一种杂合抗菌肽及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种杂合抗菌肽及其制备方法和应用。


背景技术：

2.饲粮中添加抗生素可缓解仔猪断奶应急，促进仔猪生长，但抗生素残留及病原菌耐药性问题对畜禽及人类健康产生了负面的影响。2020年，我们国家畜禽养殖用饲料全面禁抗，饲用抗生素的禁用会造成仔猪保育前期的发病死淘率增加，生长速度降低。在饲料禁抗的背景下，寻求有效的抗生素替代物，提升猪肠道免疫调节作用，研发新型高效安全的产品来改善生猪肠道健康就显得尤其重要。
3.抗菌肽是一类具有广谱抑菌活性的多肽类物质，部分抗菌肽还能激活免疫系统，在细胞信号传导过程、细胞增殖调节过程以及抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫等方面具有重要功能。抗菌肽因其独特的杀菌机制和优良的理化性质成为抗生素替代品研发的热点，抗菌肽在医用抗感染治疗药物以及畜牧业生产中具有广阔应用前景。在抗菌肽研发过程中，改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是提高其活性的有效途径。对抗菌肽进行分子设计、结构改造和修饰、降低其溶血活性、提高其抑菌活性和酸碱稳定性等成为抗菌肽研发的重要内容之一。
4.melectin是分离自隐寄生蜂毒液的一种抗菌肽，可抑制革兰氏阳性和阴性菌，具有较低的溶血活性。protonectin是分离自新大陆热带区社会黄蜂agelaia pallipes毒液的阳离子型抗菌肽。其对大肠杆菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌、金色葡萄球菌都有一定的抑制作用。
5.目前，改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是提高其活性的有效途径。采用基因工程技术生产抗菌肽具有活性高、产量大、成本低廉、生产速度快、易于规模化生产等优点。目前抗菌肽的抗菌活性较抗生素还存在一定的差距，且很多抗菌肽还存在着毒性强、稳定性差、成本高等诸多问题。因此，对抗菌肽进行分子设计、结构改造和修饰、降低其溶血活性、提高、提高其抑菌效果及广泛性、提高其热稳定性、酸碱稳定性等成为抗菌肽研发的重要内容之一。


技术实现要素：

6.本发明的第一个目的在于提供一种杂合抗菌肽。
7.本发明的第二个目的在于提供一种核酸分子。
8.本发明的第三个目的在于提供一种表达载体。
9.本发明的第四个目的在于提供一种重组细胞。所述细胞非植物或动物细胞。
10.本发明的第五个目的在于提供上述抗菌肽或核酸分子或表达载体或重组细胞在制备微生物抑制剂中的应用。
11.本发明的第六个目的在于提供上述抗菌肽或核酸分子或表达载体或重组细胞在制备饲料或添加剂中的应用。
12.本发明的第七个目的在于提供一种添加剂。
13.本发明所采取的技术方案是：
14.本发明的第一个方面，提供一种杂合抗菌肽melectin
‑
p，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
15.本发明的第二个方面，提供一种核酸分子，编码本发明第一方面所述抗菌肽。
16.在本发明的一些优选实施方式中，所述核酸分子的序列如seq id no:2所示。
17.本发明的第三个方面，提供一种表达载体，包含本发明第二方面所述核酸分子。
18.本发明的第四个方面，提供一种重组细胞，包含本发明第三方面所述表达载体。
19.在本发明的一些实施方式中，所述细胞非植物细胞或动物细胞。
20.本发明的第五个方面，提供本发明第一方面所述杂合抗菌肽或本发明第二方面所述核酸分子或本发明第三方面所述表达载体或本发明第四方面所述重组细胞在制备微生物抑制剂中的应用。
21.在本发明的一些实施方式中，所述微生物为大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌。
22.本发明的第六个方面，提供本发明第一方面所述杂合抗菌肽或本发明第二方面所述核酸分子或本发明第三方面所述表达载体或本发明第四方面所述重组细胞在制备饲料或添加剂中的应用。
23.在本发明的一些优选实施方式中，所述添加剂为防腐剂或药。
24.在本发明的一些优选实施方式中，所述药为兽药。
25.在本发明的一些实施方式中，所述添加剂为食品添加剂、饲料添加剂、化妆品添加剂或卫生产品添加剂。
26.本发明的第七个方面，提供一种添加剂，包含本发明第一方面所述杂合抗菌肽。
27.在本发明的一些实施方式中，所述添加剂为防腐剂或药。
28.在本发明的一些优选实施方式中，所述药为兽药。
29.在本发明的一些实施方式中，所述添加剂为食品添加剂、饲料添加剂、化妆品添加剂或卫生产品添加剂。
30.在本发明的一些实施方式中，所述饲料添加剂的使用量为0.1～1％。
31.在本发明的一些优选实施方式中，所述饲料添加剂的使用量为0.2％。
32.本发明的有益效果是：
33.本发明提供一种杂合抗菌肽melectin
‑
p、编码抗菌肽的核酸分子以及包含上述核酸分子的表达载体或重组细胞。本发明中的杂合抗菌肽melectin
‑
p具有广谱抗菌活性，对多数革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有不同程度的抑菌活性，特别是对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌活性。同原始抗菌肽相比，杂合后抗菌肽对常见致病菌的抑菌活性显著增强。抑菌特别是同时又具有热稳定性和酸稳定性的特点，使其在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显示很好的应用前景。而且本发明中的杂合肽melectin
‑
p是小分子肽，可以在100℃的高温保持45min，具有较好的热稳定性，可以满足饲料制粒的高温要求。
附图说明
34.图1为重组杂合肽melectin
‑
p的tricine
‑
sds
‑
page电泳检测。其中条带2
‑
7分别为重组菌发酵0h、24h、48h、72h、96h和120h的电泳图；条带1和8为marker。
35.图2为重组杂合肽melectin
‑
p的热稳定性图。
36.图3为重组杂合肽melectin
‑
p的酸碱稳定性图。
具体实施方式
37.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
38.毕赤酵母x
‑
33(his
‑
mut
+
)、表达载体ppiczα
‑
a购于invitrogen公司；escherichia coli atcc25922、pseudomonas aeruginosa atcc 19429、staphylococcus aureus atcc6538、salmonella enterica atcc13076、salmonella typhimurium atcc14028为本实验室保存。
39.限制性内切酶xholⅰ、xbalⅰ、sacⅰ、t4连接酶购自takara(大连)有限公司；zeocin、tricine、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、dna分子质量marker、小分子质量蛋白maker购自上海生工生物工程技术服务有限公司；pmd18
‑
t由本实验室保藏；其他试剂为国产分析纯；多核苷酸及dna测序由华大基因完成。
40.实施例1抗菌肽的制备
41.(1)杂合抗菌肽melectin
‑
p基因的克隆
42.在melectin和protonectin的序列、结构分析的基础上，进行杂合优化，选择melectin的8
‑
18位氨基酸与protonectin的3
‑
10位氨基酸进行杂合，获得一种新型的杂合抗菌肽，抗菌肽的具体信息见表1。
43.表1抗菌肽具体信息
[0044][0045]
选用酵母偏爱密码子设计melectin
‑
p杂合肽基因，其基因序列为ggtactattttggga ctgttgaagaaagtgctgccaaaggtcatggctcacatgaaa(seq id no:2)，其编码的氨基酸序列为gtilgllkkvlpkvmahmk(seq id no:1)。在melectin
‑
p杂合肽n端加上α信号肽kex2裂解位点(
‑
glu
‑
lys
‑
arg
‑
)。化学合成具有酵母密码子偏爱性编码基因，并在编码基因5'和3'端分别引入xholⅰ、xbalⅰ酶切位点。应用soe
‑
pcr的方法(两次pcr)合成所需要的目的基因。
[0046]
反应体系(25μl)：10
×
pcr buffer(mg
2+
free)2.5μl，mgcl2(25mmol/l)1.5μl，dntp
(10mmol/l)0.5μl，f1、f2(100pmol/l)各0.5μl，takara ex taqtm 0.25μl，灭菌超纯水19.25μl。混匀，瞬间离心。pcr反应条件：94℃预变性2min，进入pcr循环：94℃30s，退火温度从65℃降至50℃，每循环1min，每一个循环降低0.5℃，72℃1min，共30个循环后温度降至50℃，再在最适退火温度55℃的条件下进行15个循环；最后72℃延伸6min。取产物7.5μl，2％琼脂糖凝胶电泳。
[0047]
(2)重组酵母表达载体的构建和melectin
‑
p的诱导表达
[0048]
经soe合成好的基因经xhoⅰ、xbaⅰ双酶切，定向插入酵母表达载体ppiczα
‑
a中，构建melectin
‑
p重组质粒，缺失酶切位点鉴定阳性的质粒命名为ppiczα
‑
a
‑
melectin
‑
p，送深圳华大基因测序。将测序正确的重组质粒转化酵母菌x
‑
33，重组酵母的电击转化、筛选按invitrogen公司酵母表达操作手册进行，略有改进。将筛选到的阳性酵母菌接种于20ml ypd培养基，30℃，300r/min培养至a600达到3～5，离心收集菌体转接于50ml bmmy培养基中，进行诱导表达。30℃，300r/min培养72h，期间每24h补加终浓度为0.5％(v/v)的甲醇。诱导后，12000r/min离心15min收集培养液上清，进行tricine
‑
sds
‑
page，结果见图1，可以看到，随着发酵时间的延长，2.1kd初条带明显增加，表明发酵产生杂合肽。
[0049]
实施例2重组杂合肽melectin
‑
p最小抑菌浓度(mic)测定
[0050]
本实施例对杂合肽melectin
‑
p同原始抗菌肽melectin、protonectin的抑菌活性进行了比较。其中原始抗菌肽melectin的氨基酸序列为gflsilkkvlpkvmahmk(seq id no:3)；原始抗菌肽protonectin的氨基酸序列为ilgtilgllkgl(seq id no:4)。
[0051]
采用微量肉汤稀释法测定重组melectin
‑
p抑菌活性。0.02％乙酸溶液(含0.4％牛血清白蛋白)稀释重组杂合肽，得到2倍梯度稀释抗菌肽贮存液(2560，1280，
…
，20和10μg/ml)，存放于聚丙烯离心管中。测试菌接种于mha培养基中过夜培养，将测试菌过夜培养物稀释至2
×
105～7
×
105cfu/ml，分别取100μl加到96孔细胞培养板每行1～10号孔，将按梯度稀释抗菌肽10μl对应加到1～9号孔，10号孔不加抗菌肽，作为阳性对照，11号孔加入100μl新鲜mhb培养基作为空白对照，37℃培养18至24h后，用酶标仪测490nm吸光值。吸光度比10号孔低50％以上孔内浓度即定义为对该测试菌最小抑菌浓度mic，其中对杂合肽melectin
‑
p同原始抗菌肽melectin、protonectin的抑菌活性进行了比较，结果见表2。
[0052]
表2杂合抗菌肽的最小抑菌浓度(mic)
[0053][0054]
由表2可知，杂合肽melectin
‑
p对大肠杆菌、肠道沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的mic分别为4.6μg/ml、2.9μg/ml和9.3μg/ml，显著低于原始抗菌肽protonectin和melectin；杂合肽melectin
‑
p对铜绿假单胞菌的mic为5.4μg/ml，显著低于原始抗菌肽protonectin和melectin。杂合肽melectin
‑
p对金黄色葡萄球菌的mic为9.1μg/ml，同样显著低于原始抗菌
肽protonectin和melectin。因此，杂合抗菌肽在抑菌能力方面较原始抗菌肽更优，对常见致病菌具有较好的抑菌活性。
[0055]
实施例3重组杂合肽melectin
‑
p热稳定性和酸碱稳定性检测
[0056]
1)热稳定检测将杂合抗菌肽melectin
‑
p分别煮沸5、10、15、20、25、30、35、40、45min，再以金黄色葡萄球菌为指示剂进行抑菌试验，24h后测量抑菌圈大小，结果见图2，可以看到其抑菌性能非常稳定。
[0057]
2)同时，配置ph 3.0～11.0的缓冲液，分别加入20μl杂合抗菌肽至不同ph缓冲液，以不加抗菌肽的不同ph缓冲液为对照，做抑菌试验，结果见图3，可以看出，无论是在酸性环境还是碱性环境，杂合抗菌肽的抑菌性能基本保持稳定，应用范围广泛。
[0058]
实施例4重组杂合肽melectin
‑
p对仔猪生长性能及腹泻率的影响
[0059]
本实施例分别于试验开始和结束时，晨饲前空腹称重，记录仔猪每天的耗料量及腹泻情况，以重复为单位计算耗料量，并计算各组仔猪平均日增重、平均日采食量、料重比及腹泻率。腹泻率(％)＝试验全期腹泻头次/(试验头数
×
试验天数)
×
100％。
[0060]
实验方法：试验采用单因子试验设计，选用120头28日龄平均体重为(7.06
±
1.12)kg的健康“杜
×
长
×
大”三元杂交断奶仔猪，按照相近体重、公母各半的原则随机分为4组，每组5个重复，每个重复6头猪。具体分组见表3。其中基础饲粮参照nrc(2012)饲养标准配制，其组成及营养水平见表4。
[0061]
表3日粮结构
[0062]
组别日粮结构抗菌肽添加量实验组基础日粮+杂合肽melectin
‑
p0.2％对照组一基础日粮0％对照组二基础日粮+抗菌肽protonectin0.2％对照组三基础日粮+抗菌肽melectin0.2％
[0063]
表4基础日粮组成及营养水平(风干基础)
[0064][0065][0066]
注：预混料为每千克日粮提供：维生素a 10000iu；维生素d
3 3500iu；维生素e 40mg；维生素k
3 3.0mg；维生素b
1 1.5mg；维生素b
2 8.0mg；维生素b
6 4.0mg；维生素b
12 0.025mg；叶酸1.2mg；生物素0.15mg；烟酸50mg；泛酸20mg；铜50mg；铁135mg；锌140mg；锰50mg；硒0.36mg。营养水平为计算值。
[0067]
试验期间严格按照猪场规定，统一进行驱虫。每天饲喂3次，保证每次采食后料槽有少许余料，所有猪仔自由采食和饮水。保持猪舍卫生清洁和空气流通，定期对猪圈进行清扫和消毒。每天观察仔猪情况，记录仔猪的采食、精神状况及有无腹泻。试验期30d。
[0068]
生长性能及腹泻率：分别于试验开始和结束时，晨饲前空腹称重，记录仔猪每天的耗料量及腹泻情况，以重复为单位计算耗料量，并计算各组仔猪平均日增重、平均日采食量、料重比及腹泻率。腹泻率(％)＝试验全期腹泻头次/(试验头数
×
试验天数)
×
100％。
[0069]
结果见表5。
[0070]
表5不同处理组对断奶仔猪生长性能与腹泻率的影响
[0071]
指标实验组对照组一对照组二对照组三平均日增重/(g/d)293.36253.32284.28289.14平均日采食量/(g/d)486.23441.23480.81485.27料重比1.661.741.691.68腹泻率/％2.539.277.256.29
[0072]
由表5可知，与对照组相比，实验组平均日增重提高15.8％，同原始抗菌肽组相比
也分别提升了3.2％和1.46％。
[0073]
与对照组一相比，实验组平均日采食量提高10.2％，同原始抗菌肽组(对照组二、对照组三)相比也分别提升了1.1％和0.2％。
[0074]
与对照组一相比，实验组平均料重比降低4.6％，同原始抗菌肽组(对照组二、对照组三)相比也分别降低了1.8％和1.2％。
[0075]
与对照组一相比，实验组腹泻率降低6.74个百分点，同原始抗菌肽组(对照组二、对照组三)相比也分别降低了4.72％和3.76％。
[0076]
综合来看，杂合肽melectin
‑
p对仔猪平均日增重、平均日采食量、料重比及腹泻率等仔猪生长指标改善显著，且优于原始抗菌肽组。
[0077]
实施例5重组杂合肽melectin
‑
p对血清免疫指标的影响
[0078]
采用elisa试剂盒法测定血清中iga、igg、igm、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
8和tnf
‑
α含量。
[0079]
于实施例4试验结束后，每个重复随机选取2头仔猪，前腔静脉采血10ml置于未加抗凝剂的试管中，放置30min后，4000r/min离心10min，分离血清，分装成2份，
‑
20℃保存。采用elisa试剂盒法测定血清中iga、igg、igm含量。结果见表6。
[0080]
表6抗菌肽对断奶仔猪血清免疫指标的影响
[0081]
指标实验组对照组一对照组二对照组三iga/(mg/ml)564.1525.4557.2546.3igg/(mg/ml)8.207.257.647.58igm/(mg/ml)213.7167.32188.8186.2
[0082]
由表6可知，与对照组一相比，实验组仔猪血清iga含量提升7.36％，同原始抗菌肽组(对照组二、对照组三)相比也分别提升了1.24％和3.25％。
[0083]
与对照组一相比，实验组血清igg含量提升13.1％，同原始抗菌肽组(对照组二、对照组三)相比也分别提升了7.33％和8.18％。
[0084]
与对照组一相比，实验组血清igm含量提升27.72％，同原始抗菌肽组(对照组二、对照组三)相比也分别降低了13.19％和14.77％。
[0085]
综合来看，杂合肽melectin
‑
p对仔猪血清iga、igg、igm含量指标改善显著，且优于原始抗菌肽组。
[0086]
综上所述，本实施例1成功构建了基因工程菌p.pastoris x
‑
33/ppiczα
‑
a
‑
melectin
‑
p，杂合肽具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有不同程度的抑菌活性。在仔猪日粮中添加杂合抗菌肽melectin
‑
p可提升仔猪平均日增重、提升平均日采食量、降低料重比并降低断奶仔猪腹泻率，同时提高机体免疫指标。使其在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显示很好的应用前景。
[0087]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。