抗PD-L1抗体及其应用的制作方法

no:16所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
16.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:1所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:7所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
17.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:1所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:8所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
18.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:1所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:9所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
19.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:1所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:10所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
20.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:1所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:11所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
21.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:1所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:12所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
22.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:1所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:13所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
23.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:1所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:14所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
24.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:1所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:15所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
25.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:2所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:16所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
26.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:3所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:16所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
27.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:4所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:16所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
28.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:5所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:16所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:17所示的氨基酸序列。
29.在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:6所示的氨基酸序列，hcdr2包含seq id no:16所示的氨基酸序列，hcdr3包含seq id no:18所示的氨基酸序列。
30.一些实施方案中提供了抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合pd-l1，并且包含：
31.(a)hcdr1，其包含x
15
x
16
x
17
x
18
x
19
dswih所示氨基酸序列，x
15
为g、s或n，x
16
为f、w、l或s，x
17
为t、s、a、r或h，x
18
为f、l、t或p，x
19
为s、k、r或a；和/或
32.(b)hcdr2，其包含gwispyggstyyadx
20
x
21
x
22
x
23
，x
20
为s、d、h、g、p或y，x
21
为v、f、l、m或y，x
22
为k、r、g、s、v或h，x
23
为g、h、d、q、s或a；和/或
33.(c)hcdr3，其包含rhwpggx
24
x
25
x
26
，x
24
为f或l，x
25
为d或l，x
26
为y或p；和/或
34.(d)lcdr1，其包含x1asqx2ix3x4x5lx6，x1为l、q或r，x2为d、t或g，x3为g或s，x4为k、t、或s，x5为h、w、f或y，x6为n或a；和/或
35.(e)lcdr2，其包含x7asx8lx9x
10
，x7为a或g，x8为t、n、s或r，x9为q或k，x
10
为s或t；和/
或
36.(f)lcdr3，其包含qqx
11
x
12
x
13
tpx
14
t，x
11
为y或s，x
12
为y或f，x
13
为s或t，x
14
为r或y。
37.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合pd-l1，并且包含：
38.(a)hcdr1，其包含x
15
x
16
x
17
x
18
x
19
dswih所示氨基酸序列，x
15
为g、s或n，x
16
为f、w、l或s，x
17
为t、s、a、r或h，x
18
为f、l、t或p，x
19
为s、k、r或a；
39.(b)hcdr2，其包含gwispyggstyyadx
20
x
21
x
22
x
23
，x
20
为s、d、h、g、p或y，x
21
为v、f、l、m或y，x
22
为k、r、g、s、v或h，x
23
为g、h、d、q、s或a；
40.(c)hcdr3，其包含rhwpggx
24
x
25
x
26
，x
24
为f或l，x
25
为d或l，x
26
为y或p；
41.(d)lcdr1，其包含x1asqx2ix3x4x5lx6，x1为l、q或r，x2为d、t或g，x3为g或s，x4为k、t、或s，x5为h、w、f或y，x6为n或a；
42.(e)lcdr2，其包含x7asx8lx9x
10
，x7为a或g，x8为t、n、s或r，x9为q或k，x
10
为s或t；和
43.(f)lcdr3，其包含qqx
11
x
12
x
13
tpx
14
t，x
11
为y或s，x
12
为y或f，x
13
为s或t，x
14
为r或y。
44.在一些实施方案中，lcdr1包含seq id no:19-23中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。在一些实施方案中，lcdr2包含seq id no:24-27中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。在一些实施方案中，lcdr3包含seq id no:28-31中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。在一些实施方案中，所述取代变体为保守氨基酸取代变体。
45.在一些实施方案中，lcdr1包含seq id no:19所示的氨基酸序列，lcdr2包含seq id no:24所示的氨基酸序列，lcdr3包含seq id no:28所示的氨基酸序列。
46.在一些实施方案中，lcdr1包含seq id no:20所示的氨基酸序列，lcdr2包含seq id no:25所示的氨基酸序列，lcdr3包含seq id no:29所示的氨基酸序列。
47.在一些实施方案中，lcdr1包含seq id no:21所示的氨基酸序列，lcdr2包含seq id no:26所示的氨基酸序列，lcdr3包含seq id no:30所示的氨基酸序列。
48.在一些实施方案中，lcdr1包含seq id no:22所示的氨基酸序列，lcdr2包含seq id no:27所示的氨基酸序列，lcdr3包含seq id no:31所示的氨基酸序列。
49.在一些实施方案中，lcdr1包含seq id no:23所示的氨基酸序列，lcdr2包含seq id no:26所示的氨基酸序列，lcdr3包含seq id no:30所示的氨基酸序列。
50.在一些实施方案中，lcdr1包含seq id no:19所示的氨基酸序列，lcdr2包含seq id no:26所示的氨基酸序列，lcdr3包含seq id no:31所示的氨基酸序列。
51.一些实施方案中提供了抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合pd-l1，并且包含：(a)hcdr1，其包含seq id no:1-6中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(b)hcdr2，其包含seq id no:7-16中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(c)hcdr3，其包含seq id no:17或18所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(d)lcdr1，其包含seq id no:19-23中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(e)lcdr2，其包含seq id no:24-27中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(f)lcdr3，其包含seq id no:28-31中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。
52.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合pd-l1，所述抗体或抗原
结合片段至少包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:16所示的hcdr2、如seq id no:17所示的hcdr3、如seq id no:19-23中任一项所示的lcdr1、如seq id no:24-27中任一项所示的lcdr2、如seq id no:28-31中任一项所示的lcdr3中的一个、二个、三个、四个、五个或全部。
53.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异结合pd-l1，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:16所示的hcdr2、如seq id no:17所示的hcdr3、如seq id no:19所示的lcdr1、如seq id no:24所示的lcdr2和如seq id no:28所示的lcdr3。
54.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异结合pd-l1，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:16所示的hcdr2、如seq id no:17所示的hcdr3、如seq id no:20所示的lcdr1、如seq id no:25所示的lcdr2和如seq id no:29所示的lcdr3。
55.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异结合pd-l1，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:16所示的hcdr2、如seq id no:17所示的hcdr3、如seq id no:21所示的lcdr1、如seq id no:26所示的lcdr2和如seq id no:30所示的lcdr3。
56.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异结合pd-l1，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:16所示的hcdr2、如seq id no:17所示的hcdr3、如seq id no:22所示的lcdr1、如seq id no:27所示的lcdr2和如seq id no:31所示的lcdr3。
57.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异结合pd-l1，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:16所示的hcdr2、如seq id no:17所示的hcdr3、如seq id no:23所示的lcdr1、如seq id no:26所示的lcdr2和如seq id no:30所示的lcdr3。
58.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异结合pd-l1，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:16所示的hcdr2、如seq id no:17所示的hcdr3、如seq id no:19所示的lcdr1、seq id no:26所示的lcdr2和如seq id no:31所示的lcdr3。
59.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异结合pd-l1，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:7所示的hcdr2、如seq id no:17所示的hcdr3、如seq id no:19所示的lcdr1、如seq id no:24所示的lcdr2和如seq id no:28所示的lcdr3。
60.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异结合pd-l1，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:8所示的hcdr2、如seq id no:17所示的hcdr3、如seq id no:19所示的lcdr1、如seq id no:24所示的lcdr2和如seq id no:28所示的lcdr3。
61.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异结合pd-l1，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:9所示的hcdr2、如seq id no:17所示的hcdr3、如seq id no:19所示的lcdr1、如seq id no:24所示的lcdr2和如seq id no:28
所示的lcdr3。
62.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异结合pd-l1，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:10所示的hcdr2、如seq id no:17所示的hcdr3、如seq id no:19所示的lcdr1、如seq id no:24所示的lcdr2和如seq id no:28所示的lcdr3。
63.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异结合pd-l1，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:11所示的hcdr2、如seq id no:17所示的hcdr3、如seq id no:19所示的lcdr1、如seq id no:24所示的lcdr2和如seq id no:28所示的lcdr3。
64.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链还包括fr1、fr2、fr3、fr4，其中重链fr1包含如seq id no:32所示的序列，与seq id no:32所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:32所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
65.所述抗体或抗原结合片段的重链fr2包含如seq id no:33所示的序列，与seq id no:33所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:33所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
66.所述抗体或抗原结合片段的重链fr3包含如seq id no:34所示的序列，与seq id no:34所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:34所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
67.所述抗体或抗原结合片段的重链fr4包含如seq id no:35所示的序列，与seq id no:35所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:35所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
68.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链fr1包含如seq id no:32所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的重链fr2包含如seq id no:33所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的重链fr3包含如seq id no:34所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的重链fr4包含如seq id no:35所示的序列。
69.在一些实施方案中，所述重链可变区(vh)包含结构fr1-hcdr1-fr2-hcdr2-fr3-hcdr3-fr4。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:36-50中任一项所示的序列，与seq id no:36-50中任一项所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:36-50中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
70.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链还包括fr1、fr2、fr3、fr4，其中轻链fr1包含如seq id no:51-56中任一项所示的序列，与seq id no:51-56中任一项所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:51-56中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
71.所述抗体或抗原结合片段的轻链fr2包含如seq id no:57-60中任一项所示的序列，与seq id no:57-60中任一项所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:57-60中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
72.所述抗体或抗原结合片段的轻链fr3包含如seq id no:61-64中任一项所示的序
列，与seq id no:61-64中任一项所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:61-64中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
73.所述抗体或抗原结合片段的轻链fr4包含如seq id no:65-67中任一项所示的序列，与seq id no:65-67中任一项所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:65-67中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
74.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr1包含如seq id no:51所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr2包含如seq id no:57所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr3包含如seq id no:61所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr4包含如seq id no:65所示的序列。
75.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr1包含如seq id no:52所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr2包含如seq id no:58所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr3包含如seq id no:62所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr4包含如seq id no:66所示的序列。
76.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr1包含如seq id no:53所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr2包含如seq id no:59所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr3包含如seq id no:63所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr4包含如seq id no:67所示的序列。
77.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr1包含如seq id no:54所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr2包含如seq id no:60所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr3包含如seq id no:64所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr4包含如seq id no:67所示的序列。
78.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr1包含如seq id no:55所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr2包含如seq id no:59所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr3包含如seq id no:63所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr4包含如seq id no:67所示的序列。
79.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr1包含如seq id no:56所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr2包含如seq id no:57所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr3包含如seq id no:61所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链fr4包含如seq id no:67所示的序列。
80.在一些实施方案中，所述轻链可变区(vl)包含结构fr1-lcdr1-fr2-lcdr2-fr3-lcdr3-fr4。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:68-73中任一项所示的序列，与seq id no:68-73中任一项所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:68-73中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
81.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:36-50中任一项所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:68-73中任一项所示的序列。
82.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:36所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:68所示的序列。
83.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:36所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:69所示的序列。
84.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:36所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:70所示的序列。
85.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:36所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:71所示的序列。
86.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:36所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:72所示的序列。
87.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:36所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:73所示的序列。
88.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:37所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:68所示的序列。
89.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:38所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:68所示的序列。
90.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:39所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:68所示的序列。
91.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:40所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:68所示的序列。
92.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:41所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:68所示的序列。
93.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、fc区或其组合。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其片段是igg、igm、iga、ige或igd其中一种同种型。在一些实施方案中，同种型是igg1、igg2、igg3或igg4。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人源化抗体。
94.在一些实施方案中，fc是变体fc区。在一些实施方案中，相对于亲本fc区，变体fc区具有一个或多个氨基酸修饰，如取代、缺失或插入。在一些实施方案中，相对于亲本fc区活性，fc区的氨基酸修饰改变了效应功能活性。在一些实施方案中，变体fc区可以具有改变的(即，增加的或降低的)抗体依赖性细胞毒性(adcc)、补体介导的细胞毒性(cdc)、吞噬作用、调理作用或细胞结合。在一些实施方案中，相对于亲本fc区，fc区氨基酸修饰可以改变变体fc区对fcγr(fcγ受体)的亲和力。在一些实施方案中，所述fc区来源于igg1或igg4。在一些实施方案中，fc区突变是n297a。
95.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为分离的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为scfv、fab、f(ab)2或igg1。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体。
96.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含氨基酸序列如seq id no:74或75所示的序列，或与seq id no:74或75所述序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:74或75所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
97.所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含氨基酸序列如seq id no:76所示的序列，或与seq id no:76所述序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:76所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
98.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含氨基酸序列如seq id no:74所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含氨基酸序列如seq id no:76所示的序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含氨基酸序列如seq id no:75所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含氨基酸序列如seq id no:76所示的序列。
99.在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77-91中任一项所示的序列，与seq id no:77-91中任一项所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:77-91中任一项所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
100.所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92-97中任一项所示的序列，与seq id no:92-97中任一项所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:92-97中任一项所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
101.在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。
102.在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:93所示的序列。
103.在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:94所示的序列。
104.在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:95所示的序列。
105.在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:96所示的序列。
106.在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:97所示的序列。
107.在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:78所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。
108.在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:79所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。
109.在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:80所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。
110.在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:81所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。
111.在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:82所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。
112.在一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体或多特异性抗体或抗原结合片段(例如双特异性抗体或抗原结合片段)。
113.在一些实施方案中，所述抗体具有两条相同的重链和两条相同的轻链，fc区配对形成二硫键。
114.在一个实施方案中，所述抗体片段(抗原结合片段)为fab、fv或scfv抗体。
115.本发明还提供了一种编码所述的抗体或抗原结合片段的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子为分离的核酸分子。
116.本发明还提供了一种包含所述的核酸分子的载体。在一些实施方案中，所述载体为分离的载体。在一些实施方案中，包含所述核酸分子的载体为核酸片段、质粒、噬菌体或病毒。
117.本发明还提供了一种包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为分离的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为cho细胞、hek细胞(如hek293f细胞)、bhk细胞、cos1细胞、cos7细胞、cv1细胞或鼠l细胞。
118.本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述的抗体或抗原结合片段，以及药学上可接受的辅料。
119.本发明还提供了治疗方法和用途。在一些实施方案中，提供了用于治疗或改善t细胞功能障碍病症的方法，所述方法包括向患者施用有效剂量的所述抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，提供了所述抗体或抗原结合片段在用于治疗或改善t细胞功能障碍病症中的应用。在一些实施方案中，提供了所述抗体或抗原结合片段在制备用于治疗或改善t细胞功能障碍的药物中的应用。
120.在一些实施方案中，所述t细胞功能障碍病症包括但不限于由细菌、病毒、真菌或原生动物导致的感染，以及癌症和肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症和肿瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、唾液腺癌、胃癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、头癌、颈癌和胰腺癌。
121.本发明还提供了诊断方法和用途。在一些实施方案中，提供了检测样品中pd-l1表达的方法，使样品与所述抗体或抗原结合片段进行接触，使得所述抗体或抗原结合片段结合pd-l1，并检测其结合，即样品中pd-l1的含量。在一些实施方案中，提供了所述抗体或抗原结合片段在制备用于诊断或预后癌症或肿瘤试剂盒中的应用。在一些实施方案中，提供了一种包含所述抗体或抗原结合片段的诊断或预后试剂盒。
122.本发明提供了抗pd-l1抗体或抗原结合片段及其应用，本发明抗体或抗原结合片段可以特异性结合pd-l1，阻断pd-1与pd-l1之间的相互作用，有助于免疫系统清除肿瘤细胞。本发明抗体或抗原结合片段可以用于治疗或改善t细胞功能障碍病症，也可以用于癌症或肿瘤的诊断和预后。
附图说明
123.图1显示抗pd-l1抗体阻断pd-1/pd-l1相互作用；图1a和1b中，纵坐标表示荧光值(相对光单位)，横坐标表示浓度。
124.图2显示抗pd-l1抗体与过量表达pd-l1的细胞的结合；其中，纵坐标表示平均荧光强度，横坐标表示浓度，isotype表示阴性对照抗体igg-isotype。
125.图3a显示抗体对肿瘤体积的影响。
126.图3b显示抗体对肿瘤重量的影响。
127.图3c显示抗体对小鼠体重的影响。
128.图4采用流式细胞术检测抗pd-l1的scfv与pd-l1-his-biotin的结合情况。
129.术语
130.除非另作说明，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。
131.定义
132.应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
133.本文所用的术语“包含”或“包括”意味着组合物和方法等包括所列举的元素，例如组份或步骤，但不排除其它。“基本上由
……
组成”意味着组合物和方法排除对组合的特征有根本影响的其它元素，但不排除对组合物或方法无本质上影响的元素。“由
……
组成”意味着排除未特别列举的元素。
134.术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的氨基酸单体构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得，它可能以包括化学合成的任何方式产生。
[0135]“氨基酸”是指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如α-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。天然氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：ala，一字母代码：a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)和缬氨酸(val，v)。
[0136]“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似的侧链(r基团)的氨基酸残基所取代。一般而言，保守氨基酸取代不大会在实质上改变蛋白质的功能性质。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括：1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸。
[0137]“框架区fr1、fr2、fr3和fr4的保守氨基酸取代”的氨基酸数目为约1个、约2个、约3个、约4个或约5个保守氨基酸取代。“vl、vh的保守氨基酸取代”的氨基酸数目为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。“重链恒定
区、轻链恒定区、重链或轻链的保守氨基酸取代”的氨基酸数目为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个、约18个、约19个、约22个、约24个、约25个、约29个、约31个、约35个、约38个、约41个、约45个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。
[0138]
本发明中关于细胞、核酸、多肽、抗体等所使用的术语“分离的”，例如“分离的”dna、rna、多肽、抗体是指分别于细胞天然环境中的其它组分如dna或rna中的一种或多种所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组dna技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。分离的多肽、抗体等通常通过至少一个纯化步骤制备。在一些实施方案中，分离的核酸、多肽、抗体等的纯度至少为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。
[0139]
术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。
[0140]“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。
[0141]
在一些实施方案中，“至少80％同一性”为约80％同一性、约81％同一性、约82％同一性、约83％同一性、约85％同一性、约86％同一性、约87％同一性、约88％同一性、约90％同一性、约91％同一性、约92％同一性、约94％同一性、约95％同一性、约98％同一性、约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。
[0142]
在一些实施方案中，“至少90％同一性”为约90％同一性、约91％同一性、约92％同一性、约93％同一性、约95％同一性、约96％同一性、约97％同一性、约98％同一性、约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。
[0143]
多聚核苷酸或多聚核苷酸序列(或多肽或抗体序列)与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“同一性或序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用目测或本领域已知的软件程序来确定该比对和同一性百分比或序列同一性，比如ausubel et al.eds.(2007)在current protocols in molecular biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的blast，例如blastn和blastp，两者使用下列默认参数：geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；matrix＝blosum62；descriptions＝50sequences；sortby＝highscore；databases＝non-redundant；genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcdstranslations+swi ssprotein+spupdate+pir。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同一性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。
[0144]
多聚核苷酸是由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)，或当多聚核苷酸是rna时胸腺嘧啶换为尿嘧啶(u)。“多聚核苷酸序列”可
以以多聚核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。
[0145]
术语“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是不受限制的多聚核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、核糖酶、cdna、dsrna、sirna、mirna、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多聚核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
[0146]
术语“编码”应用于多聚核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多聚核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。
[0147]“抗体”、“抗原结合片段”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。抗体和抗原结合片段包括但不局限重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(cdr)、重链可变区(vh)、轻链可变区(vl)、重链恒定区(ch)、轻链恒定区(cl)、框架区(fr)或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。cdr区包括轻链的cdr区(lcdr1-3)和重链的cdr区(hcdr1-3)。抗体及抗原结合片段可以特异性识别和结合一个或多个(如两个)抗原的多肽或多肽复合物。特异性识别和结合多个(如两个)抗原的抗体或抗原结合片段可以被称为多特异性(如双特异性)抗体或抗原结合片段。
[0148]
术语“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的一部分，本发明抗体片段的组成形式可类似于单特异性抗体片段中的f(ab’)2、f(ab)2、fab'、fab、fv、scfv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗原结合片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
[0149]“单链可变片段”或“scfv”是指免疫球蛋白的重链(vh)和轻链(vl)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接vh的n端和vl的c端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。scfv分子通常是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。
[0150]
术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为igg、igm、iga、igg或ige。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、igg5等已被充分表征并且赋予的功能特
异性也已知。所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。在一些实施方案中，免疫球蛋白分子为igg种类。这四条链通过二硫键以“y”构型连接，其中轻链从“y”口开始并延续通过可变区包围重链。
[0151]
本发明公开的抗体、抗原结合片段或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、全人源、人源化、灵长类化、嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段(例如fab、fab'和f(ab')2)、scfv。
[0152]
轻链可以分为kappa(κ)或lambda(λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤，b细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从y构型的叉状末端的n末端延伸至每条链底部的c末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为v
λ
。
[0153]
轻链(vl)和重链(vh)链部分的可变区决定了抗原识别和特异性。轻链和重链的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。n端部分是可变区，c端部分是恒定区；ch3和cl结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
[0154]
在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“cdr”是形成抗原结合结构域的短的、非连续的与抗原特异性结合的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“构架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。构架区大部分采用β-折叠构象，cdr形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使cdr定位在正确的方位上。具有特定位置的cdr的抗原结合域形成了与抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其抗原表位的非共价结合。对于给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以通过已知方法鉴定出包含cdr和框架区的氨基酸(参见kabat,e.,et al.,u.s.department of health and human services,sequences of proteins of immunological interest,(1983)和chothia and lesk,j.mol.biol.,196:901-917(1987))。
[0155]
在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括所有这些含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“cdr”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在kabat et al.,u.s.dept.of health and human services，，,，，，sequences of proteins of immunological interest(1983)和chothia等在j.mol.biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过引用全部并入本文。
[0156]
根据kabat和chothia定义的cdr包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的cdr都在本发明范围内。包含特定cdr的确切残基编号将根据cdr的序列和大小而变化。本领域技术人员通常可以根据抗体的可变区氨基酸序列确定出cdr包含哪些特定的残基。
[0157]
kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以不依赖于序列本身以外的其他实验数据将该“kabat编号”系统应用到任何可变区序列。“kabat编号”是指由kabat et al.,u.s.dept.of health and human services在“sequence of proteinsof immunological interest”(1983)提出的编号系统。抗体还可以用eu或chothia编号系统。
[0158]
本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施方案中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。
[0159]
重链恒定区包括ch1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、ch2结构域、ch3结构域，或变体或片段中的至少一种。抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自igg1分子的ch1结构域和源自igg3分子的铰链区。在另一实施方案中，重链恒定区可以包括部分源自igg1分子和部分源自igg3分子的铰链区。在另一实施方案中，部分重链可以包括部分源自igg1分子和部分源自igg4分子的嵌合铰链区。
[0160]“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的一部分氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。“轻链-重链对”是指可通过轻链的cl结构域和重链的ch1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
[0161]“vh结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，“ch1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(大部分氨基末端)恒定区。ch2结构域不与其它结构域紧密配对，而是在完整的天然igg分子的两个ch2结构域之间插入两个n-连接的分支碳水化合物链。还有文献记载，ch3结构域从ch2结构域开始延伸到igg分子的c-末端，大约包含108个残基。“铰链区”包括连接ch1结构域和ch2结构域的部分重链区域。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个n端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(roux et al.,j.immunol 161:4083(1998))。
[0162]“二硫键”指两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸的硫醇基团可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接。在大多数天然存在的igg分子中，ch1和cl区通过二硫键连接。
[0163]“嵌合抗体”指其可变区从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。某些实施方案中，可变区来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区来自人源。
[0164]“特异性结合”或“对
……
具有特异性”通常是指抗体或抗原结合片段与特定抗原通过其抗原结合结构域与表位互补性结合形成相对稳定的复合物。“特异性”可以用抗体或抗原结合片段与特定抗原或表位结合的相对亲和力表达。例如，如果抗体“a”比抗体“b”与同一抗原的相对亲和力大，可以认为抗体“a”比抗体“b”对该抗原具有更高的特异性。特异性结合可以用平衡解离常数(kd)来描述，较小的kd意味着较紧密的结合。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振、生物膜层光学干涉测量法等。“特异性结合”抗原a的抗体包括与抗原a平衡解离常数kd小于或等于约100nm、小于或等于约10nm、小于或等于约5nm、小于或等于约1nm的抗体。
[0165]“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防、减缓、改善或停止不良的生理改变或紊乱，例如疾病的进程，包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善、缓和、减轻或消失(无论是部分还是全部)、延长与不接受治疗时预期的生存期限等。需要治疗的患者包括已经患有病症或紊乱的患者，容易患有病症或紊乱的
患者，或者需要预防该病症或紊乱的患者，可以或预期从施用本发明公开的抗体或药物组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的患者。
[0166]“患者”指需要诊断、预后或治疗的任何哺乳动物，包括人类、狗、猫、兔子、鼠、马、牛等。
[0167]“约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”指所描述的数值以及其
±
10％、
±
5％或
±
1％的范围。
[0168]“ec
50”即半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,ec
50
)是指能引起50％最大效应的浓度。
[0169]
本发明中“亲本fc区”可以为天然存在的fc区，编码fc区的基因可来自人、鼠、兔、骆驼、猴子，优选为人和小鼠；例如，亲本fc区为seq id no:77或78中fc区。
[0170]
本文提及出版物的相关描述均通过引用全部并入本文
[0171]
抗pd-l1抗体
[0172]
本发明提供了对pd-l1蛋白具有高亲和力的抗体或抗原结合片段。筛选出的抗体表现出有效的结合活性、生物学活性，并可用于治疗和诊断用途。比如，这些抗体或抗原结合片段可以有效阻断抑制性的免疫检查点，激活淋巴细胞释放细胞因子，用于治疗各种类型的癌症、肿瘤或感染等相关疾病。
[0173]
在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列如seq id no:77中除fc以外的序列，所述抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。
[0174]
在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:93所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列如seq id no:77中除fc以外的序列，所述抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列如seq id no:93所示的序列。
[0175]
在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:94所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列如seq id no:77中除fc以外的序列，所述抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列如seq id no:94所示的序列。
[0176]
在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:95所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列如seq id no:77中除fc以外的序列，所述抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列如seq id no:95所示的序列。
[0177]
在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:96所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列如seq id no:77中除fc以外的序列，所述抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列如seq id no:96所示的序列。
[0178]
在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:97所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列如seq id no:77中除fc以外的序列，所述抗原结合片
段的轻链包含氨基酸序列如seq id no:97所示的序列。
[0179]
在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:78所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列如seq id no:78中除fc以外的序列，所述抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。
[0180]
在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:79所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列如seq id no:79中除fc以外的序列，所述抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。
[0181]
在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:80所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列如seq id no:80中除fc以外的序列，所述抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。
[0182]
在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:81所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列如seq id no:81中除fc以外的序列，所述抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。
[0183]
在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:82所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列如seq id no:82中除fc以外的序列，所述抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列如seq id no:92所示的序列。
[0184]
在一些实施方案中，本发明抗体含有两条相同的重链(或重链片段)和两条相同的轻链(或轻链片段)。
[0185]
本领域普通技术人员还应当理解，本发明所公开抗体或抗原结合片段序列是可以被替换的，替换后其氨基酸序列不同于该抗体的天然存在的氨基酸序列。例如，替换后的氨基酸序列可以是与起始序列相似的，比如与起始序列具有一定比例的同一性，比如它可以与起始序列的同一性是约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。
[0186]
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列具有一个或多个修饰基团。例如，本发明公开的抗体或抗原结合片段可以包含有韧性的接头序列，或者可以被修饰以添加功能性基团(例如peg、药物、毒素或标签)。
[0187]
本发明公开的抗体、抗原结合片段包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体或抗原结合片段的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体或抗原结合片段与表位结合。包括但不限制以下实例，抗体或抗原结合片段可以被糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
[0188]
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以与治疗剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或peg缀合。
[0189]
抗体或抗原结合片段可通过将其偶联至化学发光化合物来被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光从而确定化学发光标记的抗体或抗原结合片段的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
[0190]
抗体和编码抗体的多聚核苷酸的制备方法
[0191]
本发明还公开了编码本发明所述抗体、抗原结合片段、及其衍生物的多聚核苷酸或核酸分子。本发明公开的多聚核苷酸可以编码重链可变区、轻链可变区、fc区、部分重链可变区、部分轻链可变区、重链或轻链等。制备抗体的方法是本领域公知的并且在本发明中有所描述。
[0192]
在某些实施方案中，制备的抗体不会在待治疗的动物(例如人类)中引起有害的免疫应答。在一些实施方案中，本发明公开的抗体、抗原结合片段、或衍生物使用本领域公认的技术修饰以降低其免疫原性。例如，抗体可以被人源化、灵长类化、去免疫化或者可以制备嵌合抗体。这些类型的抗体来源于非人抗体，通常是鼠类或灵长类抗体，其保留或基本保留亲本抗体的抗原结合特性但在人体中免疫原性较低。其可以通过多种方法来实现，包括(a)将整个非人源的可变区移植到人源的恒定区以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(cdr)的至少一部分移植到人源的框架和恒定区中，保留或不保留关键的框架残基；或(c)移植整个非人源的可变区，但通过用类人源的部分置换表面残基从而“隐藏”它们。通常人框架区中的框架残基将被来自cdr供体抗体的相应残基取代，比如能够改善抗原结合的残基。这些框架替换可以通过本领域公知的方法鉴定，例如通过模拟cdr和框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合起重要作用的框架残基和通过序列对比以鉴定特定位置上异常的框架残基。(参考美国专利5,585,089；riechmann et al.,nature 332:323(1988)；其全部内容通过引用并入本文)。可以使用本领域公知的多种技术使抗体人源化，例如cdr移植(ep 239,400；wo 91/09967；美国专利5,225,539,5,530,101和5,585,089)，修复或者表面重排(ep592,106；ep519,596；padlan,et al.,molecular immunology 28(4/5):489-498(1991)；studnicka et al.,protein engineering 7(6):805-814(1994)；roguska,et al.,proc.natl.sci.usa 91:969-973(1994))，以及链的重排(美国专利5,565,332)，其全部内容通过引用并入本文。
[0193]
去免疫化也可用于降低抗体的免疫原性。在本发明中，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰t细胞表位(参见例如wo/9852976a1和wo/0034317a2)。例如，分析来自起始抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列，并产生来自每个可变区的人t细胞表位“图谱”，显示表位相对于互补决定区(cdrs)和序列内其它关键残基的位置。分析来自t细胞表位图的单个t细胞表位，以鉴定具有较低改变抗体活性风险的可选择的氨基酸取代。设计包含氨基酸取代组合的一系列可选的重链可变区序列和轻链可变区序列，随后将这些序列掺入到一系列结合多肽中。然后将包含修饰过的可变区和人类恒定区的完整重链和轻链的基因克隆到表达载体中，随后将质粒转入细胞系以产生完整的抗体。然后利用合适的生物化学和生物学实验中比较抗体，鉴定出最佳的抗体。
[0194]
本发明公开的抗体或抗原结合片段的结合特异性可以通过体外实验，例如免疫共沉淀、放射免疫实验(ria)或酶联免疫吸附实验(elisa)来检测。
[0195]
scfv的制备可参见生产单链单元的技术(美国专利4,694,778；bird,science242:
423-442(1988)、huston et al.,proc.natl.acad.sci.usa 55:5879-5883(1988)和ward et al.,nature 334:544-554(1989)和nie et al.,antibody therapeutics 3(1):18-62(2020))。通过氨基酸桥接fv区的重链和轻链片段形成单链单元，产生单链融合肽。也可以使用在大肠杆菌中组装功能性fv片段的技术(skerra et al.,science 242:1038-1041(1988))。
[0196]
可用于生产单链fv(scfv)和抗体的技术的实例包括如美国专利4,946,778和5,258,498，以及huston et al.,methods in enzymology 203:46-88(1991)、shu et al.,proc.natl.sci.usa 90:1995-1999(1993)和skerra et al.,science 240:1038-1040(1988)中所述。对于包括在人体内使用抗体和体外检测实验的某些用途，可以使用嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物物种的一类分子，例如具有鼠源单克隆抗体的可变区和人源免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见morrison,science 229:1202(1985)；oi et al.,biotechniques 4:214(1986)；gillies et al.,j.immunol.methods 125:191-202(1989)；neuberger et al.,nature372:604-608(1984)；takeda et al.,nature 314:452-454(1985)；和美国专利5,807,715、4,816,567和4,816,397，其全部内容通过引用并入本文。
[0197]
此外，在newman,biotechnology 10:1455-1460(1992)中公开了另一种生产重组抗体的高效方法，特别地，该技术能产生含有猴可变区和人恒定区序列的灵长类抗体，该参考文献的全部内容通过引用并入本文。此外，该技术也在美国专利5,658,570、5,693,780和5,756,096中有所提及，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
[0198]
抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来自免疫球蛋白序列的抗体文库进行的噬菌体展示方法。也可参考美国专利4,444,887和4,716,111，以及pct公布文本wo 98/46645、wo 98/50433、wo 98/24893、wo 98/16654、wo 96/34096、wo 96/33735和wo 91/10741，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
[0199]
在另一实施方案中，使用常规方法(例如使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以分离编码所需单克隆抗体的dna并对其进行测序。分离的和亚克隆的杂交瘤细胞可以作为此类dna的来源。一旦分离出来，dna可以被置于表达载体中，然后被转染到原核或真核宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或不产生其他免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中。分离的dna(如本文所述可以是合成的)也可用于制备抗体的恒定区和可变区的序列，如美国专利5,658,570中所述，其全部内容通过引用并入本文。该方法从所选细胞中提取rna并转化成cdna，然后使用ig特异性引物通过pcr技术进行扩增。适于此目的的合适的探针在美国专利5,658,570中也有所提及。
[0200]
此外，使用常规重组dna技术，可将本发明的抗体的一个或多个cdr插入框架区，例如插入到人类框架区以构建人源化非全人源抗体。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人类框架区(参见chothia et al.,j.mol.biol.278:457-479(1998)，其列出一系列人类框架区)。一些多核苷酸可以编码框架区和cdr组合产生的与目标抗原的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内可以进行一个或多个氨基酸取代，可以选择能够改善抗体与其抗原结合的氨基酸取代。另外，可用此法进行参与链间二硫键形成的一个或多个可变区中半胱氨酸残基的取代或缺失，从而产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。本领域技术范围内的对多核苷酸进行的其他改变也涵盖于本发明中。
[0201]
抗体可以通过使用常规重组dna技术制备。使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体的载体及细胞系等。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如recombinant dna technology for production of protein therapeutics in cultured mammalian cells，d.l.hacker,f.m.wurm,in reference module in life sciences,2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。
[0202]
在一些实施方案中，可以按常规方法根据本文所述抗体氨基酸序列设计合成编码抗体的dna，将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生单克隆抗体。在一些实施方案中，表达抗体载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polya尾。其他元件包括增强子，kozak序列及插入序列两侧rna剪接的供体和受体位点。可以通过sv40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如rsv、htlv1、hivi及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pires1neo，pretro-off，pretro-on，plxsn，或者plncx，pcdna3.1(+/-)，pcdna/zeo(+/-)，pcdna3.1/hygro(+/-)，psvl，pmsg，prsvcat，psv2dhfr，pbc12mi和pcs2等。常使用的哺乳动物细胞包括293细胞，cos1细胞，cos7细胞，cv1细胞，鼠l细胞和cho细胞等。
[0203]
在一些实施方案中，插入基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶，谷氨酰胺合成酶，新霉素抗性，潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到无上述基因的宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。
[0204]
此外，可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本发明所述抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点突变和pcr介导的突变。变体(包括衍生物)编码相对于原重链可变区和轻链可变区来说少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的替换、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代或少于2个氨基酸的取代。或者可以沿着全部或部分编码序列时随机引入突变，例如通过饱和突变，以及可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。
[0205]
治疗方法
[0206]
本发明还提供了治疗方法和用途。在一些实施方案中，提供了用于治疗或改善各种类型的癌症、肿瘤或感染等相关疾病的方法，所述方法包括向患者施用有效剂量的抗pd-l1抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，提供了抗pd-l1抗体或抗原结合片段在用于治疗或改善癌症、肿瘤或感染等相关疾病中的应用。在一些实施方案中，提供了所述抗pd-l1抗体或抗原结合片段在制备用于治疗或改善癌症、肿瘤或感染等相关疾病的药物中的应用。
[0207]
对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定抗体或衍生物、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄频率、药物组合，以及所治疗的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所述剂量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度以及所需的效果。所用剂量可以通过本领域熟知
的药理学和药代动力学原理确定。
[0208]
抗体或衍生物的施用方法包括但不限于真皮内、肌肉、腹腔、静脉、皮下、鼻腔、硬脊膜外和口服注射。药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，含有本发明抗体或抗原结合片段的药物组合物可以口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾给药。
[0209]
本发明使用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。
[0210]
施用方式可以是全身施用或局部施用。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的抗体引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管连接到如贮液囊(可以是ommaya贮液囊)来辅助注射。也可以通过肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及使用雾化的制剂。
[0211]
本发明抗体可以局部施用于需要治疗的区域；可以通过但不限于以下方式：手术期间局部输注，例如与手术后伤口敷料联合的局部应用，通过注射，通过导管，借助栓剂或借助植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜(例如硅橡胶膜)或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。
[0212]
在一些实施方案中，本发明组合物包含编码抗体的核酸或多聚核苷酸，可以通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分来体内施用所述核酸以促进其编码的蛋白质的表达，然后通过下述方式施用上述部分载体使其变为胞内部分，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；biolistic，dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或者通过与已知进入细胞核的同源异型盒类肽连接施用(参见例如joliot et al.,1991,proc.natl.acad.sci.usa88:1864-1868)等等。可选地，核酸可以通过同源重组在引入细胞内并整合至宿主细胞dna中用于表达。
[0213]
在一些实施方案中，本发明抗体施用于患者的剂量为0.01mg/kg至100mg/kg患者体重，或0.1mg/kg至20mg/kg患者的体重。在初始剂量之后可随后给予第二剂或多剂该抗体或抗原结合片段，其剂量与初始剂量大致相同或较少，其中该随后的剂量可相隔至少1天至3天；或至少一星期。可以通过例如脂质化等修饰来增强抗体的摄取和组织穿透能力(例如进入脑内)，从而减少本发明抗体的施用的剂量和频率。
[0214]
各种已知输送系统可用于施用本发明抗体或衍生物或编码其的多核苷酸，例如包封于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如wu and wu,1987,j.biol.chem.262:4429-4432)、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。
[0215]
联合疗法
[0216]
在一些实施方案中，本发明抗pd-l1抗体或抗原结合片段可以结合其它治疗或预防方案，包括施用一种或多种本发明抗体或抗原结合片段以及一种或多种其它治疗剂或方法一起使用或组合使用。在一些实施方案中，其他治疗方案包括但不限于放射疗法、化学疗
法、激素疗法等。对于组合治疗，抗体可以与其它治疗剂可同时或分开施用。当分开施用时，可以在施用另一种其它治疗剂之前或之后施用本发明抗体。
[0217]
在一些实施方案中，本发明抗体与化疗剂组合施用。在一些实施方案中，可与本发明抗体一起施用的化疗剂包括但不限于抗生素衍生物(例如阿霉素、博来霉素、柔红霉素和放线菌素d)、抗雌激素药(如他莫昔芬)、抗代谢物(如氟尿嘧啶、5-fu、甲氨蝶呤、氟尿苷、干扰素α-2b、谷氨酸、光神霉素、巯基嘌呤和6-硫基鸟嘌呤)、细胞毒性剂(如卡莫司汀、bcnu、洛莫司汀、ccnu、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、甲基苄肼、丝裂霉素、白消安、顺铂和硫酸长春新碱)、激素(如甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸钠、炔雌醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲睾酮、己烯雌酚二磷酸、氯烯雌醚和睾内酯)、氮芥衍生物(例美法仑、苯丁酸氮芥、二氯甲基二乙铵(氮芥)和噻替哌)、类固醇及其组合(如倍他米松磷酸钠)，以及其它化合物(如氮烯唑胺、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱和依托泊苷)。在一些实施方案中，本发明抗体与细胞因子联合施用。可以与本发明抗体一起施用的细胞因子包括但不限于il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-10、il-12、il-13、和il-15等。
[0218]
在一些实施方案中，本发明抗pd-l1抗体与化疗剂联合施用。化疗剂的实例包括免疫治疗剂，包括但不限于适用于治疗患者的治疗性抗体。治疗性抗体的一些实例包利妥昔单抗、曲妥珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、阿来组单抗、依帕珠单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗和贝伦妥单抗等。
[0219]
药物组合物
[0220]
本发明还提供了药物组合物。这样的组合物包含有效剂量的抗pd-l1抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的辅料。在一些实施方案中，药物组合物包含0.1％-90％的抗pd-l1抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，药物组合物还包含抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂)。
[0221]
在一些实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由政府的监管机构批准的或公认药典中列出的用于动物，特别是用于人类的物质。此外，“药学上可接受的辅料”通常指是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂等。
[0222]
术语“辅料”是指可以与活性成分一起施用于患者的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸，以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖也是可以预见的。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在e.w.martin的remington's pharmaceutical sciences中有描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体或抗原结合片段，优选以纯化后的形式，连同合适数量的辅料，以提供适合于
患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。亲本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
[0223]
在一些实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。用于静脉内给药的组合物通常是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。
[0224]
本发明的化合物可以配制成中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括衍生自如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的与阴离子形成的盐，以及衍生自如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的与阳离子形成的盐。
具体实施方式
[0225]
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
[0226]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0227]
抗pd-l1抗体
[0228]
实施例1抗体制备方法
[0229]
抗体实例相关的氨基酸和核酸序列见表1-13，抗体的重链、轻链组成见表1；表11中重链的fc区用下划线标出，表13中可变区的核酸序列用下划线标出。
[0230]
将抗体的重链和轻链的氨基酸序列依照宿主细胞密码子偏好性特点进行序列优化，得到重链和轻链的dna序列。为了便于在宿主细胞中表达，分别在重链和轻链的序列中添加了信号肽。
[0231]
将优化并合成的序列克隆分别克隆至载体(载体可选pcdna3.1
tm
(+)，invitrogen，货号为v79020)中，然后分别抽提大量质粒，重链和轻链按质粒摩尔比1:1瞬时表达转染hek293f细胞。以抗体l1-r2-4-46为例，将重链核酸序列(seq id no:99)和轻链核酸序列(seq id no:101)通过酶切克隆至表达载体中；其中，重链信号肽的核酸序列为seq id no:102，轻链信号肽的核酸序列为seq id no:103。以抗体l1-r2-4-71为例，将重链核酸序列(seq id no:100)和轻链核酸序列(seq id no:101)通过酶切克隆至表达载体中；其中，重链信号肽的核酸序列为seq id no:102，轻链信号肽的核酸序列为seq id no:103。细胞表达后培养液经由固定化金属亲和层析(imac)采用protein a柱(ge healthcare)纯化分泌的含两条重链和两条轻链的抗体蛋白，使抗体的纯度＞95％，测序结果与预计的序列相同，用于亲和力检测和生物活性鉴定。
[0232]
表1抗体的组成
[0233]
抗体编号重链seq id no(序列号)轻链序列号l1-r2-47792l1-r2-67793
l1-r2-187794l1-r2-787795l1-r2-857796l1-r2-897797l1-r2-4-367892l1-r2-4-467992l1-r2-4-478092l1-r2-4-558192l1-r2-4-718292
[0234]
表2抗体重链cdr区
[0235][0236]
表3抗体重链cdr区的组成
[0237]
[0238][0239]
表4抗体轻链cdr区
[0240][0241]
表5抗体轻链cdr区的组成
[0242]
名称lcdr1的序列号lcdr2的序列号lcdr3的序列号r2-4192428r2-6202529r2-18212630r2-78222731r2-85232630r2-89192631
[0243]
表6抗体轻链框架区
[0244]
[0245][0246]
表7抗体重链框架区
[0247][0248]
表8抗体重链可变区
[0249]
[0250][0251]
表9抗体轻链可变区
[0252][0253]
表10抗体恒定区
[0254][0255]
表11抗体重链序列
[0256]
[0257]
[0258]
[0259]
[0260][0261]
表12抗体轻链序列
[0262][0263]
表13抗体相关核酸序列
[0264]
[0265][0266]
实施例2解离常数测定
[0267]
采用biacore系统(ge公司)通过动力学结合测定法确定本发明上述抗体结合相应抗原的平衡解离常数(kd)。按照使用手册的方法，将5μg的抗原蛋白pd-l1-his固定到芯片上，以最高浓度为100nm(按照1:2稀释，5个梯度)的抗pd-l1抗体为流动相，进行亲和力测定，并用biacore t200 evaluation software分析结果。其中，阳性对照为ate抗体(ate抗体的氨基酸序列与atezolizumab是一致的，其由hek293f细胞表达)。
[0268]
pd-l1-his抗原制备：在人pd-l1细胞外结构域(ecd)蛋白质的c-末端添加8
×
his标签构建成pd-l1重组蛋白，人pd-l1的ecd区通过基因合成并亚克隆到哺乳动物的表达载体(如pcdna3.1(+)表达载体)中。在瞬时转染hek293f细胞之后，获得基于镍的固定化金属亲和层析纯化(ge healthcare)的pd-l1-his抗原。人pd-l1细胞外结构域(ecd)的氨基酸序列为：mrifavfifmtywhllnaftvtvpkdlyvveygsnm tieckfpvekqldlaalivywemedkniiqfvhgeedlkvqhssyrqrarllkdqlslgnaalqitdvklqdagvyrcmisyggadykritvkvnapynkinqrilvvdpvtseheltcqaegypkaeviwtssdhqvlsgkttttnskreeklfnvtstlrintttneifyctfrrldpeenhtaelvipelplahppner(seq id no:98)。
[0269]
1)如表14所示，与ate抗体相比，本发明抗体l1-r2-4、l1-r2-18、l1-r2-78和l1-r2-89对pd-l1抗原的亲和力基本接近。
[0270]
表14抗体的解离常数
[0271]
[0272][0273]
2)如表15所示，与ate抗体相比，本发明抗体l1-r2-4-36、l1-r2-4-46、l1-r2-4-47、l1-r2-4-55和l1-r2-4-71对pd-l1抗原的亲和力更高。
[0274]
表15抗体的解离常数
[0275]
抗体编号kd(m)l1-r2-4-363.41e-10l1-r2-4-462.82e-10l1-r2-4-472.90e-10l1-r2-4-553.71e-10l1-r2-4-712.82e-10ate1.84e-09
[0276]
实施例3抗pd-l1抗体活性的检测
[0277]
抗pd-1/pd-l1抗体能够通过阻断pd-1和pd-l1的结合，从而解除对下游nfat信号通路的抑制作用。采用promega公司提供的moa(mechanisms of action，moa)检测系统(pd-1/pd-l1 blockade bioassay，propagation model，catalog j1252)，根据说明书提供的方法，通过检测荧光报告基因的表达反应出nfat信号的激活情况，从而检测抗体对pd-1/pd-l1结合的抑制作用。其中，阴性对照抗体igg-isotype购自北京义翘神州科技股份有限公司(目录号：hg1k)。
[0278]
活性检测前一天铺种cho-pd-l1细胞(来自上述moa检测系统)：铺cho-pd-l1前1-2天传代，丢弃培养上清，用无菌pbs洗一遍细胞。加入适量trypsin(gibco)于37℃、5％co2培养箱中消化3-5min。加入新鲜培养基终止消化，转移细胞至50ml离心管并计数。取所需体积细胞，900rpm离心5min。加入dmem-f12培养基(gibco)，重悬细胞至4
×
105个细胞/ml。将细胞加入96孔白色细胞培养板(corning)，100μl/孔。细胞于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。
[0279]
检测当天处理jurkat-pd1细胞(来自上述moa检测系统)：计数后取所需体积细胞，900rpm离心5min。用测定缓冲液(1640培养基(gibco)+1％fbs)重悬细胞至1.25
×
106个细胞/ml，待用。将cho-pd-l1细胞培养板中的培养基上清，吸弃95μl/孔，加入40μl/孔的测试样品(上述抗pd-l1抗体、ate抗体或阴性对照hg1k抗体，最高浓度为20μg/ml，2倍稀释在测定缓冲液中，总共9个梯度)，再加入40μl jurkat-pd1细胞，轻微震荡混匀，放置于37℃、5％co2培养箱中培养6小时。检测：提前将one-glo
tm luciferase assay system(购自promega，e6120)融化。6小时后，加入one-glo
tm
试剂，50μl/孔。室温放置5-10min，读数。
[0280]
1)如图1a所示，本实施例的抗pd-l1抗体(l1-r2-4、l1-r2-6、l1-r2-18、l1-r2-78、l1-r2-85和l1-r2-89)均可有效阻断pd1/pd-l1的相互作用；其中，l1-r2-4抗体具有较强的
阻断活性。
[0281]
2)如图1b所示，本发明抗体l1-r2-4-36、l1-r2-4-46、l1-r2-4-47、l1-r2-4-55和l1-r2-4-71均可以有效阻断pd1/pd-l1的相互作用；与对照抗体ate相比，抗体(l1-r2-4-36和l1-r2-4-46)具有更强的阻断活性。
[0282]
实施例4抗pd-l1抗体结合力的检测
[0283]
通过流式细胞术检测本发明抗pd-l1抗体与过量表达人pd-l1的cho细胞的结合。试验步骤为：将cho-pd-l1细胞(来自上述moa检测系统)与不同稀释浓度的抗体混匀(抗体最高工作浓度为20nm，稀释比例为1:2，稀释11个梯度)，冰上孵育1h；用pbs洗涤细胞两次，再加入pe标记的抗人fc抗体(jackson immunoresearch)荧光二抗，冰上避光孵育30分钟；pbs洗涤细胞两次后，再用pbs重悬细胞，通过facs检测抗体与细胞的结合。
[0284]
如图2所示，本发明抗pd-l1抗体(l1-r2-4-36、l1-r2-4-46、l1-r2-4-47、l1-r2-4-55和l1-r2-4-71)均能结合cho细胞上过表达的人pd-l1。
[0285]
实施例5抗肿瘤作用
[0286]
实验小鼠：雌性c57bl/6小鼠(5-8周龄)(江苏集萃药康生物科技有限公司)。实验细胞：收集对数生长期的小鼠结肠癌细胞mc38，去除培养液并用pbs洗两次后接种；接种量：1
×
106/100μl/只；接种位置：右侧腹部区域位置。分组给药：当肿瘤平均体积在50-100mm3，对荷瘤小鼠进行随机分组；入组标准：肿瘤体积cv值小于30％；接种当天定义为d0天，并于分组当天，根据实验方案设计开始给药。给药剂量和给药方式如表16所示。细胞接种后，每周常规监测肿瘤对动物正常行为的影响。具体内容：实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。试验过程中观察到的临床症状均记录在原始数据中。开始给药后，每周称量体重两次。每周测量瘤体积两次，瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm3)＝0.5
×
肿瘤长径
×
肿瘤短径2。监测至35天后结束。接种后第35天计算相对肿瘤抑制率(tgi％)，计算公式如下：tgi％＝(1-治疗组平均相对肿瘤体积/溶媒组平均相对肿瘤体积)
×
100％。
[0287]
肿瘤抑制率结果如图3a、3b和表17所示，在接种后第35天，与isotype igg1组对比，l1-r2-4-71抗体在5mg/kg单剂量给药下肿瘤抑制率约为70.89％，肿瘤重量降低约61.81％；本发明抗体在给药一周后即显示出显著的抗肿瘤作用，到第35天时，本发明抗体组(g2组)有2只小鼠肿瘤完全消退。如图3c所示，小鼠的体重之间无显著性差异。
[0288]
表16试验设计表
[0289]
组别给药组剂量(mg/kg)途径给药频率/周数g1isotype igg15腹腔注射biw
×
5g2l1-r2-4-715腹腔注射biw
×5[0290]
表17第35天肿瘤抑制率
[0291]
组别给药组肿瘤体积(mm3)肿瘤抑制率(tgi％)g1isotype igg11803.59n/ag2l1-r2-4-71592.4070.89％
[0292]
实施例6酵母以scfv形式展示抗pd-l1抗体
[0293]
合成编码scfv片段(包括重链可变区、轻链可变区以及重轻链可变区的连接子(g4s)3)的核酸序列，通过限制位点内切酶插入至pyd1载体(addgene)中，并通过电转仪转进
宿主酿酒酵母(如invitrogen，eby100)中获得阳性酵母克隆。将以上获得的阳性酵母克隆挑出，进行单克隆培养。其中，ate阳性酵母克隆表面表达的scfv中重链可变区、轻链可变区与atezolizumab是一致的，其他阳性酵母克隆表面表达的scfv见表18。连接子的氨基酸序列为ggggsggggsggggs(seq id no:106)，其核酸序列为ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg(seq id no:107)。以cp11-46为例，其vh和vl的核酸序列如表13所示。以cp11-71为例，其vh和vl的核酸序列如表13所示。表18阳性酵母克隆展示的scfv(scfv的n-端为vh)
[0294][0295][0296]
实施例7酵母展示的抗pd-l1 scfv与抗原结合力
[0297]
采用流式细胞仪检测酵母展示的抗pd-l1 scfv与抗原蛋白pd-l1-his-biotin的结合力。将上述酵母分别与1nm的pd-l1-his-biotin抗原蛋白在室温孵育1h，再用ph7.4的pbs洗涤3次，然后再与streptavidin-pe荧光二抗在室温孵育30min，再用ph7.4的pbs洗涤3次后，加入新的pbs，准备上机检测。
[0298]
pd-l1-his-biotin制备：将纯化得到的pd-l1-his抗原蛋白，按照每1mg蛋白加入26.6μl 10nm dmso配置的biotin(sigma-aldrich，b4501-1g)，室温孵育2h后，用ph7.4的pbs进行透析。
[0299]
如图4所示，本发明抗pd-l1 scfv(cp11-36、cp11-46、cp11-71、cp14-16和cp14-80)与pd-l1-his-biotin抗原蛋白的结合力明显优于阳性对照ate scfv；与阳性对照ate scfv相比，本发明抗pd-l1 scfv(cp-11-47、cp-11-55、cp21-8、cp21-47和cp22-34)与pd-l1-his-biotin抗原蛋白的结合力的基本相同。