一种检测甘蔗基因表达量的引物组、制备方法及检测方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测甘蔗基因表达量的引物组、制备方法及检测方法。


背景技术：

2.谷氨酰胺合成酶(gs，e.c.6.3.1.2)是高等植物氮同化的关键酶，也是将无机氮转化为有机氮的第一个酶。无机氮(no3‑
、nh
4+
)进入甘蔗后,以gs催化与谷氨酸结合形成谷氨酰胺(gln)，然后进一步在gogat的催化下，将gln转移到α
‑
酮戊二酸上生成谷氨酸。gs同工酶分3类，分别是gsⅰ、gsⅱ、gsⅲ，甘蔗中主要是gsⅱ，是一个大小在320
‑
380kda之间八聚体酶，由8个亚基组成，每个亚基分子量为38
‑
45kda。根据分布及亚细胞定位，分为胞质型gs1和质体型gs2。
3.甘蔗是我国也是世界上重要的糖料及能源作物，氮素是甘蔗的三大营养元素之首，对甘蔗的生长、糖分累积有重要的作用。但目前我国甘蔗产业存在氮肥依赖过重的问题，影响了甘蔗产量和糖分的提升。氮肥施用过量不仅限制甘蔗生长，降低产糖量，同时引起氮素流失严重，引发严重的土壤、水体硝酸盐污染，破坏生态环境。gs基因作为甘蔗氮同化反应过程中第一个关键酶，对甘蔗氮吸收、同化、利用有着极其重要的作用，文献表明gs酶的活性及表达量大小可以作为甘蔗氮利用效率的指标(nicole et al,2007；yangyiyi et al,2019)。目前对甘蔗gs基因表达以及对甘蔗氮利用的响应机制了解还不充分，需要进一步的深化对其表达、调控网络等开展相应的研究。gs1.2主要参与根中初级nh
4+
的同化，叶片衰老期氮的再活化，以及协助gs2的初级n同化，nh
4+
是甘蔗吸收的主要无机氮形态，对研究甘蔗对nh
4+
的识别、吸收、运转有重要意义。而这些工作的前提需要构建适合、能够准确检测gs1.2基因在甘蔗各组织表达量的引物组，以便研究其表达模式和了解甘蔗响应nh
4+
吸收、利用的分子机制。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种检测甘蔗基因表达量的引物组、制备方法及检测方法，解决背景技术中提到的技术问题。本发明检测的是甘蔗sc gs1.2基因表达量的引物组。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.一种检测甘蔗基因表达量的引物组，
7.包括一对特异性引物，所述引物对为scgs1.2_f和scgs1.2_r，特征序列为：
[0008][0009]
f:aacaggtatggtattgagcaggagt
[0010]
r:ggcggcgcagtagtaagga。
[0011]
一种检测甘蔗基因表达量的引物组制备方法，所述制备方法如下：
[0012]
搜索gs1.2基因序列，找到玉米、大麦和小麦公布的gs1.2基因序列，根据玉米、大麦和小麦的gs1.2基因序列进行blast比对，找出保守区序列，设计了若干对引物，选择分数
排前的10对引物，在甘蔗根、叶、茎中进行表达量检测，根据溶解曲线为单峰，且根、茎、叶中表达并且表达量达到20以上的原则进行挑选，最后获得引物组。
[0013]
进一步地，保守区序列为：
[0014]
‑
gaagatagtaggttccagactgagcaataagagaggaagaaccatac
‑‑‑
tgaattactgatcatgttgattctatgcatttgcgca
‑
gggaccatactactgcgccgccggtgccgacaaggcgttcgggcgtgacatcgtggacgcccactacaaggcgtgcctctacgccgggatcaacatcagcggcatcaacggggaggtcatgcccggccaggtactagagtctagagatgatcgatcctcctcctgcaacaagttgtataaaaactctctctgaacctgattctctgtccccttggtgacagtgggagttccaagttgggccgtccgtcg
‑‑‑‑‑‑
ggatcgccgccaccgcgcagatgtcgtccaccttcatcgagcaaggcgagaccatggacaaccgcgtggggccgttcaccgtgccgccggcgtccctctccaccttcgacgtcatcagc
‑‑‑‑‑‑
gtcatgtactgtagtattattcgcacctcgtatcgcaactgcgtgaatctggttagatgctgaactgatttattggattggttgatcggttgatcctcagaggatcacagaggttgccggggtggtgctgtccctggacccgaagccgatcccgggtgactggaacggcgcgggcgcgcacaccaactacagcaccaagtccatgaggcaggccggcggctacgaggtgatcaagaaggccatcgagaagcttggcaagcgccacatgcagcacatcgccgcctacggcgagg
‑‑‑
gcaacgagcgccgcctcaccggccaccacgagaccgccgacatcaacaccttcaaatgggtacgtgctgcgacatctgttgtactactgtgttgcctgtcgtgtctgactcttacctgacgatgatgaatcgatgatgatgatgcatttagggcgtggcggaccgcggcgcgtccatccgcgtggggcgcgacacggagaaggacggcaagggctacttcgaggaccgcaggc
‑
cggc
‑‑‑
ctccaacatggacccctacgtcgtcacctccatgatcgccgagaccacgcttctcctctgagcacacg。
[0015]
进一步地，分数排前的10对引物分别为：
[0016]
第1对为：
[0017]
f:gttgcctgtcgtgtctgactctt
[0018]
r:ttgccgtccttctccgtgt；
[0019]
第2对为：
[0020]
r:tgcctgtcgtgtctgactcttacc
[0021]
r:ttgccgtccttctccgtgt；
[0022]
第3对为：
[0023]
f:gaccgccgacatcaacacc
[0024]
r:ttgccgtccttctccgtgt；
[0025]
第4对为：
[0026]
f:gaccgccgacatcaacacc
[0027]
r:gtagcccttgccgtccttct；
[0028]
第5对为：
[0029]
f:gttgcctgtcgtgtctgactctt
[0030]
r:gtagcccttgccgtccttct；
[0031]
第6对为：
[0032]
f:caaacaggtatggtattgagcaggag
[0033]
r:ggcggcgcagtagtaagga；
[0034]
第7对为：
[0035]
f:acggcgggtacgaggtgat
to 6μl、total volume6μl；
[0060]
混匀，离心后，65℃孵育5min，立即放冰上5min，加入试剂，试剂包括5x reaction buffer2μl、10mm dntp mix1μl、20u/μl ribolock rnase inhibitior0.5μl、200u/μl revertaid m
‑
mulv rt 0.5μl、total volume10μl；
[0061]
然后混匀，离心后，42℃保持60min，70℃保持5min。
[0062]
进一步地，qpcr检测中的反应体系如下，2x sybr green pcr master mix5μl、qn rox reference dye0.05μl、primer a0.7μl、primer b0.7μl、rnase
‑
free water2.55μl、template gdna or cdna1μl、total reaction volume10μl。
[0063]
进一步地，qpcr检测中的程序如下，pcr initial heat activation95℃中2min循环一次，denaturationcombined annealing/extension95℃中5s和60℃30s，循环40次。
[0064]
本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：
[0065]
本发明引物和检测方法对甘蔗scgs1.2基因表达量进行重复性检测，其重复性好，准确性高、灵敏度好，检测时间短，成本低，引物特异性好。
附图说明
[0066]
图1是本发明scgs1.2基因扩增溶解图；
[0067]
图2是本发明sc gs1.2基因扩增曲线图；
[0068]
图3是本发明内参基因gapdh扩增曲线图；
[0069]
图4是本发明内参基因gapdh基因扩增溶解图；
[0070]
图5是本发明sc gs1.2在高氮效率品种中表达量图；
[0071]
图6是本发明sc gs1.2在低氮效率品种中表达量图。
具体实施方式
[0072]
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
[0073]
如图1
‑
6所示，一种检测甘蔗基因表达量的引物组，所述引物组特征序
[0074]
列为：
[0075]
f:aacaggtatggtattgagcaggagt
[0076]
r:ggcggcgcagtagtaagga。
[0077]
一种检测甘蔗基因表达量的引物组制备方法，方法如下：
[0078]
从ncbi网站搜索gs1.2基因序列，找到与甘蔗近缘种属玉米、大麦、小麦公布的gs1.2基因序列，使用primer5软件，根据以这几个物种的gs1.2基因序列进行blast比对，找出gs1.2基因保守区序列，如下：
[0079]
‑‑‑‑‑‑‑
gaagatagtaggttccagactgagcaataagagaggaagaaccatac
‑‑‑
tgaattactgatcatgttgattctatgcatttgcgca
‑
gggaccatactactgcgccgccggtgccgacaaggcgttcgggcgtgacatcgtggacgcccactacaaggcgtgcctctacgccgggatcaacatcagcggcatcaacggggaggtcatgcccggccaggtactagagtctagagatgatcgatcctcctcctgcaacaagttgtataaaaactctctctgaacctgatt
ctctgtccccttggtgacagtgggagttccaagttgggccgtccgtcg
‑‑‑‑‑‑
ggatcgccgccaccgcgcagatgtcgtccaccttcatcgagcaaggcgagaccatggacaaccgcgtggggccgttcaccgtgccgccggcgtccctctccaccttcgacgtcatcagc
‑‑‑‑‑‑
gtcatgtactgtagtattattcgcacctcgtatcgcaactgcgtgaatctggttagatgctgaactgatttattggattggttgatcggttgatcctcagaggatcacagaggttgccggggtgg
[0080]
tgctgtccctggacccgaagccgatcccgggtgactggaacggcgcgggcgcgcacaccaactacagcaccaagtccatgaggcaggccggcggctacgaggtgatcaagaaggccatcgagaagcttggcaagcgccacatgcagcacatcgccgcctacggcgagg
‑‑‑
gcaacgagcgccgcctcaccggccaccacgagaccgccgacatcaacaccttcaaatgggtacgtgctgcgacatctgttgtactactgtgttgcctgtcgtgtctgactcttacctgacgatgatgaatcgatgatgatgatgcatttagggcgtggcggaccgcggcgcgtccatccgcgtggggcgcgacacggagaaggacggcaagggctacttcgaggaccgcaggc
‑
cggc
‑‑‑
ctccaacatggacccctacgtcgtcacctccatgatcgccgagaccacgcttctcctctgagcacacg
[0081]
根据primer5软件共设计了100对引物，选择分数排前的10对引物，在甘蔗根、叶、茎中进行表达量检测，根据溶解曲线为单峰，且均可以根、茎、叶中表达并且表达量达到20以上的原则进行挑选，最后获得权利要求1所述的特异性引物。
[0082]
表1引物信息表
[0083]
[0084][0085]
一、甘蔗scgs1.2基因检测方法
[0086]
1、样品来源
[0087]
甘蔗经低氮胁迫(0.1mm)和高氮(10mm)处理后的根、茎、叶样品。
[0088]
2、检测步骤流程
[0089]
使用trizol提取液对甘蔗总rna进行提取，mrna逆转录反应，最后进行qpcr检测。
[0090]
二、逆转录
[0091]
1、mrna逆转录
[0092]
(1)在冰上将下列体系配制好，如图表2所示，
[0093]
表2 mrna逆转录体系
[0094][0095]
(2)混匀，离心后，70℃孵育5min，立即放冰上5min。
[0096]
(3)加入下列试剂如图表3所示，
[0097]
表3 mrna逆转录试剂
[0098][0099]
(4)混匀，离心后，42℃ 60min，70℃ 10min。
[0100]
2、qpcr检测
[0101]
反应体系如表4所示：
[0102]
表4 qpcr检测的反应体系
[0103][0104]
程序如下表5所示：
[0105]
表5 qpcr检测程序
[0106]
[0107][0108]
如图1所示，使用筛选的特异引物对甘蔗36个样品的scgs1.2基因进行扩增后，从融解曲线看，所有样品的基本上在80
‑
90之间有一个明显单峰，前后无杂峰，说明扩增的产物基本上都是目标基因scgs1.2的产物，所筛选的引物适合作为检测甘蔗scgs1.2基因。
[0109]
如图2所示，从扩增曲线看，所有样品的的扩增曲线光光滑，呈s型，有明显的调整期，对数期，稳定基和衰亡期，与内参基因的扩增效率基本一致，表明该特异引物适合作为检测甘蔗scgs1.2基因。
[0110]
图5和图6是使用该引的，检测了甘蔗经低氮胁迫(0.1mm)和高氮(10mm)处理后的根、茎、叶样品，结果表明，不同氮处理后，甘蔗不同组织、器官均可以检测到甘蔗scgs1.2基因，且对不同氮处理的响应存在差异，说明筛选获得的特异引物可以用于研究甘蔗scgs1.2基因表达差异分析的研究。
[0111]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。