一种羰基还原酶突变体及其应用的制作方法

本发明属于生物催化合成领域，涉及一种羰基还原酶突变体及其应用。

背景技术：

1、含有手性氨基醇类结构的化合物具有多样的生物活性，被广泛应用于医药化工领域，如用于治疗帕金森病和低血压症的屈西多巴，具有广谱的抗菌活性的氯霉素，兽药氟苯尼考和甲砜霉素，口服戈谢病治疗药物依利格鲁司他和其他具有抗炎抗感染抗肿瘤等活性的临床候选药物。其中，1949年上市的氯霉素作为广谱抗生素，全球的产量主要集中在中国，国内生产规模约在3000吨。但随着环保标准的不断提高以及处理三废(废水、废气、废固)成本越来越高，现有的生产工艺已经难以满足发展的要求。因此迫切需要一条更加绿色经济环保的工艺路线，去解决现有生产工艺存在的环保问题。本实验室中国专利申请公开文本cn111808893a中使用羰基还原酶介导的动态动力学拆分还原的生物催化方法，能够有效解决氯霉素现有生产工艺中存在的高污染、高能耗、低效率、低质量等问题。因此工业界迫切需要一个更加高效且稳定的羰基还原酶，用于合成氯霉素和其他手性氨基醇类药物。

2、

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中羰基还原酶突变体的活性较低的缺陷，提供一种羰基还原酶突变体及其应用。本发明的羰基还原酶突变体相对于野生型羰基还原酶具有更高的酶活性，可用于催化如式ⅰ所示化合物发生羰基还原反应

2、本发明提供了一种羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体的突变位点包括如seq id no:1所示的氨基酸序列的第88位、第142位、第190位和第193位。

3、本发明中，较佳地，所述羰基还原酶突变体的突变位点还包括选自如seq id no:1所示的氨基酸序列的第82位、第121位、第138位、第192位、第201位、第204位、第206位和第207位中的一位或多位。

4、本发明中，更佳地，所述羰基还原酶突变体的突变位点还包括还选自如seq idno:1所示的氨基酸序列的第82位、第121位、第138位、第192位、第201位、第204位、第206位和第207位中的至少3位。

5、本发明中，较佳地，所述羰基还原酶突变体的突变位点，所述羰基还原酶突变体的突变位点选自以下任一组：

6、(1)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如seq id no:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位和第193位；

7、(2)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如seq id no:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位和第201位；

8、(3)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如seq id no:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第204位和第206位；

9、(4)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如seq id no:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第206位和第207；

10、(5)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如seq id no:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第201位、第206位和第207位；

11、(6)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如seq id no:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第192位、第193位、第204位和第206位；

12、(7)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如seq id no:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第201位和第204位。

13、本发明中，较佳地，所述第82位的氨基酸残基由w突变为l。

14、本发明中，较佳地，所述第88位的氨基酸残基由f突变为v、i或s，例如i或v。

15、本发明中，较佳地，所述第121位的氨基酸残基由v突变为a。

16、本发明中，较佳地，所述第138位的氨基酸残基由a突变为v或l，例如l。

17、本发明中，较佳地，所述第142位的氨基酸残基由r突变为m、f、h或l，例如m。

18、本发明中，较佳地，所述第190位的氨基酸残基由a突变为v。

19、本发明中，较佳地，所述第192位的氨基酸残基由r突变为m。

20、本发明中，较佳地，所述第193位的氨基酸残基由s突变为a。

21、本发明中，较佳地，所述第201位的氨基酸残基由y突变为f。

22、本发明中，较佳地，所述第204位的氨基酸残基由n突变为a或g，例如a。本发明中，较佳地，所述第206位的氨基酸残基由k突变为h。

23、本发明中，较佳地，所述第207位的氨基酸残基由k突变为n。

24、本发明中，所述羰基还原酶突变体的突变位点和种类如下表1所示：

25、表1

26、

27、

28、本发明还提供一种如式ii所示化合物的制备方法，其包括如下步骤：在液态反应体系中，如式i所示化合物在辅酶和前述羰基还原酶突变体存在下，进行如下式所示的还原反应即可；

29、

30、r1为h、或苄基；

31、r1-1为c1-c6烷基或苄基；

32、r2为h、或苄基；

33、r2-1为c1-c6烷基或苄基；

34、r3为其中r3-1为c1-c6烷基；

35、r4为h、no2、卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基或c1-c6烷基取代的磺酰基。

36、本发明中，较佳地，所述卤素为f、cl、br或i。

37、本发明中，较佳地，所述c1-c6烷基为c1-c4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基。

38、本发明中，较佳地，r1为h、

39、本发明中，较佳地，r2为h、

40、本发明中，较佳地，r4为h、no2、f、cl、br、i、甲基、甲氧基或

41、本发明中，较佳地，r3为

42、本发明中，更佳地，r1为h、r2为r3为r4为f、cl或br。

43、本发明中，较佳地，所述如式i所示化合物为

44、本发明中，较佳地，所述如式ii所示化合物为

45、本发明中，所述辅酶可为本领域常规的辅酶，较佳地，所述辅酶为还原性辅酶和/或氧化性辅酶。所述氧化性辅酶优选为nad+和/或nadp+；所述还原性辅酶优选为nadh和/或nadph。

46、本发明中，所述辅酶的用量可为本领域辅酶的常规用量，较佳地，所述辅酶与所述如式i所示化合物的质量比为1:(1-100)；较佳地为1:(50-100)；例如1:100或1:75。

47、本发明中，所述液态反应体系可为本领域常规的适于羰基还原酶反应的液态反应体系，较佳地，所述液态反应体系包括用于辅酶再生的酶和用于辅酶再生的共底物。所述用于辅酶再生的酶优选为醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶中的一种或多种；例如葡萄糖脱氢酶。所述共底物优选为异丙醇、葡萄糖和甲酸铵中的一种或多种，例如葡萄糖。

48、本发明中，所述液态反应体系中，所述共底物的用量可为本领域常规用量，较佳地，所述共底物在所述液态反应体系中的质量浓度为5-30％，更佳地为5％-20％；例如16％、8％或12％。

49、本发明中，所述液态反应体系中，所述用于辅酶再生的酶的用量可为本领域常规用量，较佳地，所述用于辅酶再生的酶在所述液态反应体系中的质量浓度为1-10％；更佳地为1％-5％；例如2.5％、1.6％或2.3％。

50、本发明中，所述还原反应的反应温度可为本领域常规的反应温度，较佳地为10℃-50℃，更佳地为25℃-35℃，例如30℃。

51、本发明中，所述还原反应的反应时间与反应温度及反应规模相关，较佳地为0.1-72小时，更佳地为3-24小时。

52、本发明中，所述还原反应的ph可为本领域常规的ph，较佳地为6-10，更佳地为7.0-9.0，例如7.5-8.0。

53、本发明中，所述羰基还原酶突变体以本领域常规的形式加入所述还原反应中，较佳地为游离形式的酶、固定化酶、菌粉或菌体形式的酶，更佳地为菌体形式的酶。

54、本发明中，所述液态反应体系还包括缓冲液例如磷酸缓冲液。所述磷酸缓冲液优选为0.1m的磷酸盐缓冲液。所述磷酸缓冲液用于调控所述液态反应体系的ph。

55、本发明中，所述液态反应体系还包括助溶剂。所述助溶剂可为本领域常规的助溶剂；较佳地选自二甲基亚砜、异丙醇和甲苯中的一种或多种，更佳地为二甲基亚砜。

56、本发明中，所述助溶剂的用量可为本领域常规用量，较佳地，所述助溶剂在所述液态反应体系中的质量浓度为10％-50％；更佳地为20％-30％；例如30％、29％或28％。

57、本发明中，所述还原反应结束后，还包括后处理步骤。

58、本发明中，所述后处理步骤为本领域常规的后处理步骤，较佳地，所述后处理步骤包括：向前述液态反应体系中加入有机溶剂，加热、过滤菌体、萃取，有机相水洗、干燥和过滤浓缩有机层得如式ii所示化合物。

59、本发明中，所述有机溶剂可为本领域常规的有机溶剂，较佳地为酯类溶剂、醚类溶剂、醇类溶剂、芳烃类溶剂或氯代烷烃类溶剂。所述酯类溶剂优选为乙酸乙酯或乙酸异丙脂。所述醚类溶剂优选为甲基叔丁基醚或2-甲基四氢呋喃。所述醇类溶剂优选为正丁醇。所述芳烃类溶剂优选为甲苯。所述氯代烷烃类溶剂优选为二氯甲烷。

60、本发明中，所述加热的温度以使蛋白变性为准，较佳地为60℃。

61、本发明中，所述加热的时间以使蛋白变性为准，较佳地为1h。

62、本发明中，所述水洗中的水包括纯水和含无机盐的水；例如纯水和/或5％食盐水。

63、本发明中，所述干燥的按照方式可采用本领域常规干燥方法，较佳地为使用干燥剂干燥；所述干燥剂优选为无水硫酸钠。

64、更佳地，所述后处理步骤包括：向前述还原反应的反应液中加入甲叔醚或乙酸乙酯、加热、过滤菌体和萃取，有机相纯水洗、5％食盐水洗、无水硫酸钠干燥和过滤浓缩有机层得如式ii所示化合物。

65、本发明还提供一种如前所述羰基还原酶突变体在还原羰基中的应用。

66、本发明中，较佳地，所述应用的反应底物和反应条件如前所述的如式ii所示化合物的制备方法中的反应底物和反应条件。

67、术语

68、对映体过量(ee，enantiomeric excess)：通常用来表征手性分子中一个对映异构体相对于另一个对映异构体的过量值。

69、非对映体过量(de，diastereomeric excess)：通常用来表征两个及以上手性中心的分子中一个非对映体相对于另一个非对映体的过量值。

70、异构体含量(ic，isomeric content):通常用来表征两个及以上手性中心的分子中一个异构体占所有异构体总量的百分数。

71、(r，s)-羰基还原酶

72、在本发明中，“立体选择性羰基还原酶”指能够立体选择性不对称催化还原潜手性酮为手性醇的酶。

73、典型地，在本发明中，所述立体选择性羰基还原酶优选为(r，s)-羰基还原酶，立体选择性定义为对映体过量(ee)≥80％，非对映体过量(de)≥80％。

74、同理当(r，r)-羰基还原酶时，立体选择性定义为对映体过量(ee)≥80％，非对映体过量(de)≥80％，依此类推。

75、辅酶

76、本发明中，“辅酶”是指能够实现氧化还原反应中电子传递的辅酶。

77、助溶剂

78、本发明中，可以在反应体系中添加或不添加助溶剂。

79、如本文所用，术语“助溶剂”是指难溶性物质与加入的第三种物质在溶剂中形成可溶性分子间的络合物、缔合物或复盐等，以增加难溶性物质在溶剂中的溶解度。这种第三种物质称为助溶剂。

80、动态还原动力学拆分反应原理

81、通过羰基还原酶立体选择性的还原单一构型的潜手性酮(如r-构型)的同时，另一构型的潜手性酮(如s-构型)通过羰基的烯醇互变，实现α-位手性构型的消旋化，还原与消旋化在同一反应条件下进行，实现高效构建含两个手性中心仲醇的目的。

82、

83、典型地，本发明中通过筛选获得仅识别ⅰ-s(s构型化合物ⅰ)的羰基还原酶，对羰基进行立体选择性的还原获得手性羟基，而不被识别的ⅰ-r(r构型化合物ⅰ)通过消旋化转化为ⅰ-s，消旋与还原过程衔接推进，以此转化，理论上便可100％的获得所需手性产物。通过羰基还原酶对潜手性羰基底物进行还原，同时经烯醇互变消旋，两者巧妙结合，一步反应高效经济构建两个手性中心，表现了良好的应用开发前景。

84、在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

85、本发明所用试剂和原料均市售可得。

86、本发明的积极进步效果在于：

87、本发明的羰基还原酶突变体相对于野生型羰基还原酶具有更高的酶活性。其中部分羰基还原酶突变体的酶活性是野生型羰基的50倍。本发明的羰基还原酶突变体可应用于催化如式ⅰ所示化合物发生羰基还原反应。

88、本发明提供的制备方法能以转化率>99％，手性ee值>99％，手性de值>99％制备得到如式ⅰⅰ所示化合物。本发明的制备方法具有绿色、环保和经济的特点。