棉花GH_D03G1517基因在促进抗旱和耐盐中的应用

棉花gh_d03g1517基因在促进抗旱和耐盐中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体地，涉及棉花gh_d03g1517基因在促进抗旱和耐盐中的应用。


背景技术：

2.在全球范围内影响作物生产的主要胁迫是非生物胁迫，例如：高温、盐和缺水。这些胁迫中最重要的因素是干旱和盐胁迫，它们对农业和粮食供应产生重大影响，并造成作物生产力的重大损失。植物通过使用特定而复杂的信号传导机制来应对外部胁迫，包括代谢产物的积累，与压力有关的基因表达，渗透压和抗氧化剂的合成，根系的发育和蒸腾作用，调节流失到大气中的水分，从而成功地实现了代谢，生理以及形态变化。
3.棉花是一种重要的纤维作物，在全球纺织行业中应用广泛。在世界上受到非生物胁迫影响的地区，维持棉花产量正增长的主要方法之一是挖掘关键基因以提高抗逆性。然而，目前关于棉花抗逆性尤其是抗旱和耐盐基因的研究仍然不足。


技术实现要素：

4.发明人通过对棉花中一个mapk的a组成员gh_d03g1517基因进行鉴定和特性分析，结合荧光定量、转化拟南芥和vigs试验等结果表明，gh_d03g1517基因在棉花抗旱和耐盐中具有重要作用，可用于棉花抗逆分子改良。从而完成本发明。
5.本发明提供了gh_d03g1517基因在促进植物抗旱和耐盐中的应用，所述gh_d03g1517基因具有seq id no:1所示的核苷酸序列。
6.gh_d03g1517基因的开放阅读框为1128bp。
7.在本发明的一些实施方案中，seq id no:1所示的核苷酸序列能够编码seq id no:2所示氨基酸序列。包括该氨基酸序列的蛋白的相对分子量为43.018kda，等电点为5.677。
8.在本发明的一些实施方案中，在植物中提高gh_d03g1517基因的表达量，以促进植物抗旱和耐盐。
9.在本发明的一些具体实施方案中，所述的在植物中提高gh_d03g1517基因的表达量是通过如下方法实现：提高植物内源gh_d03g1517基因的表达，或在植物中过表达外源gh_d03g1517基因。
10.在本发明的一个具体要求实施方案中所述过表达外源gh_d03g1517基因是指将所述gh_d03g1517基因利用植物表达载体，经农杆菌介导转化到植物中进行表达。
11.进一步地，所述gh_d03g1517基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。
12.更进一步地，所述植物表达载体通过一种组成型或诱导型启动子驱动所述gh_d03g1517基因的表达。
13.再进一步地，所述组成型启动子是35s启动子。
14.在本发明中，所述促进开花是指促使植物开花期提前。
15.在本发明中，所述植物是棉花、玉米、水稻、小麦或拟南芥。
16.本发明的有益效果
17.本发明通过沉默棉花中gh_d03g1517基因，结果表明gh_d03g1517基因在促进棉花抗旱和耐盐方面可能具有关键作用。利用本发明，可为植物尤其是棉花的抗逆分子改良进行技术支持。
附图说明
18.图1示出了：干旱和盐胁迫条件下，gh_d03g1517超表达株系的生理参数评估：ⅰ.干旱和盐处理前后过表达系和wt植株的表型特征。ⅱ.胁迫8d后，wt和过表达株系叶片(a)叶片相对含水量(rlwc)，(b)离体叶片失水(elwl)，(c)离子渗漏，(d)叶绿素ii含量的定量测定。每个实验重复三次，误差线表明标准差(sd)，柱上不同的字母表明统计学显著性差异(anova,p<0.05)。wt：野生型，l2、l6、l8：超表达株系。
19.图2示出了：干旱和盐胁迫条件下，gh_d03g1517转基因株系氧化剂和抗氧化剂浓度水平的测定：胁迫8d后，野生型和过表达系的叶片(a)丙二醛(mda)的定量测定，(b)过氧化氢(h2o2)浓度的定量测定，(c)过氧化氢酶(cat)含量的定量测定，(d)过氧化物酶(pod)的定量测定。每个实验重复三次，误差线表明标准差(sd)，柱上不同的字母表明统计学显著性差异(anova,p<0.05)。wt：野生型，l2、l6、l8：超表达株系。
20.图3示出了：gh_d03g1517超表达株系(l2、l6和l8)和野生型拟南芥中非生物胁迫应答基因(abf4、kin1、rab18和rd22)的表达水平。atactin2作为管家基因。字母a/b表示统计上的显著性差异(anova,p<0.05)。误差线表示3个生物重复的标准差(sd)。
21.图4示出了：peg处理下野生型和gh_d03g1517超表达株系萌发率和根系生长情况。定量种子萌发(a)1/2ms琼脂，(b)8％peg平板，(c)10％peg平板，(d)15％peg平板，每个实验重复三次，每个测量值代表50粒种子的平均萌发率
±
sd。(e)种子在添加了0、8％、10％和15％peg的1/2ms上萌发7天后的萌发情况。将在1/2ms培养基上生长3天的幼苗转移到含有0、8％、10％和15％peg的培养基上生长7天后(f)野生型和gh_d03g1517超表达株系根系生长情况，(g)根系伸长的对比，每个实验重复三次，比例尺2cm，每个测量值代表50棵幼苗的平均根长，误差线表明标准差(sd)，柱上不同的字母表明统计学显著性差异(anova,p<0.05)。
22.图5示出了：盐处理下野生型和gh_d03g1517超表达株系萌发率和根系生长情况。定量种子萌发(a)1/2ms琼脂，(b)50mm平板，(c)75mm平板，(d)100mm平板，每个实验重复三次，每个测量值代表50粒种子的平均萌发率
±
sd。(e)种子在添加了0、50mm、75mm和100mm nacl的1/2ms上萌发7天后的萌发情况。将在1/2ms培养基上生长3天的幼苗转移到含有0、50mm、75mm和100mm nacl的培养基上(f)野生型和gh_d03g1517超表达株系根系生长情况，(g)生长7天后根系伸长的对比，每个实验重复三次，比例尺2cm，每个测量值代表50棵幼苗的平均根长，误差线表明标准差(sd)，柱上不同的字母表明统计学显著性差异(anova,p<0.05)。
23.图6示出了：gh_d03g1517提高了拟南芥整个生长周期内的耐旱性。(a
‑
b)在一个完整的生长周期内转gh_d03g1517基因拟南芥耐旱性分析，比例尺4cm。(c)转gh_d03g1517基因和野生型拟南芥在干旱处理和空白对照条件下的果荚长度。(d
‑
f)在干旱处理和空白对
照条件下测量了35s:gh_d03g1517和wt植株的茎长、果荚长和单株果荚数。每个实验重复三次。误差线表明标准误差(sd)，柱上不同的字母表明统计学显著性差异(anova,p<0.05)。
24.图7示出了：vigs处理棉花植株生理参数评估：(ⅰ)(a
‑
c)psd、空载和gh_d03g1517沉默植株的表型，(d)gh_d03g1517在空白对照和gh_d03g1517沉默植株中的表达水平。(ⅱ)干旱和对照处理8天后，测定空载和gh_d03g1517
‑
vigs植株叶片(a)rlwc，(b)elwl，(c)离子渗漏，(d)叶绿素浓度。每个实验重复三次。误差线表示三个生物学重复的sd。柱上不同的字母表明统计学显著性差异(anova,p<0.05)。
25.图8示出了：干旱胁迫条件下，gh_d03g1517
‑
vigs和va棉花植株叶片中氧化剂和抗氧化酶分析和胁迫应答基因的表达水平。(ⅰa
‑
d)干旱和对照处理7天后定量测定(a)mda，(b)h2o2，(c)cat和(d)pod。(ⅱ)胁迫应答基因相对表达量(a)dxt/mate，(b)ghmekk24，(c)ghraf4。误差线表示三个生物学重复的sd。柱上不同的字母表明统计学显著性差异(anova,p<0.05)。
具体实施方式
26.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
27.实施例
28.以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
29.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
30.那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
31.实施例1
32.1.棉花材料
33.本实施例选取的棉花材料为陆地棉tm
‑
1、中棉所10号、中h177。利用陆地棉tm
‑
1对组织或器官表达进行评估。为得到营养组织的植株种植在16小时光照8小时黑暗的25℃生长室中。为得到生殖组织的植株种植在中国农业科学院棉花研究所试验田(中国河南省安阳市)。在室内，像幼嫩的叶片这样的组织在种植的初期取样，茎秆、真叶和根在播种后两周时取样。开花后10天，从田间采集花。
34.利用中棉所10号和中h177分别进行盐胁迫和干旱胁迫试验。中棉所10号和h177的棉花幼苗生长在16小时光照/8小时黑暗周期的25℃实验室生长室中。用15％聚乙二醇6000(peg
‑
6000)处理幼苗引起干旱胁迫，用200mm的氯化钠处理植株引起盐胁迫。分别在处理后的0h，2h，4h，6h，12h，48h和72h取样。每个实验进行了3次。
35.2.试剂与耗材
36.2.1酶及试剂盒：gxl dna polymerase高保真酶、胶回收试剂盒、pcr产物纯化试剂盒均购自takara公司；rna反转录试剂盒、kod fx neo酶(code.no.kfx
‑
201)
购自toyobo公司；ultra one step cloning kit试剂盒购自vazyme公司；质粒少量提取试剂盒购自magen公司；限制性内切酶(bamh i、sac i)购自neb公司；dna marker iii、植物总rna提取试剂盒购自tiangen公司；荧光定量transstart top green qpcr supermix购自transgen公司。
37.2.2其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠、蔗糖、silwet l
‑
77、间苯三酚等为国产分析纯，卡纳霉素、硫酸链霉素、氨苄青霉素等购自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌感受态细胞trans5α购自北京全式金生物技术有限公司，农杆菌感受态细胞lba4404购自上海唯地生物技术有限公司。
38.2.3培养基：lb液体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeast extract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l；lb固体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeast extract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l、琼脂粉(agar)15g/l，定容至1l；lb选择培养基：在lb铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板。本文中提到的但未列出的各种试剂溶液均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级。
39.2.4主要仪器：pcr扩增仪(eppendorf)、高速离心机(eppendorf 5427r)、电泳设备(北京六一)、凝胶成像系统(bio
‑
rad)、荧光定量pcr仪(abi7500)、荧光显微镜(olympus bx43)、恒温培养振荡器(上海智城)、人工气候试验箱(赛福)等。
40.实验方法与结果
41.1棉花gh_d03g1517基因的生物信息学分析与克隆
42.1.1从ncbi上获得gh_d03g1517的基因序列，采用primer premier 5.0软件设计引物，采用pcr(polymerase chain reaction)的方法从陆地棉中tm
‑
1中扩增，其开放阅读框为1128bp，编码375个氨基酸，蛋白的相对分子量为43.018kda，等电点为5.677。基因开放阅读框序列为(seq id no:1)：
43.atggctgacgtcgctccgggaaacgccggcggtcaatttggagattttccgacgattcatacacatggaggtcagtttattcagtataatatttttggaaatttgttcgaggtgacgtctaagtatcggcctccgatcatgccgatcggtcgtggagcctacggcatcgtttgctcggtgttgaattcggagacaaacgagatggttgcggtaaagaaaatcgccaacgcttttgataatcacatggatgctaagcgcacgcttcgtgagattaaactccttcgacatttggatcacgaaaacgttattggaatcaaagatgtgattcctccgcctttaaggagggaatttactgatgtttacattgcgactgagctcatggataccgatcttcaccaaatcattcgctctaatcagagtttatcggaggagcattgccagtatttcttgtatcaaattcttcgaggactgaagtacatacattctgccaatgtcattcatagagatttgaaacccagcaacctcttgctgaatgctaattgtgatcttaagatttgcgactttggtctcgctcggcctactgctgagaatgagtttatgactgaatatgttgtcacgaggtggtatcgggcaccggagatattgctaaactcttcagactacaccgctgccatagatgtctggtctgttggttgcatcttcatggagctcatgaataggaagcctctgtttccaggcaaagatcatgtacatcaaatgcgtttattaactgagctgctcggcacaccaactgaatccgatcttggatttctccggaacgaggatgcaaggagatatatcaggcagctcccagcacatccgcgccaatcactagcagaagttttcccacatgttcatccattggccattgatctcattgacagaatgttgacatttgatccgaccagaaggattactgttgaagaagcattggcacatccttacctcgaaagattacacgacatatctgatgaaccagtctgccccgaaccgttttctttcgactttgagcagcaaccattgggagaagaacagatgaaggacatgatttaccaagaggccttggctctgaatccaacttatgcttaa
44.氨基酸序列为(seq id no:2)：
45.madvapgnaggqfgdfptihthggqfiqynifgnlfevtskyrppimpigrgaygivcsvlnsetnemvavkkianafdnhmdakrtlreikllrhldhenvigikdvippplrreftdvyiatelmdtdlhqiirsnqslseehcqyflyqilrglkyihsanvihrdlkpsnlllnancdlkicdfglarptaenefmteyvvtrwyrapeillnssdytaaidvwsvgcifmelmnrkplfpgkdhvhqmrlltellgtptesdlgflrnedarryirqlpahprqslaevfphvhplaidlidrmltfdptrritveealahpylerlhdisdepvcpepfsfdfeqqplgeeqmkdmiyqealalnptya
46.1.2具体克隆基因的过程为：
47.(1)在棉花幼苗期，取幼嫩的棉花叶片，速冻于液氮，存于
‑
80
°
冰箱备用。植物总rna提取采用tiangen公司试剂盒。
48.(2)rna的提取步骤为：
49.以下所有离心步骤均在室温下进行。
50.1)匀浆处理：100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入700μl sl(使用前加入β
‑
巯基乙醇)，立即剧烈震荡使样品混匀。
51.2)12,000rpm离心2min。
52.3)将上清液转移至过滤柱cs上，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的rnase
‑
free的离心管中，吸头避免接触收集管中的细胞碎片。
53.4)加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将混合物转入吸附柱cr3中，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
54.5)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
55.6)dnase i工作液：取10μl dnase i储存液和70μlrdd溶液轻柔混匀。
56.7)向cr3中加入80μl的dnase i工作液，室温静止15min。
57.8)静置完后，向cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
58.9)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw(使用前加入乙醇)，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
59.10)重复步骤9。
60.11)12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，将吸附柱cr3放入一个新的rnase
‑
free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30
‑
50μl rnase
‑
free ddh2o，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，得到rna溶液。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。rna样品请在
‑
70℃中保存。如果预期rna得率大于30μg，可将步骤11中离心得到的rna溶液再加入吸附柱cr3中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，得到rna溶液。
61.为预防rnase污染，注意事项：
62.1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致rnase污染；
63.2)使用无rnase的塑料制品和枪头避免交叉污染；
64.3)rna在裂解液sl中时不会被rnase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含rnase的塑料和玻璃器皿。
65.4)配制溶液应使用rnase
‑
free ddh2o。
66.(3)cdna的合成。将500ng rna反转录为cdna，采用toyobo的反转录试剂盒fsq
‑
201，反转录体系为：
67.按下列组份配制rt反应液(反应液配制在冰上进行)：
[0068][0069]
反转录反应条件如下：
[0070]
37℃15min(反转录反应)，
[0071]
98℃5s(反转录酶的失活反应)；
[0072]
将反转录产物cdna溶液稀释6倍作为pcr反应模板。
[0073]
(4)基因克隆的pcr反应体系、程序和产物检测
[0074]
1)pcr反应体系，根据takaragxl dna polymerase高保真酶说明书，pcr反应体系如下：
[0075][0076]
2)pcr扩增程序为：
[0077][0078]
引物序列：
[0079]
上游引物f
[0080]5′‑
atggctgacgtcgctccggga
‑3′
(seq id no:3)
[0081]
下游引物r
[0082]5′‑
ttaagcataagttggattcag
‑3′
(seq id no:4)
[0083]
3)pcr产物的检测
[0084]
取1μl pcr产物，加入11μl 6
×
loading buffer，混匀，点样于1％琼脂糖凝胶，电泳检测。
[0085]
对目的片段使用胶回收试剂盒进行切胶回收。
[0086]
将上述胶回收的产物根据ultra one step cloning kit试剂盒进行连接t载体构建和转化大肠杆菌。
[0087]
37℃过夜培养从抗性lb培养基上挑取单克隆后37℃摇菌培养。
[0088]
菌液pcr验证，挑取阳性克隆样品，送样至金唯智生物科技有限公司测序，测序正确的菌液中加入一定量的甘油，使甘油终浓度在20％左右，
‑
70℃保存。
[0089]
2pbi121
‑
gh_d03g1517植物表达载体的构建
[0090]
本试验载体构建采用ultra one step cloning kit试剂盒，该试剂盒适用于任意载体与任意基因片段的连接，反应时间仅需15min，要求插入片段与线性化载体分别在5
′
端和3
′
端有15bp重叠区域。
[0091]
扩增引物为：
[0092]
上游引物f(seq id no.5：5
′‑3′
)
[0093]
cacgggggactctagaatggctgacgtcgctcc
[0094]
下游引物r(seq id no.6：5
′‑3′
)
[0095]
gatcggggaaattcgagctcttaagcataagttggattcagagccaagg
[0096]
其操作程序如下：以目的基因gh_d03g1517的克隆载体为模板，扩增后纯化插入片段；将获得的插入片段gh_d03g1517与pbi121线性化载体按照2:1的摩尔比例配置体系。
[0097][0098]
将上述溶液混匀，50℃下反应10min，然后放在冰上，转化trans5α感受态细胞，挑取单克隆，送样测序，获得包含正确目的基因的过表达载体。
[0099]
该过程使用平板为抗卡那霉素的lb抗性培养基，配制的卡那霉素50mg/ml，用时稀释1000倍，即100ml的培养基加入100μl的50mg/ml卡那霉素。
[0100]
3.利用农杆菌介导的方法转化gh_d03g1517基因于拟南芥
[0101]
3.1利用冻融法转化根癌农杆菌gv3101感受态细胞，具体转化过程如下：
[0102]
(1)向根癌农杆菌gv3101感受态细胞100μl中加入构建好的目的基因过表达载体质粒1μg(2
‑
10μl)，混匀后冰浴30min；液氮速冻2
‑
3min，37℃热激90s；
[0103]
(2)冰浴5min，再加入800μl lb液体培养基；
[0104]
(3)190rpm，28℃，培养4h后，4000rpm离心5分钟，吸去上清液至剩余400
‑
500μl，反复吸打混匀后取200μl菌液涂在含有卡那霉素、硫酸链霉素和利福平的三抗筛选培养基上，28℃培养大约36
‑
48h，抗性菌落可见；
[0105]
(4)挑取单菌落在1ml的含有三抗的lb液体培养基中培养16h左右，直至浑浊；
[0106]
(5)菌落pcr和酶切鉴定，筛选出阳性农杆菌株，20％甘油菌液于
‑
80℃保存。
[0107]
3.2采用花序浸染法转化拟南芥
[0108]
(1)将
‑
80℃保存的农杆菌菌液20μl接种到1ml lb液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养过夜，取活化菌液200μl加入到20ml lb液体培养基28℃、180rpm振荡培养；
[0109]
(2)待菌液od值约为1.2
‑
1.6时，3000rpm离心菌液收集菌体；
[0110]
(3)转化介质配方为：5％蔗糖，0.03％silwet l
‑
77(steven j,1998)；
[0111]
(4)用上述转化介质悬浮菌体，调od
600
＝0.8开始浸染；
[0112]
(5)将拟南芥花序置于转化介质中30
‑
50s，浸染后用保鲜膜将拟南芥包起来，暗培养24h后置于正常条件下培养，待成熟后收获种子。
[0113]
4.转基因拟南芥植株的表型鉴定
[0114]
4.1超表达和野生拟南芥的胁迫处理，生理参数测量，氧化剂和抗氧化剂的测定
[0115]
发明人将超表达t3代拟南芥株系l2、l6、l8和野生型的种子表面消毒后种植在温室内。7天后，将幼苗移栽到装满按1:1的比例混合的蛭石和腐殖质小盆中。为了诱发干旱胁迫，断水8天和14天。同一时期，利用250mm nacl溶液诱发盐胁迫。对于干旱胁迫，将植物重新浇水以测量抗旱率。测量叶片相对叶含水量，离体叶片失水，离子渗漏和叶绿素含量等生理参数。叶片相对含水量测定方法是取处理后的植株同部位的叶片称鲜重(fw)后，将其统一放在含有自来水的培养皿中吸水12h，擦干叶片表面水分立即称重(tw)，再将叶片统一放到烘箱中65℃烘烤12h后称重(dw)，计算叶片相对含水量＝{(fw
‑
dw)/(tw
‑
dw)}
×
100。离体叶片失水测定方法是将叶片取下后称鲜重(fw)，然后置于温湿度及光照强度恒定的培养室
内24h后称重(ww)，再将叶片统一放到烘箱中65℃烘烤12h后称重(dw)，离体叶片失水＝(fw
‑
ww)/dw)。叶片离子渗漏取棉花叶片约0.1g，用双蒸水冲洗次，吸水纸轻轻吸干叶片表面水分，将叶片剪碎置于25ml双蒸水中，在真空干燥器中于0.05mpa下抽气20min，25℃下缓慢振荡2h，然后测定电导率s1，同时测定水的空白电导率c1。再将样品在沸水浴中处理20min，冷却至室温后定容到25ml测定电导率s2，以相同方式处理水，测定其空白电导率c2。离子渗漏＝(s1
‑
c1)/(s2
‑
c2)
×
100％。叶绿素含量测定取叶片0.1g，用80％丙酮浸提法提取叶绿素，按以下公式计算叶绿素含量：c
t
＝20.29d
645
+8.05d
663
。
[0116]
4.2干旱和盐处理下的萌发和根系生长试验
[0117]
对于转基因种子和野生型种子的发芽率，发明人将种子表面灭菌并播种在分别添加peg(8％，10％，15％)和盐(50mm，75mm和100mm)的1/2ms平板上。将平板分层放置在4℃下的黑暗中2天，然后放置在22℃，70％相对湿度和16/8小时光照/黑暗周期的受控条件下的生长室中。每天记录发芽率，连续7d。每个实验进行了3次，共进行了3次技术重复，每块板上有50粒种子。在根生长试验中，将种子灭菌并铺在1/2ms上，并置于生长室中，然后将三天大的幼苗转移至添加有peg(8％，10％和15％)溶剂的1/2ms平板中垂直生长，以模拟干旱胁迫下的水分亏缺，对于盐胁迫，将三天大的幼苗转移至添加有盐(50mm、75mm和100mm)的1/2ms平板中垂直生长，一周后，测量根的长度。
[0118]
4.3干旱和盐胁迫下wt和gh_d031517过表达拟南芥中胁迫响应基因的表达
[0119]
发明人选择了四个胁迫响应基因abf4、kin1、rd22和rab18，以确定它们在干旱和盐胁迫下的gh_d03g1517过表达拟南芥和野生型中的表达。使用takara提取试剂盒，从对照，干旱和盐胁迫条件下培养的gh_d031517过表达拟南芥和野生型(wt)幼苗的成熟的叶片中提取rna。使用prime script rt试剂盒将rna转化为cdna(takara，中国)。使用sybr
‑
green master荧光嵌入染料进行qpcr实验。
[0120]
4.4超表达gh_d03g1517提高了转化植株的耐旱和耐盐性
[0121]
发明人对野生型和转基因株系的相对含水量进行了评估，发现在干旱和盐胁迫下，超表达株系中的相对水分含量明显高于野生型。过表达的株系具有相同浓度的相对水含量。与野生型相比，转基因株系的离体叶片失水(ewl)明显更低。在野生型中，离子渗漏也高于转基因株系，表明转基因株系比野生型具有更高的细胞膜稳定性(cms)(图1)。gh_d03g1517转基因株系的高cms表明该基因调控干旱和盐胁迫状况。叶绿素含量在转基因株系中相同，但在野生型中却显着降低。这表明，与转基因株系相反，野生型具有较高的氧化应激水平。干旱处理14天，与转基因株系相比，野生型植株产生极度的枯萎。在正常条件下，野生型和转基因株系具有相似的生长状况。
[0122]
此外，发明人分析了转基因株系和野生型的酶活性。在处理前和处理后分别检测了两个抗氧化剂(cat和pod)和两个氧化剂(mda和h2o2)。转基因株系的抗氧化剂的浓度显著的高于野生型(图2)。转基因株系中较高的抗氧化水平表明，转基因株系可以在盐和干旱胁迫下将ros大大降低到正常水平。干旱和盐胁迫处理下，野生型的氧化剂(h2o2和mda)浓度显著升高，而转基因株系的氧化剂(h2o2和mda)浓度显著降低(图2)。当植物处于缺水和高盐等不利环境中时，细胞功能和不同的生化参数发生了显著变化。
[0123]
为进一步探讨gh_d03g1517在棉花干旱和盐胁迫中的作用，发明人研究了4个胁迫应答基因的表达水平。使用的四种应激反应基因是abre binding factor4(abf4)、stress
‑
induced protein(kin1)、ras
‑
related protein(rab18)和desiccation
‑
responsive(rd22)。在对照中，野生型和转gh_d03g1517植株的表达谱是相同的。然而，在干旱和盐处理后相比于野生型所有的转基因株系表现出上调(图3)。这表明gh_d03g1517的过表达对应激反应基因的表达谱具有有益的作用。暗示这些基因调控在这些植物的非生物胁迫耐受性中起重要作用。这些基因被认为是胁迫耐受基因。
[0124]
4.5gh_d03g1517的过表达增强了种子萌发和根系生长，从而耐受干旱和盐胁迫
[0125]
在peg处理下，转基因株系和野生型种子的萌发率存在显著差异。野生型种子萌发对peg的敏感性高于转基因株系。8％peg处理下，转基因拟南芥种子的发芽率为84～85％，野生型种子的发芽率为67～69％。与转基因株系相比，在10％和15％peg处理下，野生型种子的发芽速率延迟(图4，a
‑
d)。为了评估根长，发明人测量了干旱胁迫下转基因株系和野生型的根生长情况，发现转基因株系和野生型的根长存在较大差异(图4，f
‑
g)。
[0126]
在盐胁迫环境下，野生型和转基因株系的萌发率均显著降低，而转基因株系的萌发率受抑制程度较低。野生型的发芽率较低，但过表达系的发芽率高得多(图5，a
‑
d)。在盐胁迫条件下，转基因株系的根伸长较长，而野生型的根长较短(图7，e
‑
f)。
[0127]
4.6在拟南芥株系的整个生长阶段gh_d03g1517都保持了耐旱性
[0128]
在转基因拟南芥的苗期，gh_d03g1517的过表达显著提高了拟南芥的耐旱性。在整个生育周期中，也观察到抗旱性有所提高，因此造成种子产量和干物质的提高。这种增加在植物的整个生长周期中得以维持，并最终提高了干燥种子的产量(图6，a
‑
b)。随着干旱胁迫的持续，转基因株系的植株高度、荚果长度和每荚果的种子数量都显著高于野生型(图6，c
‑
f)。gh_d03g1517过表达的拟南芥和对照野生型均表现出正常的生长。结果表明，gh_d03g1517在植物体内的过表达提高了植物对干旱胁迫的耐受性和种子产量。
[0129]
5.棉花中gh_d03g1517的沉默
[0130]
5.1棉花vigs的具体操作过程简单描述如下：
[0131]
1)载体的构建：避开保守结构域，基于gh_d03g1517的cds序列用oligo7进行引物设计并添加接头序列(spe i和asc i)，以tm
‑
1叶片样品cdna为模板进行目的片段的扩增。扩增的产物进行回收纯化，然后与酶切后的pclcrva载体进行连接。
[0132]
上游引物f(seq id no.7：5
′‑3′
)
[0133]
atgcctgcagactagtccgctgccatagatgtctggtct
[0134]
上游引物r(seq id no.8：5
′‑3′
)
[0135]
agacctaggggcgcgccctggttcatcagatatgtcgtgtaatctttcg
[0136]
2)转化：将重组载体转化到大肠杆菌感受态dh5α中，培养之后，挑取单克隆进行测序验证。将序列正确的阳性克隆进行扩繁，而后进行质粒的提取。重组质粒电转化到农杆菌感受态菌株lba4404。
[0137]
3)植株准备：选择饱满的tm
‑
1的棉花种子，种植在人工气候室内，在25℃、16/8h的光照/黑暗生长条件下培养10d左右，待棉花子叶展片，第一片真叶未出现或者刚露出叶芯时，进行后续实验。
[0138]
4)菌液活化：将pclcrva
‑
gh_d03g1517、pclcrva
‑
pds、空载pclcrva和pclcrvb的lba4404菌株加入到含三抗(卡那霉素、利福平和链霉素，50mg/l)的液体lb培养基中，在28℃，180r/min条件下培养14
‑
16h。
[0139]
5)菌液扩摇：将以上活化后的菌液各取100μl，加入到50ml的含有上述三种抗生素的液体lb培养基中，在28℃，180r/min条件下培养16
‑
20h，使菌液的od600值在1.5
‑
2.0之间(这时的菌液一般变为橙黄色)。5000g，离心10min，回收菌体。
[0140]
6)转化介质配制：用配好的转化介质对上述收集的菌体进行悬浮，使od600值在1.5左右，然后于室温避光静置3h以上。其中转化介质配方如下：
[0141][0142]
7)侵染：将pclcrvb与pclcrva(空载)、pclcrva
‑
pds、pclcrva
‑
gh_d03g1517的介质分别按照1:1混匀。用无菌的注射器针头轻轻划伤棉花子叶的背部，用1ml的注射器(去掉针头)吸取混合的菌液，注入子叶中，直至子叶完全浸润。注射后的幼苗避光培养1d，而后置于22℃、16/8h的光照/黑暗生长条件下的人工气候室培养。
[0143]
8)观察与取样：待阳性对照植株(pclcrva
‑
pds)出现白化表型之后，对各植株进行dna的提取，用引物(va
‑
f/r和vb
‑
f/r)进行pcr检测。将阳性植株移栽至大盆中培养至开花，观察各单株花器官的表型，并取各植株的花药组织，进行rna的提取，检测各基因的表达变化。
[0144]
5.2棉花中gh_d03g1517的沉默增加了棉花对干旱的敏感性
[0145]
pclcrva
‑
pds侵染棉花植株2周后表现为白化表型。白化表型是叶片叶绿素含量损失的结果(图7)。利用qrt
‑
pcr检测vigs对gh_d03g1517表达的影响。在沉默植物(pclcrva
‑
g_d03g1517)中gh_d03g1517表达水平与对照植物(pclcrva)相比明显较低(图7)。这些研究结果表明，在棉花植株中成功敲除了目的基因。检测了沉默基因棉花(pclcrva
‑
gh_d03g1517)和对照植物(pclcrva)的生理参数，如rlwc、elwl、叶绿素ii含量和离子渗漏。结果表明，沉默植株的rlwc和叶绿素含量低于对照，elwl和离子渗漏高于对照。过度的离子泄漏是由于应力暴露导致细胞膜稳定性的丧失(图7)。
[0146]
发明人测定了gh_d03g1517沉默和pclcrva对照植株两种氧化剂(mda和h2o2)和两种抗氧化剂(cat和pod)的酶活性。沉默植物的抗氧化剂(mda和h2o2)浓度明显高于对照植物。gh_d03g1517沉默的植物中抗氧化剂(cat和pod)的浓度显着低于对照植物(图8)。这表明基因已经被成功地抑制了。不同棉花品种的抗氧化能力衡量了其对干旱胁迫的耐受性(ullah等人2017)。另外，病毒诱导的基因沉默(vig)的结果表明，在gh_d031517沉默棉株中失水和干旱敏感性高，表明该基因在棉花对干旱胁迫的耐受性中起作用。
[0147]
发明人利用qrt
‑
pcr分析了沉默棉花中的棉花raf激酶(ghraf4)、丝裂原活化蛋白激酶激酶(ghmekk12)和dxt/mate(ghdtx2)的表达水平。结果表明，胁迫条件下，在gh_d03g1517基因沉默叶片组织中下调表达，在对照植株中上调表达(图8)。
[0148]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可
以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。