一种油茶叶肉原生质体分离与纯化方法

1.本发明属于植物生物技术领域，涉及原生质体的分离与纯化，更具体的涉及一种油茶叶肉原生质体分离与纯化方法。


背景技术：

2.油茶广泛分布于我国南方多省，是我国重要的木本油料树种，无论种植面积还是产量均居木本食用油料首位。在维护我国粮油安全、精准扶贫和美丽乡村建设中发挥了重要作用。茶油中油酸和亚油酸含量达80％以上，风味独特，营养丰富，耐贮藏，易被人体吸收，是优质食用油之一，故被誉为“东方橄榄油”。茶油的价值不仅体现在食用方面，还体现在医疗、保健和美容，具有消炎、降血脂、软化血管、抗氧化以及抗癌等多种功能。
3.目前油茶品种繁多，但高产、抗逆性强的品种仍然十分有限。由于油茶童期长且基因高度杂合，常规育种如选择育种与杂交育种效率低，亟需更加高效的育种途径，加快油茶育种进程。由于原生质体具有全能性，通过酶解法得到的原生质体进行培养，有获得再生植株的潜能。原生质体融合(体细胞杂交)技术也在不断发展，通过原生质体融合再生的杂交植株，有助于突破有性杂交障碍，进行远缘杂交实现胞质基因组的重组交换，染色体加倍，获得异源多倍体。因此，开展油茶原生质体分离和细胞融合研究，在油茶的品种改良上具有广阔的应用前景。
4.在木本植物中，原生质体分离技术起步比较晚，柑橘原生质体分离体系最先建立。目前，体细胞融合技术，在柑橘上已获得几百个体细胞杂种，有些已应用于新品种选育、三倍体育种、砧木选育等方面；在杨树、苹果、枣、杉木等木本植物上也取得了不错进展。
5.油茶原生质体分离技术也已有报道，专利申请cn111705033a“一种油茶愈伤悬浮培养及原生质体分离的方法”，公开了一种油茶愈伤组织悬浮培养及原生质体的制备和纯化方法，原生质体数量可达1.17
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fw，为了后期进行不同源原生质体融合和培养的研究，需要建立悬浮系之外的原生质体分离体系。机械法进行油茶叶肉原生质体的制备已有报道，通过机械法制备的原生质体不会受酶等化学试剂的伤害，所需费用低，原生质体产量达到5.1
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fw，相对较低。相比机械法而言，酶解法操作简单，获得的原生质体产量多，目前植物原生质体分离、细胞融合等研究大多数均采用酶解法制备原生质体。而采用酶解法制备油茶叶肉原生质体的研究目前尚未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，包括以下步骤：
9.(1)对油茶组培苗进行22～32h黑暗预处理，采集油茶组培苗完全展开的叶片。该步骤中，油茶组培苗黑暗预处理的时间优选为24h。
10.(2)去掉步骤(1)采集的叶片的主脉和叶缘，切成叶条加入到含eme培养基的无菌瓶中，盖上封瓶膜，负压下抽真空10min～1h。然后吸出eme培养基、加入酶液。无菌瓶用封口膜封口后酶解6～14h。
11.所述的酶液与eme培养基的ph调为5.5～6.0；其中，酶液：10～15g/l纤维素酶r
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10(yakult，japan)、5～10g/l离析酶r
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10(yakult，japan)、2.5～5g/l蜗牛酶(上海如吉生物科技)、0.6g/l mes(2
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(n
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吗啉)乙磺酸一水合物)、1.8g/l二水合氯化钙、0.055g/l二水合磷酸二氢钠、27.325～54.62/l甘露醇(摩尔浓度0.15～0.3m)，51.345～102.69g/l蔗糖(摩尔浓度0.15～0.3m)，1/2ms培养基(所有元素减半)，250mg/l me，0.22μm过滤灭菌，现用现配；eme培养基：ms培养基+500mg/l me(麦芽提取物)+102.69～205.38g/l蔗糖(摩尔浓度0.3～0.6m)，高温高压灭菌。
12.该步骤中，负压下抽真空的时间优选为20min；酶液中纤维素酶r
‑
10、离析酶r
‑
10、蜗牛酶的浓度分别优选为15g/l、5g/l、2.5g/l；酶液中甘露醇的浓度优选为36.43g/l(摩尔浓度0.2m)、蔗糖的浓度优选为68.46g/l(摩尔浓度0.2m)，eme培养基中蔗糖的浓度优选为136.92g/l(摩尔浓度0.4m)；酶解优选在26～30℃的黑暗条件下进行，酶解的时间优选为10h。
13.(3)将步骤(2)酶解后的溶液通过无菌筛过滤，除去未酶解的叶片以及破裂细胞等杂质。滤液离心后去上清，用w缓冲液对原生质体进行清洗和重悬，冰上静置待原生质体沉淀后，吸去上清，得到纯净的原生质体，原生质体用mmg缓冲液保存。其中，w缓冲溶液组成：2mmol/l mes、125mmol/l cacl2、5mmol/l kcl、154mmol/l nacl、5mmol/l葡萄糖，用1mol/l的hcl和koh调ph为5.6～6.0；mmg缓冲液组成：4mmol/l mes、0.4mol/l甘露醇、15mmol/l mgcl2，用1mol/l的hcl和koh调ph为5.6～6.0，高温高压灭菌。
14.该步骤中，无菌筛的孔径优选为200目；离心的条件优选为100～400r/min离心2～6min；冰上静置的时间优选为10～20min。
15.进一步地，所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，包括以下步骤：
16.(1)对油茶组培苗进行22～32h黑暗预处理，采集油茶组培苗完全展开的第一片叶片。
17.(2)去掉步骤(1)采集的叶片的主脉和叶缘，切成0.5～1mm宽的叶条，迅速放入含10ml eme培养基的无菌小瓶中，盖上封瓶膜，负0.07mpa条件下抽真空10min～1h。然后吸出eme培养基，加入10ml的酶液。无菌小瓶用封口膜封口后在30～50rpm、26～30℃的黑暗条件下酶解6～14h。
18.该步骤中，负0.07mpa条件下抽真空的时间优选为20min；酶液中纤维素酶r
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10、离析酶r
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10、蜗牛酶的浓度分别优选为15g/l、5g/l、2.5g/l；酶液中甘露醇的浓度优选为36.43g/l(摩尔浓度0.2m)、蔗糖的浓度优选为68.46g/l(摩尔浓度0.2m)，eme培养基中蔗糖的浓度优选为136.92g/l(摩尔浓度0.4m)；酶解优选在26～30℃的黑暗条件下进行，酶解的时间优选为10h。
19.(3)将步骤(2)酶解后的溶液通过200目无菌筛过滤，除去未酶解的叶片以及破裂细胞等杂质，收集滤液于离心管。滤液于200～400r/min离心3～6min，去除上清液，轻柔地加入4ml w缓冲液悬浮原生质体，100～300r/min离心2～4min，收集滤液，重复清洗一次，弃掉上清液，加入1ml w缓冲液，冰上静止10～20min，吸去上清，加入等体积mmg缓冲液后得到
纯净的原生质体。
20.如无特别说明，本发明中所用溶液的溶剂均为水。
21.与现有技术相比，本发明的方法具备以下有益效果：
22.(1)本发明利用油茶组培苗的叶片制备原生质体，不需对材料消毒而且材料获取相对容易。
23.(2)本发明对油茶组培苗进行黑暗条件萎蔫处理，有利于提高原生质体的产量，抽真空预处理可以提高原生质体的分离效率。
24.(3)本发明针对油茶叶片的特性建立了相应的酶解体系和处理方法，获得的原生质体形态完整、稳定，产量高，数量可达2.8
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fw，原生质体活力高达91.7％以上。
25.(4)本发明分离方法简单且常年可行，纯化方法简单、易于操作且可减少细胞碎片等杂质，获得了较高纯度的原生质体。
26.(5)本发明对木本植物分离原生质体具有一定的借鉴意义。为利用原生质体进行蛋白亚细胞定位、基因瞬时表达等研究奠定了基础。通过对此方法分离的原生质体进行培养及植株再生，可进一步为原生质体融合获得新品种提供育种材料。
附图说明
27.图1：油茶组培苗的培养。a：油茶茎段初代培养；b：茎段腋芽萌发；c：油茶种子初代培养；d：种胚萌发；e：芽苗增殖培养；f：壮苗伸长培养。
28.图2：油茶组培苗叶片的选择与处理。a：油茶组培苗；b：切割后的叶片。
29.图3：不同渗透压下酶解对原生质体产量和形态的影响。a：0.3m渗透压下原生质体分离效果；b：0.4m渗透压下原生质体分离效果；c：0.5m渗透压下原生质体分离效果；d：0.6m渗透压下原生质体分离效果。
30.图4：原生质体的纯化与活力测定。a：纯化后富集的原生质体；b：纯化后的原生质体；c：发绿色荧光的有活力的原生质体。
具体实施方式
31.下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
32.实施例1
33.(1)油茶组培苗培育：
34.①
带芽茎段接种培育组培苗：3～5月间的晴朗上午采集油茶当年生半木质化5～7cm长的茎段，去掉叶片后先用自来水冲洗20min后沥干。在超净工作台中，用无菌水清洗2次，再用75％酒精消毒30s，无菌水洗涤4～5次，接着用0.1％的hgcl2溶液消毒15min，最后用无菌水洗涤4～5次后，滤纸吸干茎段表面的水分，用无菌刀片切成2～3cm长的单芽茎段，接种到诱导培养基中进行诱导(见图1
‑
a)。在温度28℃、黑暗条件下培养5d后转入光照条件下培养，经过20～25d，茎段腋芽萌发新芽(见图1
‑
b)，得到组培苗。所述的诱导培养基为含有30g/l蔗糖、7g/l琼脂、2.0mg/l 6
‑
ba(6
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苄氨基嘌呤)、0.1mg/l iaa(吲哚乙酸)的ms培养
基，用hcl和naoh调ph至5.8。
35.②
种子无菌播种培育组培苗：10～11月间的晴朗的天气下，采集优良油茶树上的饱满果实，室内通风干燥两周左右，果实裂开后拾取种子，种子放在4℃冰箱两周后备用。去掉种皮，种仁放入广口瓶，用自来水冲洗干净，浸泡6～8h，每隔一段时间冲洗换水。在超净工作台中，用无菌水清洗2次，再用75％酒精消毒30s，无菌水洗涤4～5次，接着用0.1％的hgcl2溶液消毒15min，最后用无菌水洗涤4～5次后，滤纸吸种子表面的水分，用无菌刀片切除种胚周围的种皮，接种到诱导培养基上(见图1
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c)，在温度28℃、黑暗条件下培养5d后，转入光照条件下培养5～10d，种胚开始萌发出芽(见图1
‑
d)，得到组培苗。所述的诱导培养基为含有30g/l蔗糖、8g/l琼脂的1/2ms培养基，用hcl和naoh调ph至5.8。
36.(2)将步骤(1)诱导得到的组培苗接种到继代培养基上进行继代增殖培养，继代周期为30～35d，继代1～2次后得到大量芽苗丛(见图1
‑
e)，光照培养条件为16小时光照/8小时黑暗，温度28℃。其中，继代培养基为含有30g/l蔗糖、8g/l琼脂、3mg/l 6
‑
ba(6
‑
苄氨基嘌呤)、0.05mg/l iba(吲哚丁酸)、6mg/l ga3(赤霉素)的wpm培养基，用1mol/l的hcl和naoh调ph至5.8。
37.(3)将步骤(2)得到的芽苗接种到继代培养基上进行壮苗伸长培养，继代周期为30～35d，继代1～2次后得到大量的组培苗(见图1
‑
f)，光照培养条件为16小时光照/8小时黑暗，温度28℃。其中，继代培养基为含有30g/l蔗糖、8g/l琼脂、0.05mg/l iaa(吲哚乙酸)、6mg/l ga3(赤霉素)的wpm培养基，用1mol/l的hcl和naoh调ph至5.8。
38.(4)油茶叶肉原生质体分离：对步骤(3)得到的油茶组培苗(图2
‑
a)进行22～32h黑暗预处理后，在超净工作台上，采集油茶组培苗完全展开的第一片叶片0.5g。用无菌锋利的刀片切去主脉和叶缘，切成0.5～1mm宽的叶条，将切好的叶条迅速放入含10ml eme培养基的无菌小瓶中(图2
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b)。盖上封瓶膜，置于真空泵(斯曼峰yx932d)中，负0.07mpa条件下抽真空处理10～60min，然后吸出eme培养基，加入10ml酶液。无菌小瓶用parafilm膜封口后置于控温摇床上并在50rpm、28℃的黑暗条件下，酶解2～16h。所述的酶液与eme培养基的ph调为5.8。其中，酶液：10～20g/l纤维素酶r
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10(yakult，japan)、5～10g/l离析酶r
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10(yakult，japan)、2.5～5g/l蜗牛酶(上海如吉生物科技)、0.6g/l mes(2
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(n
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吗啉)乙磺酸一水合物)、1.8g/l二水合氯化钙、0.055g/l二水合磷酸二氢钠、27.325～54.62/l甘露醇(摩尔浓度0.15～0.3m)、51.345～102.69g/l蔗糖(摩尔浓度0.15～0.3m)，1/2ms培养基(所有元素减半)、250mg/l me，0.22μm过滤灭菌，现用现配；eme培养基：ms培养基+500mg/l me(麦芽提取物)+102.69～205.38g/l蔗糖(摩尔浓度0.3～0.6m)，高温高压灭菌。
39.(5)叶肉原生质体纯化：在超净工作台上，将步骤(4)中酶解完成的溶液通过200目的无菌钢筛过滤，除去未酶解的叶片以及破裂细胞等杂质，收集滤液于无菌离心管。滤液于室温下300r/min离心4min，去除上清液，然后轻柔地加入4ml w缓冲液重悬原生质体，150r/min离心3min，收集滤液，重复清洗一次，弃掉上清液，加入1ml w缓冲液，冰上静止15min以上沉淀原生质体，吸去上清，加入等体积mmg缓冲液后得到纯净的原生质体。其中，w缓冲溶液组成：2mmol/l mes、125mmol/l cacl2、5mmol/l kcl、154mmol/l nacl、5mmol/l葡萄糖，用1mol/l的hcl和koh调ph为5.8；mmg缓冲液组成：4mmol/l mes、0.4mol/l甘露醇、15mmol/l mgcl2，用1mol/l的hcl和koh调ph为5.8，高温高压灭菌。
40.将纯化的原生质体用eme培养基重新悬浮，用胶头滴管轻柔地吸打均匀，吸取滴在
血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平均值。根据加入酶溶液中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体产量。
41.将纯化的原生质体用eme培养基重新悬浮，用胶头滴管轻柔地吸打均匀，fda(双醋酸乙酸酯)染色法统计原生质体活力。将5mg双醋酸乙酸酯溶于1ml二甲基亚砜作为双醋酸乙酸酯母液(0℃保存)，然后向1ml悬浮的原生质体中加25μl双醋酸乙酸酯母液，避光室温反应3min后，取少量溶液置于载玻片用荧光显微镜观察，发绿色荧光的为有活力原生质体，原生质体活力以一个视野中有活力的原生质体占该视野中原生质体总数的百分数来表示，选取10个有代表性的视野进行统计。
42.实施例2
43.按照实施例1中的方法，针对步骤(4)中的油茶组培苗黑暗预处理时间，分别设置了0h、12h、24h、30h、36h和40h共6个处理。在超净工作台上剪取展开的第1片叶，用无菌刀片切割后，在负0.07mpa真空预处理20min(eme培养基中蔗糖浓度0.4m)，然后在渗透压为0.4m(甘露醇、蔗糖的摩尔浓度分别为0.2m、0.2m)的酶液(1.5％纤维素酶r
‑
10、0.5％离析酶r
‑
10和0.25％蜗牛酶)中酶解10h，统计原生质体产量和活力。结果表明：黑暗预处理24h时，叶肉原生质体产量和活力最高(见表1)。
44.表1黑暗预处理对油茶叶肉原生质体分离的影响
[0045][0046][0047]
实施例3
[0048]
按照实施例1中的方法，将油茶组培苗在黑暗条件下预处理24h，在超净工作台上剪取展开的第1片叶，用无菌刀片切割。针对步骤(4)中的油茶叶条的真空预处理时间，分别设置负0.07mpa条件下抽真空处理0min、10min、20min、30min、60min共5个处理(eme培养基中蔗糖浓度0.4m)，然后在渗透压为0.4m(甘露醇、蔗糖的摩尔浓度分别为0.2m、0.2m)的酶液(1.5％纤维素酶r
‑
10、0.5％离析酶r
‑
10和0.25％蜗牛酶)中酶解10h，统计各处理下原生质体产量和活力，确定最佳真空预处理时间。结果表明，负0.07mpa条件下抽真空处理20min，原生质体酶解效果最好(见表2)。
[0049]
表2负0.07mpa不同真空预处理时间对原生质体产量和活力的影响
[0050][0051]
实施例4
[0052]
按照实施例1中的方法，油茶组培苗黑暗预处理24h，负0.07mpa真空预处理20min(eme培养基中蔗糖浓度0.4m)，针对步骤(4)中的酶液、eme培养基的渗透压(即酶液中甘露醇浓度+蔗糖浓度(甘露醇、蔗糖两者等摩尔浓度)、eme培养基中蔗糖浓度)，分别设置0.3m、0.4m、0.5m、0.6m共4个处理，在1.5％纤维素酶r
‑
10+0.5％离析酶r
‑
10+0.25％蜗牛酶的酶液组合下，酶解10h，观察各处理的酶解情况(见图3)，其中0.3m渗透压下，原生质体产量较高，原生质体边缘清晰、形态较好(见图3
‑
a)；0.4m渗透压下，原生质体产量极高，原生质体边缘清晰、形态完整稳定，叶绿体较多(见图3
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b)；0.5m渗透压下，原生质体产量一般，原生质体边缘清晰、部分原生质体形态发生变形，碎片多(见图3
‑
c)；0.6m渗透压下，原生质体产量极低，原生质体边缘变形严重(见图3
‑
d)，故选择0.4m渗透压(见图3
‑
b)。
[0053]
实施例5
[0054]
按照实施例1中的方法，在油茶组培苗黑暗预处理24h，负0.07mpa真空预处理20min(eme培养基中蔗糖浓度0.4m)的条件下，针对步骤(4)中的酶解时间，设置2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h共8个处理，在渗透压0.4m(甘露醇、蔗糖的摩尔浓度分别为0.2m、0.2m)、1.5％纤维素酶r
‑
10+0.5％离析酶r
‑
10+0.25％蜗牛酶的酶液中酶解分离原生质体，测定各处理下原生质体的产量和活力，确定最适的酶解时间。结果表明，酶解10h效果最好(见表3)。
[0055]
表3不同酶解时间对原生质体产量和活力的影响
[0056][0057]
实施例6
[0058]
按照实施例1中的方法，在油茶组培苗黑暗预处理24h，负0.07mpa真空预处理20min(eme培养基中蔗糖浓度0.4m)的条件下，针对步骤(4)中的酶液中酶浓度组合，设置9个处理(见表4)，在渗透压为0.4m(甘露醇、蔗糖的摩尔浓度分别为0.2m、0.2m)条件下酶解10h，测定各处理下原生质体的产量和活力(见表4)，确定最适的酶浓度组合为1.5％纤维素酶r
‑
10+0.5％离析酶r
‑
10+0.25％蜗牛酶。
[0059]
表4不同酶浓度组合对原生质体产量和活力的影响
[0060][0061]
通过上述实施例结果可知，按照实施例1中的方法，当步骤(4)油茶叶肉原生质体
分离的条件为如下情况时：油茶组培苗黑暗预处理24h，负0.07mpa真空预处理20min，渗透压0.4m(即酶液中甘露醇浓度+蔗糖浓度为0.4m(甘露醇、蔗糖的摩尔浓度分别为0.2m、0.2m)、eme培养基中蔗糖浓度0.4m)，酶液组合为1.5％纤维素酶r
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10+0.5％离析酶r
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10+0.25％蜗牛酶，酶解10h时每克叶片的原生质体产量为2.8
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107个/g
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fw，原生质体活力达91.7％(见图4
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b、c)。