鉴定文心兰品种的CAPS分子标记、筛选方法与应用

鉴定文心兰品种的caps分子标记、筛选方法与应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地说是涉及一种鉴定文心兰品种的caps分子标记及其筛选方法与应用。


背景技术：

2.文心兰(oncidium)又名舞女兰、吉祥兰，属兰科(orchidaceae)树兰亚科(epidendroideae)文心兰属(oncidium)植物，原产于热带及亚热带美洲，因其花姿独特、花形优美、花色艳丽，是世界重要的盆切两用花卉，具有较高的观赏与经济价值。目前，文心兰属植物的原生种多达750种以上，而市场上流通的文心兰品种多为杂交种，品种间亲缘关系十分复杂；此外，文心兰生长周期长，亲缘关系相近品种间的农艺性状差异小，仅依靠传统形态学手段难以实现种质的区分，增加了新品种选育和遗传改良的难度。因此，采取有效的遗传种质分析方法可为文心兰品种鉴定和遗传多样性分析提供更加可靠科学依据。
3.酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence，caps)检测是一种将pcr扩增和酶切反应相结合，以区分dna水平遗传多态性的分子标记检测技术，具有位点特异性、操作简单和成本低等特点，广泛应用于图位克隆、基因分型和品种鉴定等领域。但是，被发现的突变的酶切位点数量太少，限制了其开发应用。本课题组前期通过对文心兰不同品种的转录组测序，发现了大量的snp位点属于酶切位点突变，这为在文心兰中实现开发利用caps标记奠定了基础。
4.目前，分子标记技术已广泛应用于文心兰遗传多样性分析、亲缘关系等研究上，例如issr(inter
‑
simple sequence repeat)分子标记和srap(sequence
‑
related amplifiedpolymorphism)分子标记已被开发利用，但关于文心兰caps标记的开发，未见有关文献报道。鉴于caps分子标记的优点及其在文心兰开发应用上的空白，开展该研究是十分必要的。
5.因此，如何提供一种鉴定文心兰品种的caps分子标记是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种鉴定文心兰品种的caps分子标记及应用；该分子标记基于文心兰的snp位点中酶切位点的差异筛选得出，筛选得到的caps分子标记可以特异性鉴别文心兰的品种，为文心兰的遗传多样性分析提供了基础。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种鉴定文心兰品种的caps分子标记，包括seq id no.1～seq id no.12所示的序列；
9.tcttttcggckccaaggcca，如seq id no.1所示；其中，k为t或g；
10.atgggactaarcttcagaag，如seq id no.2所示；其中，r为g或a；
11.ctttagtgaaktccttaatt，如seq id no.3所示；其中，k为g或t；
12.cgaggcgtygacgccgagca，如seq id no.4所示；其中，y为t或c；
13.ggtattctagckgagattct，如seq id no.5所示；其中，k为t或g；
14.aataaatgaagcyttttct，如seq id no.6所示；其中，y为c或t；
15.ctagaggatgygcagaattt，如seq id no.7所示；其中，y为t或c；
16.cgtttgaagctwatcactac，如seq id no.8所示；其中，w为a或t；
17.tggagcattcgayatcacat，如seq id no.9所示；其中，y为t或c；
18.agctgatgcayatggttgca，如seq id no.10所示；其中，y为c或t
19.tttatgcttbtagattgga，如seq id no.11所示；其中，b为c或g；
20.tcatttgtvcatatagaaga，如seq id no.12所示；其中，v为a或g。
21.一种鉴定文心兰品种的caps分子标记的筛选方法，包括下述步骤：
22.1)基于文心兰6个品种的转录组数据获得snp位点，并寻找可引起限制性内切酶识别位点改变的snp位点，根据snp位点的不同设计caps引物对；
23.2)提取文心兰的基因组dna；
24.3)以所述caps引物对文心兰不同品种基因组dna进行pcr扩增，获得目的片段；
25.4)以限制性内切酶对所述目的片段进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和酶切产物多态性分析，如果品种间存在酶切产物多态性，则该snp位点可作为鉴定文心兰品种的caps标记。
26.作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，所述caps引物对如seq id no.13～seq id no.58所示。
27.作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，所述pcr反应体系为：
[0028][0029]
所述pcr反应程序为：
[0030][0031]
作为本发明优选的技术方案，步骤4)中，所述酶切反应体系：
[0032][0033]
酶切条件为37℃酶切50min。
[0034]
seq id no.1～seq id no.12所述的caps分子标记在鉴定文心兰品种中的应用。
[0035]
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种鉴定文心兰品种的caps分子标记及应用，为文心兰的遗传多样性分析提供了基础，弥补了文心兰caps分子标记缺乏的不足。
附图说明
[0036]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0037]
图1附图为caps3、caps4
‑
1、caps7分子标记引物在37份文心兰材料中的pcr产物电泳图；1：1号；2：白梦香；3：罗曼香；4：门神；5：香吉士；6：红梦香(红心)；7：304；8：花猫；9：607；10：316；11：黄金天使；12：309；13：蜜糖；14：562；15：豹斑；16：307；17：金辉；18：249；19：253；20：小樱桃；21：红梦香(黄心)；22：252；23：粉梦香；24：月下美人；
[0038]
图2附图为6个限制性内切酶对37个文心兰材料的酶切产物电泳图；15：豹斑；16：307；17：金辉；18：249；19：253；20：小樱桃；21：红梦香(黄心)；22：252；23：粉梦香；24：月下美人；25：满天星(黄)；26：满天星(米黄)；27：柠檬黄(变异)；28：柠檬黄；29：254；
[0039]
图3附图为基于11对caps分子标记构建的37份文心兰品种的upgma聚类图。
具体实施方式
[0040]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0041]
本发明使用的供试材料均来自于福建省农业科学院作物研究所兰花资源圃，供试材料见表1。
[0042]
表1供试文心兰材料
[0043]
[0044][0045]
实施例1
[0046]
步骤一文心兰品种snp位点的挖掘及caps引物设计
[0047]
(1)对文心兰
‘
金辉’、
‘
香水’、
‘
粉梦香’、
‘
红梦香’、
‘
黄梦香’和
‘
白梦香’进行转录组测序。通过samtools和picard
‑
tools等工具对比对结果进行染色体坐标排序、去掉重复的reads等处理，最后通过变异检测软件gatk2进行snp calling，并对原始结果进行过滤(过滤掉质量值小于30，距离小于5的snp)，得到snp信息。
[0048]
(2)在文心兰转录组序列中，寻找与花色素生物合成和花香生物合成相关基因的unigene中snp位点，将snp位点上下游各30bp的序列复制于在线酶切识别软件dcaps find 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)中寻找可引起限制性内切酶识别位点改变的snp位点，利用primer 5软件设计caps引物，引物设计的主要原则是：引物长度为20bp左右；退火温度为50℃
‑
60℃；gc含量为40
‑
60％；上下游引物退火温度差原则上不超过3℃，尽量避免引物发夹结构及自身配对。共设计23对引物，如表2，引物名称caps1
‑
11为花色相关基因引物。caps12
‑
20为花香相关基因引物；引物由福州白鲸生物科技有限公司合成。
[0049]
表2
[0050]
[0051]
[0052]
[0053][0054]
步骤二利用上述caps引物对文心兰品种的鉴定
[0055]
(一)dna的提取
[0056]
(1)dna提取缓冲液：2％ctab，0.1m
·
l
‑1tris
‑
hcl(ph8.0)，0.02m
·
l
‑1edta，1.4m
·
l
‑1nacl；121℃高压灭菌20min。
[0057]
(2)分别加入适量文心兰幼嫩叶片和1粒直径5mm钢珠于2ml离心管中，置于液氮中冷却10min，取出离心管置于预冷的振荡研磨仪(频率30hz，1min)中使其破碎成粉末；加入800μl ctab提取液(65℃预热)，放入65℃水浴30min，每10min混匀一次；加入等体积的核酸提取液，混匀，12000r
·
min
‑1离心20min；吸取上清液于新的1.5ml离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，并于
‑
20℃沉淀dna 2h；12000r
·
min
‑1离心5min，加入75％乙醇洗涤沉淀2次；加入80μlddh2o溶解dna，经紫外分光光度计检测其纯度和浓度，将dna浓度调制200ng
·
l
‑1备用。
[0058]
(二)pcr扩增及酶切反应
[0059]
(1)pcr扩增
[0060]
a.30μlpcr反应体系：采用延伸速度快、特异性高的premix taq
tm
(ex taq
tm version 2.0)酶(宝日医生物技术有限公司)进行扩增
[0061]2×
premix extaqbuffer 15μl、上游引物1μl、下游引物1μl、dna模板1μl，补充去离子水至30μl。
[0062]
b.pcr反应程序：
[0063]
95℃预变性3min；98℃变性10sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，34个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
[0064]
c.1％琼脂糖凝胶电泳检测：
[0065]
取5μl上述扩增产物，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，拍照记录结果(图1)。
[0066]
从23对引物中筛选出扩增结果稳定、条带特异的引物共15对，caps2、caps3、caps4
‑
1、caps4
‑
2、caps6、caps7、caps8、caps10、caps11、caps12、caps15
‑
2、caps16、caps17、caps18和caps20
‑
1作为候选的caps分子标记引物对。
[0067]
(2)酶切反应
[0068]
a.20μl酶切体系：采用quickcut限制酶(宝日医生物技术有限公司)进行酶切反应
[0069]
10
×
quickcutbuffer 2μl，pcr扩增产物15μl，限制性内切酶1μl，补充去离子水至20μl。37℃酶切50min。
[0070]
b.酶切产物电泳检测：
[0071]
取20μl酶切产物，利用3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切扩增产物，拍照记录结果用于后续分析。
[0072]
通过对上述15对候选caps引物的酶切产物的分型检测，最终筛选到11对多态性的caps分子标记和引物对，见表3；包含了12个遗传多态性位点。引物caps3、caps4
‑
1、caps7、caps15
‑
2、caps16和caps17对37份文心兰品种的酶切产物电泳检测图，见图3。
[0073]
表3
[0074][0075][0076]
步骤三7份不同文心兰品种指纹图谱的构建和聚类分析
[0077]
利用上述11对caps引物对37份文心兰材料进行pcr扩增和酶切，对酶切产物进行电泳分型检测。统计各样品酶切后产生的dna条带数，按酶切条带有带记为
‘1’
，无带则记为
‘0’
的方法，形成不同文心兰品种的caps指纹图谱。利用ntsys
‑
pc软件中不加权成组配对法(upgma)进行
‘
1、0’数据系统聚类，对37份文心兰品种进行遗传多样性分析，获得供试材料的聚类图(图3)。
[0078]
利用11对snp
‑
caps标记(12个snp位点)可以将37份文心兰材料分为24个类型，其中6个类型中包括2
‑
5个材料，选其一为代表与另外18个类型的材料绘制了24份文心兰品种的指纹图谱(表4)。以标记引物caps7为例，文心兰品种编号1、3、5、8、9、10、15、17、18、22、23、24、26、27、29、30、33、34、36、37的指纹信息为111；文心兰品种编号4、7、35的指纹信息为100；文心兰品种编号20、25的指纹信息为011。可以看出caps7标记引物在37份文心兰品种中酶切出3种不同的等位基因型，且caps7是文心兰品种编号20和25的特征引物；
[0079]
利用ntsys
‑
pc软件中upgma法生成的聚类图(图3)所示，11对引物(12个多态性位点)可以很好地将37个文心兰品种区分为2大类，第i类群包括31个品种，主要以有香小花型的盆花品种为主；第ii类群包括6个品种，除
‘
蜜糖’外，其余均为无香中花型的切花品种
‘
南茜’的变种，花色以不同程度黄色为主。当遗传系数为0.76时，第i类群的品种可进一步区分为3大类，其中
‘
豹斑’和
‘
小樱桃’各成一类，豹斑’花以紫红色、白色等复合色为主，花朵大、数量少且无花香，
‘
小樱桃’花色为樱桃红，花朵无光泽，欠质感，具有淡香。以上结果说明这
11对引物适用于文心兰种质资源遗传多样性分析中。
[0080]
表4
[0081][0082]
[0083][0084]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0085]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。