基中培养后即得到驯化后的丙酮丁醇发酵菌株；
23.(5)丙酮丁醇发酵：将驯化后的丙酮丁醇发酵菌株接种到灭菌后的精制脱毒糖蜜培养基中，加入氮源恒温培养，发酵生产丙酮、丁醇。
24.作为上述方案的进一步改进，所述步骤(1)中，糖蜜稀释至波美度为15～30
°
b
é
；所述酸液包括硫酸或磷酸，酸液调节溶液的ph至1.5～3.5；所述水浴加热的温度为60～95℃，加热时间为0.5～3h。
25.作为上述方案的进一步改进，所述步骤(1)中，絮凝剂为无机絮凝剂、有机絮凝剂或无机絮凝剂与有机絮凝剂的混合物，所述无机絮凝剂包括聚合氯化铝、聚合硫酸铁或聚合氯化铝铁，所述有机絮凝剂包括聚丙烯酰胺，无机絮凝剂的加入量为50～300ppm，有机絮凝剂的加入量为5～20ppm。
26.作为上述方案的进一步改进，所述步骤(2)中，含镁无机化合物包括氧化镁、氢氧化镁、氯化镁、硫酸镁、碳酸镁中的一种或多种的组合物，含磷无机化合物包括磷酸、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠中的一种或多种的组合物；所述含镁无机化合物的加入量满足n(nh
4+
):n(mg
2+
)＝1:1～1.4，所述含磷无机化合物的加入量满足n(nh
4+
):n(po
43
‑
)＝1:0.6～1。
27.作为上述方案的进一步改进，所述钙盐为氧化钙，所述碱液为氢氧化钠溶液，碱液调节溶液的ph至8.0～10.0；所述步骤(3)中，大孔吸附树脂包括非极性树脂、中极性树脂和极性树脂中的一种或多种的混合物，大孔吸附树脂的加入量为糖蜜质量的2～12％；震荡的方式为摇床震荡，震荡时间为15～90min。
28.作为上述方案的进一步改进，所述步骤(4)中，驯化培养液为玉米醪糟培养液与精制脱毒后的糖蜜溶液的混合物。
29.作为上述方案的进一步改进，所述步骤(4)中，低糖蜜浓度驯化培养基中的糖蜜浓度为5～10％，丙酮丁醇梭菌在低糖蜜浓度驯化培养基中驯化的时间为12～24h；逐级驯化
培养时培养液中的糖蜜浓度为10～100％，并逐级递增，逐级驯化培养的时间各为12～48h；丙酮丁醇梭菌驯化时的培养温度为34～37℃。
30.本发明利用精制糖蜜发酵液对菌种进行驯化。糖蜜的组成成分非常复杂，经过精制脱毒后，仍存在一定色度值及其它发酵抑制物。本发明将丙酮丁醇梭菌进行驯化，依次从低糖蜜浓度培养基接种至高糖蜜浓度培养基进行逐级驯化培养，得到了对糖蜜耐受性较好的菌株。
31.作为上述方案的进一步改进，采用无水乙醇和纯水的混合液对步骤(3)使用后的大孔吸附树脂进行洗涤，洗涤后烘干，循环反复用于步骤(3)；混合液中无水乙醇与纯水的体积比为1～10:1，洗涤时大孔吸附树脂与混合液的体积比为1:1～5；烘干温度为70～90℃，烘干时间为30～90min。
32.作为上述方案的进一步改进，所述步骤(5)中，氮源为有机氮源，包括豆粕、麸皮、酵母浸膏粉中的一种或多种的混合物，氮源的添加量为发酵液质量的1～2％；恒温培养的时间为48～120h。
33.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
34.1、利用鸟粪石法去除糖蜜中过量的氨氮，降低氨氮对发酵反应的抑制，提高丙酮、丁醇的发酵产量；
35.2、利用大孔吸附树脂对糖蜜进行精制脱毒、脱色，提高发酵产物的品质和发酵的效率；
36.3、使用后的大孔吸附树脂可循环再生反复使用，经济环保，降低脱色工艺的成本；
37.4、采用廉价易得的工业制糖废弃物糖蜜作为丙酮丁醇发酵的底物，降低生物燃料的生产成本，实现工业废弃物资源化利用。
具体实施方式
38.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
39.以下如无特别说明，所用试剂或菌株等材料均为本技术领域的常规材料。
40.实施例1：
41.一种糖蜜精制脱毒后发酵生产丙酮、丁醇的方法，包括如下步骤：
42.(1)脱灰分、胶质：取甘蔗糖蜜原液稀释到波美度为15
°
b
é
，加入磷酸调节ph至1.5，95℃水浴加热0.5h；之后静置冷却至50℃，加入20ppm聚丙烯酰胺絮凝剂絮凝沉降，冷却至室温后取上层澄清液，向上层澄清液中加入氧化钙调节ph至7.0，生成硫酸钙沉淀，离心过滤硫酸钙沉淀，得到清液；
43.(2)脱磷除氮：将清液按n(nh
4+
):n(mg
2+
)＝1:1，n(nh
4+
):n(po
43
‑
)＝1:0.6的物质的量比例加入氯化镁和磷酸二氢钾，磁力搅拌溶液，同时用氢氧化钠溶液调节ph至8.0，生成鸟粪石沉淀(map,化学式为mgnh4po4·
6h2o)，过滤沉淀后得到澄清液；
44.(3)脱色：取100份步骤(2)得到的澄清液，加入2份极性树脂进行震荡脱色，震荡30min，之后过滤，所得滤液即为精制脱毒后的糖蜜溶液；
45.(4)树脂再生：将步骤(3)使用后的极性树脂置于等体积的无水乙醇和水的混合液中(混合液中无水乙醇和水的体积比为10:1)，反复洗涤三次后90℃烘干1h，烘干后的极性
树脂用于重复步骤(3)的脱色操作，共脱色两次；
46.(5)发酵菌体的驯化：将脱色两次后得到的糖蜜溶液与玉米醪糟培养液混合配制成如表1所示的不同糖蜜浓度的驯化培养基(1#～5#培养基)；驯化时，将1#培养基用115℃高压蒸汽灭菌40min后以5％接种量接种丙酮丁醇梭菌菌株，37℃驯化培养12h，之后以针管转接5％接种量的丙酮丁醇梭菌菌株至2#培养基，每恒温培养24h后按糖蜜浓度由低至高的顺序依次转接入下一阶段培养基，并最终在5#培养基中获得驯化菌株；
47.表1
‑
驯化培养基的配制
[0048] 1#2#3#4#5#精制糖蜜2ml4ml8ml14ml20ml玉米醪糟18ml16ml12ml6ml0ml
[0049]
(6)丙酮丁醇发酵：将得到的驯化菌株以5％接种量接种到灭菌后的精制脱毒糖蜜培养基中，加入2％质量分数的麸皮作为氮源，之后恒温培养96h，同时设计对照组(对照组为：将未驯化的丙酮丁醇梭菌菌株接种到相同波美度的糖蜜原液中进行相同条件培养)，定时取样并利用气相色谱仪检测分析发酵产物，结果如表2所示。
[0050]
表2
‑
对照组和实验组发酵产量情况
[0051][0052]
由表2结果可知，经本实施例方法生产得到的产物中，丙酮、乙醇、正丁醇的产量明显高于对照组，说明经本实施例方法对糖蜜精制脱毒后，可提高发酵液的品质和发酵的效率，从而提高丙酮、丁醇等产物的产量。
[0053]
实施例2：
[0054]
一种糖蜜精制脱毒后发酵生产丙酮、丁醇的方法，包括如下步骤：
[0055]
(1)脱灰分、胶质：取甘蔗糖蜜原液稀释到波美度为30
°
b
é
，加入磷酸调节ph至3.5，60℃水浴加热3h；之后静置冷却至30℃，加入50ppm聚合氯化铝絮凝剂絮凝沉降，冷却至室温后取上层澄清液，向上层澄清液中加入氧化钙调节ph至7.0，生成硫酸钙沉淀，离心过滤硫酸钙沉淀，得到清液；
[0056]
(2)脱磷除氮：将清液按n(nh
4+
):n(mg
2+
)＝1:1.2，n(nh
4+
):n(po
43
‑
)＝1:0.8的物质的量比例加入氯化镁和磷酸二氢钠，磁力搅拌溶液，同时用氢氧化钠溶液调节ph至10.0，生成鸟粪石沉淀(map,化学式为mgnh4po4·
6h2o)，过滤沉淀后得到澄清液；
[0057]
(3)脱色：取100份步骤(2)得到的澄清液，加入6份中极性树脂进行震荡脱色，震荡90min，之后过滤，所得滤液即为精制脱毒后的糖蜜溶液；
[0058]
(4)树脂再生：将步骤(3)使用后的中极性树脂置于其5倍体积的无水乙醇和水的混合液中(混合液中无水乙醇和水的体积比为5:1)，反复洗涤三次后70℃烘干1.5h，烘干后的中极性树脂用于重复步骤(3)的脱色操作，共脱色三次；
[0059]
(5)发酵菌体的驯化：将脱色三次后得到的糖蜜溶液与玉米醪糟培养液混合配制
成如表3所示的不同糖蜜浓度的驯化培养基(1#～5#培养基)；驯化时，将1#培养基用115℃高压蒸汽灭菌40min后以5％接种量接种丙酮丁醇梭菌菌株，34℃驯化培养24h，之后以针管转接5％接种量的丙酮丁醇梭菌菌株至2#培养基，每恒温培养48h后按糖蜜浓度由低至高的顺序依次转接入下一阶段培养基，并最终在5#培养基中获得驯化菌株；
[0060]
表3
‑
驯化培养基的配制
[0061] 1#2#3#4#5#精制糖蜜1ml3ml7ml13ml20ml玉米醪糟19ml17ml13ml7ml0ml
[0062]
(6)丙酮丁醇发酵：将得到的驯化菌株以5％接种量接种到灭菌后的精制脱毒糖蜜培养基中，加入1％质量分数的豆粕作为氮源，之后恒温培养48h，同时设计对照组(对照组为：将未驯化的丙酮丁醇梭菌菌株接种到相同波美度的糖蜜原液中进行相同条件培养)，定时取样并利用气相色谱仪检测分析发酵产物，结果如表4所示。
[0063]
表4
‑
对照组和实验组发酵产量情况
[0064][0065]
由表4结果可知，经本实施例方法生产得到的产物中，丙酮、乙醇、正丁醇的产量明显高于对照组，说明经本实施例方法对糖蜜精制脱毒后，可提高发酵液的品质和发酵的效率，从而提高丙酮、丁醇等产物的产量。
[0066]
实施例3：
[0067]
一种糖蜜精制脱毒后发酵生产丙酮、丁醇的方法，包括如下步骤：
[0068]
(1)脱灰分、胶质：取甘蔗糖蜜原液稀释到波美度为25
°
b
é
，加入硫酸调节ph至2.5，80℃水浴加热2h；之后静置冷却至25℃，加入300ppm聚合硫酸铁絮凝剂絮凝沉降，冷却至室温后取上层澄清液，向上层澄清液中加入氧化钙调节ph至7.0，生成硫酸钙沉淀，离心过滤硫酸钙沉淀，得到清液；
[0069]
(2)脱磷除氮：将清液按n(nh
4+
):n(mg
2+
)＝1:1.4，n(nh
4+
):n(po
43
‑
)＝1:1的物质的量比例加入硫酸镁和磷酸，磁力搅拌溶液，同时用氢氧化钠溶液调节ph至9.0，生成鸟粪石沉淀(map,化学式为mgnh4po4·
6h2o)，过滤沉淀后得到澄清液；
[0070]
(3)脱色：取100份步骤(2)得到的澄清液，加入12份非极性树脂进行震荡脱色，震荡90min，之后过滤，所得滤液即为精制脱毒后的糖蜜溶液；
[0071]
(4)树脂再生：将步骤(3)使用后的非极性树脂置于其3倍体积的无水乙醇和水的混合液中(混合液中无水乙醇和水的体积比为1:1)，反复洗涤三次后80℃烘干30min，烘干后的非极性树脂用于重复步骤(3)的脱色操作，共脱色两次；
[0072]
(5)发酵菌体的驯化：将脱色两次后得到的糖蜜溶液与玉米醪糟培养液混合配制成如表5所示的不同糖蜜浓度的驯化培养基(1#～5#培养基)；驯化时，将1#培养基用115℃高压蒸汽灭菌40min后以5％接种量接种丙酮丁醇梭菌菌株，35℃驯化培养24h，之后以针管
转接5％接种量的丙酮丁醇梭菌菌株至2#培养基，每恒温培养24h后按糖蜜浓度由低至高的顺序依次转接入下一阶段培养基，并最终在5#培养基中获得驯化菌株；
[0073]
表5
‑
驯化培养基的配制
[0074] 1#2#3#4#5#精制糖蜜1.5ml4.5ml8.5ml14.5ml20ml玉米醪糟18.5ml15.5ml11.5ml5.5ml0ml
[0075]
(6)丙酮丁醇发酵：将得到的驯化菌株以5％接种量接种到灭菌后的精制脱毒糖蜜培养基中，加入1.5％质量分数的酵母浸膏粉作为氮源，之后恒温培养120h，同时设计对照组(对照组为：将未驯化的丙酮丁醇梭菌菌株接种到相同波美度的糖蜜原液中进行相同条件培养)，定时取样并利用气相色谱仪检测分析发酵产物，结果如表6所示。
[0076]
表6
‑
对照组和实验组发酵产量情况
[0077][0078]
由表6结果可知，经本实施例方法生产得到的产物中，丙酮、乙醇、正丁醇的产量明显高于对照组，说明经本实施例方法对糖蜜精制脱毒后，可提高发酵液的品质和发酵的效率，从而提高丙酮、丁醇等产物的产量。
[0079]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。